用于制造大珠粒的改進(jìn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于制備瓊脂糖涂覆的、瓊脂糖珠粒的改進(jìn)方法，所述珠粒含有細(xì)胞。優(yōu)選地自動(dòng)化的方法涉及將制造的珠粒置于溫度梯度的礦物油樣品中，使得所述溫度隨著所述珠粒通過(guò)所述油移動(dòng)而下降。優(yōu)選地，在該方法中使用“喇叭形工具”和“秸稈形工具”。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于制造大珠粒的改進(jìn)方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2012年I月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/592，949的優(yōu)先權(quán)，將其全文并入作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及用于制備物質(zhì)組合物的改進(jìn)方法，所述物質(zhì)組合物包含包裹在可滲透的珠?；蚱渌Y(jié)構(gòu)中的細(xì)胞(特別是分泌細(xì)胞)，然后用瓊脂糖進(jìn)行涂覆。所述珠?？梢园傊腔蛴森傊墙M成。Litex瓊脂糖對(duì)于該珠粒尤為優(yōu)選。
[0004]發(fā)明背景
[0005]含有包裹在可滲透介質(zhì)中的活細(xì)胞的物質(zhì)組合物的制造已經(jīng)顯示出在多個(gè)領(lǐng)域中是重要的，如糖尿病治療、癌癥治療和干細(xì)胞維持。在這點(diǎn)上，參見(jiàn)，例如，Reissue40, 555 ;美國(guó)專(zhuān)利 N0.7，838，291 ;6，818，230 ;6，808，705 ;6，303，151 ;6，224，912 ；5，888，497 ;和5，643 ，569，以及公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)2007/0071732，將其全部并入作為參考。
[0006]用于制備這些物質(zhì)組合物(下文中稱(chēng)為“包膠物(encapsulate)”)的方法是基本上相同的，與所用的細(xì)胞類(lèi)型無(wú)關(guān)。分離或獲得目標(biāo)細(xì)胞后，將這些細(xì)胞懸浮于諸如瓊脂糖、膠原蛋白或其組合這樣的試劑的水溶液中，或置于諸如明膠海綿這樣的材料上。當(dāng)使用水溶液時(shí)，通過(guò)將所述懸浮液置于礦物油中，形成含有目標(biāo)細(xì)胞的半固體珠粒。如果使用明膠海綿，則將含有該細(xì)胞的產(chǎn)品滾成球形，此后將瓊脂糖倒在其上面，以形成珠粒。
[0007]然后使所述珠粒接觸在例如特富龍勺子中的瓊脂糖溶液。將所述珠粒在該混合物中滾動(dòng)，以形成在上文引用的現(xiàn)有技術(shù)中被稱(chēng)為瓊脂糖涂覆的大珠粒的物質(zhì)。
[0008]例如，由教導(dǎo)了包裹分泌細(xì)胞(如，胰島素生成胰島和癌細(xì)胞)的RE40，555和美國(guó)專(zhuān)利N0.5，888，497所示的最初教導(dǎo)后面已經(jīng)有了改進(jìn)，包括包裹干細(xì)胞，如美國(guó)專(zhuān)利N0.7，838，291所示的，并且通過(guò)所用材料的改進(jìn)，如例如公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)2007/0071732中所看到的；然而，對(duì)于改進(jìn)用于制備這些有用材料的方法存在著日益需求。
[0009]這個(gè)領(lǐng)域非常需要的一個(gè)改進(jìn)是使人工方法自動(dòng)化的能力。
[0010]在使制造方法自動(dòng)化的過(guò)程中，本發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了專(zhuān)用工具，其有助于該制造方法。此外，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在通過(guò)將大珠粒置于溫度梯度下的礦物油容器中來(lái)完成該方法中，可以生產(chǎn)具有比認(rèn)為可能的更均勻的形狀和平滑質(zhì)地的大珠粒。
[0011]將在以下的公開(kāi)內(nèi)容中看到這是怎樣完成的。
[0012]附圖簡(jiǎn)述
[0013]圖1顯示了將細(xì)胞和瓊脂糖自動(dòng)分配至含有礦物油的多孔陣列中。
[0014]圖2a_2c呈現(xiàn)了本發(fā)明的“喇叭形工具”的優(yōu)選實(shí)施方案的不同視圖。
[0015]圖3顯示了所述喇叭形工具的第二個(gè)實(shí)施方案。
[0016]圖4a和4b顯示了本發(fā)明的秸桿形工具的不同實(shí)施方案。
[0017]圖5描繪了本發(fā)明方法的概述。
[0018]圖6顯示了用于維持本發(fā)明操作中的溫度梯度的裝置。[0019]圖7描繪了來(lái)自用不同濃度和類(lèi)型的瓊脂糖制得的珠粒的胰島素生成水平。
[0020]優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
[0021]參考上文引用的美國(guó)專(zhuān)利，其全部描述了用于制備大珠粒的人工方法，所述大珠粒含有不同類(lèi)型的細(xì)胞，如本文中限定的分泌細(xì)胞。如下文中描述的，本文中描述的本發(fā)明通過(guò)用含有保持在溫度梯度下的礦物油的容器替代使瓊脂糖涂覆的瓊脂糖珠粒與勺子中或特富龍表面上的礦物油接觸的最后一個(gè)步驟改變了那些方法。
[0022]如這些專(zhuān)利中描述的大珠粒也可以通過(guò)機(jī)器人或經(jīng)由自動(dòng)化來(lái)制得。本文中描述了一種這樣的方法。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1中所描繪的，機(jī)器人分配器，如移液管陣列，將分泌細(xì)胞分配至多孔平板，如標(biāo)準(zhǔn)96孔平板中。然后將熔化的瓊脂糖加入孔中。然后經(jīng)由例如自動(dòng)化裝置(如，多移液管陣列)將所述細(xì)胞和熔化的瓊脂糖轉(zhuǎn)移至含有礦物油的裝置(如，單孔或多孔容器，如96孔平板)中，以形成珠粒。
[0024]然后從孔中取出珠粒，優(yōu)選通過(guò)使用圖“2a_c和3”中描繪的所謂的“喇叭形工具”。設(shè)計(jì)了如下文詳細(xì)闡述的喇叭形工具，使得不破壞珠粒的表面。
[0025]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在孔的底部提供了出口裝置，所述珠粒通過(guò)其離開(kāi)孔，并且可以用于隨后的步驟中。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，從上文討論的方法獲得的珠粒可以經(jīng)由自動(dòng)化裝置(如，可移動(dòng)的平臺(tái))轉(zhuǎn)移至礦物油的頂部，并且還經(jīng)由自動(dòng)化系統(tǒng)從含有礦物油的裝置中取出。
[0026]在通過(guò)喇叭形工具撿出或通過(guò)出口裝置，并且通過(guò)用合適的溶液(如，平衡鹽溶液)沖洗除去任何粘附的礦物油后，將珠粒置于含有新的、溫?zé)岬沫傊堑目字小＝又?，將珠粒和溫?zé)岘傊且黄鹑〕?，?yōu)選使用如圖4a和4b中所示的所謂的“秸桿形工具”，使用溫和的吸取，并且分配至受控溫度梯度下的含有礦物油的容器中。
[0027]含有礦物油的容器可以是，例如，試管、比色皿、燒杯，或合適的任何其他物體，盡管優(yōu)選各種大小的試管和比色皿。用于制備容器(即，試管、比色皿等)的材料可以不同。玻璃尤為優(yōu)選，盡管可以使用其他材料，如涂覆了提供親水層的物質(zhì)的那些。
[0028]可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)維持容器中的溫度梯度。關(guān)鍵在于容器頂部的礦物油的溫度高于其底部的。梯度的溫度和數(shù)量將根據(jù)例如容器的長(zhǎng)度、包裹的細(xì)胞的類(lèi)型、所用的瓊脂糖類(lèi)型等而改變。對(duì)于設(shè)定這些值重要的因素包括，例如，所包裹細(xì)胞是活的的溫度、所用的瓊脂糖將固化的溫度等等。梯度開(kāi)始的溫度優(yōu)選為20°C至80°C，更優(yōu)選20°C至50°C，并且甚至更優(yōu)選地，20°C至40°C。理想地，起始溫度為約20°C至約25°C。容器底部的溫度可以改變，例如變化范圍為O °C至-1 (TC，更優(yōu)選O °C至-8 °C，并且最優(yōu)選約O V至約-2°C。最高和最低溫度之間的總差異優(yōu)選為20°C至50°C，更優(yōu)選約20°C至約30°C。
[0029]作為本申請(qǐng)一部分的附圖將詳細(xì)論述前面的描述。
[0030]圖1顯示了怎樣將細(xì)胞和瓊脂糖兩者分配至平板的孔中。經(jīng)由例如洗滌或抽吸或經(jīng)由上文討論的出口裝置除去礦物油后，將上文提及的并且如圖2a_2c和3中所示的“喇叭形工具”插入孔中，以取出具有包裹的細(xì)胞的珠粒。這種喇叭形工具在一端具有連接的真空源，其沒(méi)有破壞珠粒的表面，使得有助于取出。
[0031]由一層瓊脂糖和細(xì)胞組成的珠粒經(jīng)由所謂的“喇叭形工具”沉積至新的孔中，所述新的孔中充滿(mǎn)加熱過(guò)的瓊脂糖，其作為第二層，或涂覆瓊脂糖。將珠粒和溫?zé)岬沫傊且黄鹑〕?，?yōu)選地通過(guò)使用“秸桿形工具”，如圖4a和4b中所示那些中的一種，優(yōu)選地借助溫和的抽吸來(lái)取出，并且將珠粒分配至含有溫度梯度礦物油的容器中?？梢酝ㄟ^(guò)例如圖5中所示的裝置來(lái)維持溫度梯度，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知其他選擇。當(dāng)大珠粒穿過(guò)容器并且到達(dá)底部時(shí)，可以使用延長(zhǎng)形式的喇叭形工具，使用抽吸，以取出大珠粒，用于在介質(zhì)中洗滌，或如上文所述的，可以使用用于取出珠粒的出口裝置。在這一點(diǎn)上，大珠粒準(zhǔn)備好待使用，盡管在不同的情況中，可能優(yōu)選允許細(xì)胞在珠粒內(nèi)增殖和/或成熟，直至存在足夠的數(shù)量或直至細(xì)胞表達(dá)特定的產(chǎn)物。這個(gè)時(shí)間段可以為例如一周至數(shù)月。
[0032]現(xiàn)在參照所要求的發(fā)明的附圖，圖2a、2b、2c和3顯示了根據(jù)本發(fā)明的所謂的“喇叭形工具”的設(shè)備的不同視圖。
[0033]參 照?qǐng)D2a，顯示了一種喇叭形工具40。將工具描述為“喇叭形工具”源自倒圓錐部分41類(lèi)似喇叭。在一端，提供了倒圓錐部分41，具有連接圓錐端41的輪緣42。圓錐端41連接中空的、縱向部分43，其適于流體，如空氣穿過(guò)其中。
[0034]如圖2a所示，中空的縱向部分43沿著整個(gè)設(shè)備延伸。可以看到環(huán)圈裝置44放置在沿著喇叭形工具長(zhǎng)度的相對(duì)于倒圓錐端的約2/3至3/4處。環(huán)圈裝置44，以及本文中描述的幾個(gè)結(jié)構(gòu)元件，是制造方法的人工制品，并且沒(méi)有影響裝置的功能。
[0035]然而，環(huán)圈裝置44，標(biāo)志著縱向裝置增大其圓周的點(diǎn)。45表示的設(shè)備的部分對(duì)應(yīng)于聯(lián)接端，其在操作中連接工具和流體源，例如，空氣，如真空。連接孔46具有裝置任何部分最寬的周長(zhǎng)，并且用于完成與例如真空裝置的連接。提供了內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如圖2c中呈現(xiàn)的那些，以促進(jìn)真空裝置的連接。這些結(jié)構(gòu)可以根據(jù)所使用的儀器而變化。
[0036]觀(guān)察到設(shè)備中的隆起裝置47以及一系列均勻間隔的突出物48a、b和C，與環(huán)圈裝置44 一樣，都是制造的人工制品；然而，這些突出物也用于幫助將相連的工具固定在正確的位置，例如，固定在分配支架中。
[0037]在圖2b和2c中，都可以看到設(shè)備的內(nèi)部，其中可以看到實(shí)際上設(shè)備沿著其長(zhǎng)度是中空的。圖2c中的倒圓錐區(qū)段的視圖更詳細(xì)地顯示了怎樣逐漸變細(xì)至圓周略小于設(shè)計(jì)來(lái)吸取的物質(zhì)(例如，珠粒)的點(diǎn)。
[0038]在操作中，設(shè)備40經(jīng)由連接端46連接于例如真空泵裝置，并且將其垂直地置于待取出的物質(zhì)，如珠粒上。真空泵裝置(未顯示)除去工具內(nèi)的任何空氣，并且允許吸入珠粒，例如，通過(guò)控制由真空形成的抽吸力來(lái)吸入，倒圓錐端41的構(gòu)造允許從一個(gè)位置取出珠粒，如半軟的瓊脂糖珠粒，并且移動(dòng)至另一個(gè)位置，如涂覆瓊脂糖的溶液。在該點(diǎn)上，通過(guò)例如給縱向裝置45提供空氣來(lái)改變真空壓力，其起到將珠粒從錐形端41排入瓊脂糖溶液中的作用，而沒(méi)有給珠粒的構(gòu)造帶來(lái)任何變化。
[0039]圖3顯示了圖2a_2c的設(shè)備的另一個(gè)實(shí)施方案。通過(guò)不同于圖2a_2c的實(shí)施方案的制造方法制備的這個(gè)設(shè)備呈現(xiàn)出沿著縱向部分43的隆起裝置。此外，將注意到環(huán)圈裝置以及隆起裝置47和48a-c中存在變化。然后，倒錐形端41及其輪緣，以及聯(lián)接端45和連接孔，以圖2a-2c的相當(dāng)結(jié)構(gòu)的相同方式來(lái)起作用。
[0040]圖4a和4b描繪了下文中稱(chēng)為“秸桿形工具”的設(shè)備?，F(xiàn)在參照?qǐng)D4a，顯示了秸桿形工具50。該工具呈現(xiàn)出沿著中空縱軸51、聯(lián)接端52和接收端53的基本上是圓柱形的幾何結(jié)構(gòu)。
[0041]秸桿形工具包括凹入的空間54，其沿著縱軸51延伸，在接收端53開(kāi)口。[0042]接收空間54沿著縱軸延伸，并且其連接管道部分55，其可以具有小于接收空間的直徑。該管道部分55連接連接裝置52，并且“52”、“54”和“55”的組合形成工作通道，其接受流體，如空氣或另一種氣體壓力的變化。在操作中，連接裝置52與能夠改變秸桿形工具中的流體壓力的設(shè)備，如空氣泵連在一起。然后將秸桿形工具置于目標(biāo)物，如珠粒上，并且在壓力改變時(shí)，通過(guò)秸桿形工具取出珠粒。應(yīng)當(dāng)注意到接收端53的開(kāi)口的直徑足夠大，使得能夠撿出目標(biāo)物，例如，珠粒，并且允許珠粒在工具的縱向空腔中垂直移動(dòng)。一旦珠粒被移動(dòng)至所需位置，第二次的壓力變化使珠粒掉下，并且允許重新使用秸桿形工具。
[0043]圖4a和4b在連接裝置52的構(gòu)造上是不同的；然而，構(gòu)造的差異是由制造方法形成的，并且沒(méi)有影響設(shè)備的運(yùn)行。
[0044]在每個(gè)設(shè)備中，虛線(xiàn)表示秸桿形工具適用于接收選擇的真空連接裝置。描繪了凹入的通道56，其能夠接納連接裝置，如可擴(kuò)展的O-環(huán)。此外，該設(shè)備的特征是裝置57，用于阻擋移液管的前進(jìn)。這種“移液管擱架”停止了移液管或其他遞送裝置通過(guò)流體，例如，空氣。
[0045]以下實(shí)施例應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本文中所述的本發(fā)明的示例，而不是限制。
[0046]實(shí)施例1
[0047]將粉末狀瓊脂糖(Litex HSB-LV)溶解于最小必需培養(yǎng)基中，至0.8%或4.5%(界/V)濃度，然后在121 °C下高壓滅菌20分鐘。這產(chǎn)生了粘性的熔化溶液。將瓊脂糖溶液冷卻，并且分別維持在51-53 °C或61-63°C。
[0048]將總共150，000RENCA(腎癌)細(xì)胞加入孔中，此后加入0.25ml0.8%瓊脂糖溶液，以形成懸浮液，并且然后將這種細(xì)胞/瓊脂糖懸浮液分配至塑料碗中的室溫礦物油中，或分配至之前裝滿(mǎn)了室溫礦物油的深孔96塑料平板中。
[0049]形成了含有RENCA細(xì)胞的瓊脂糖大珠粒，作為具有光滑表面并且均勻分布細(xì)胞的圓珠。然后從大珠粒吸去礦物油，用RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌大珠粒。
[0050]大珠粒的涂層使用了 4.5% w/v溶液。用于涂層的瓊脂糖與用于珠粒的是相同類(lèi)型；然而，應(yīng)當(dāng)注意到它們可以不同。
[0051]為了進(jìn)行制備珠粒的人工模式，將上文制得的珠粒在含有1.0ml4.5%瓊脂糖的塑料勺子中滾動(dòng)，所述瓊脂糖維持在61-63°C，此后將其滴入室溫礦物油中。
[0052]在本發(fā)明的方法中，將涂層材料維持于61_63°C，并且轉(zhuǎn)移至24孔平板。然后使用圖2a中所示的以及在上文討論的“喇叭形工具”，從室溫礦物油中取出珠粒并且在洗滌珠粒除去礦物油后將其置于第二個(gè)涂層瓊脂糖溶液中。圖4a中描繪的秸桿形工具與溫和抽吸一起使用，以取出珠粒，并與0.5ml瓊脂糖一起，置于含有維持在溫度梯度下的礦物油的容器中。
[0053]將大珠粒從秸桿形工具中分配至礦物油梯度的頂部，其維持在不同溫度，如下文所討論的。隨著大珠粒下降通過(guò)礦物油，涂層在珠粒上固化，形成球形。礦物油的溫度從容器頂部降至底部，底部溫度低，同樣在下文有所討論。然后使用圖2a的喇叭形工具從容器中取出瓊脂糖/瓊脂糖大珠粒，然后在培養(yǎng)基中洗滌。所得到的大珠粒隨后就可用于常規(guī)組織培養(yǎng)。
[0054][0055]使用了一系列不同實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)使用上文所述的溫度梯度。
【權(quán)利要求】
1.用于生產(chǎn)物質(zhì)組合物的方法，所述物質(zhì)組合物包含在含有瓊脂糖的珠粒中的細(xì)胞樣品，其中所述珠粒被瓊脂糖涂覆，所述方法包括: (a)將第一瓊脂糖樣品與所述細(xì)胞混合，以形成懸浮液； (b)從所述懸浮液形成珠粒； (C)用第二瓊脂糖溶液涂覆所述珠粒，和 (d)將所述涂覆的珠粒分配至礦物油樣品中，其中將所述礦物油樣品保持在溫度梯度下，使得所述珠粒從較高溫度的礦物油移動(dòng)至較低溫度的礦物油。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是分泌細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是癌干細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是胰島細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是多能細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在用第二瓊脂糖溶液涂覆所述珠粒之前，用喇叭形工具從所述懸浮液中取出所述珠粒。
10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用喇叭形工具從所述礦物油中取出所述珠粒。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述溫度梯度從約20°c至約50°C，較高溫度在所述梯度開(kāi)始時(shí)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述較高溫度變化范圍從約20°C至約35°C。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述較高溫度從約20°C至約30°C，并且所述較低溫度從約(TC 至約-8°C。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述較高溫度從約20°C至約25°C，并且所述較低溫度從約(TC至約-2°C。
15.可用于將物體從一個(gè)點(diǎn)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)點(diǎn)的裝置，其包括具有中空縱軸的整體構(gòu)造，所述中空縱軸在一端具有連接所述中空縱軸的倒圓錐，而在第二端具有適于連接真空裝置的裝置，所述在第二端的裝置具有大于所述縱軸和倒圓錐裝置兩者的直徑。
16.可用于將物體從一個(gè)點(diǎn)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)點(diǎn)的裝置，該裝置包括具有中空縱軸和兩端的整體構(gòu)造，其第一端適于連接至真空裝置，而第二端適于接收待轉(zhuǎn)移的物體，所述轉(zhuǎn)移裝置進(jìn)一步包括適于接納用于流體源的連接裝置的內(nèi)部裝置，和用于阻止遞送設(shè)備的裝置，所述遞送設(shè)備用于轉(zhuǎn)移所述流體。
【文檔編號(hào)】C12N11/04GK103975059SQ201380003873
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】L·蓋茲達(dá), M·拉臘莫爾, T·漢密爾頓, B·史密斯 申請(qǐng)人:羅格辛研究所