一種抑制金黃色葡萄球菌qs系統(tǒng)表達的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制金黃色葡萄球菌QS系統(tǒng)表達的方法，包括PCR引物設(shè)計、提取RNA、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增目的基因和實時熒光定量PCR分析。在含有金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基加入不同濃度的黃芩素，培養(yǎng)10~12h后，提取其反應(yīng)后的RNA，再將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后用PCR擴增目的基因。
【專利說明】一種抑制金黃色葡萄球菌QS系統(tǒng)表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物與基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抑制金黃色葡萄球菌QS系統(tǒng)表達的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(5: a)是引起慢性肺部感染、醫(yī)學(xué)材料相關(guān)感染等疾病的常見病原體，這種慢性、持續(xù)性感染多與細菌生物被膜形成密切相關(guān)，其具有難治性和高致死性的特點。研究表明5: a生物膜的形成與胞間多糖粘附素(Polysaccharide intercellularadhes1n, PIA)和QS系統(tǒng)有關(guān)，ica操縱子表達產(chǎn)物PIA是與5: a生物被膜形成密切相關(guān)的表面成分，可介導(dǎo)細菌粘附，促進其相互聚集，而QS系統(tǒng)主要通過基因調(diào)控BF的形成，此外，自身除了包含有編碼S-毒素基因外，還可以增加編碼多種胞外蛋白基因的表達，如溶血素、腸毒素、殺白細胞素等。如何控制這些基因編碼，抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成，解決金黃色葡萄球菌的耐藥性問題，成為了一大難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是控制金黃色葡萄球菌相關(guān)基因的編碼，進而抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，本發(fā)明采用實時熒光定量PCR的方法檢測QS相關(guān)基因agrk、sark, RNAIII以及調(diào)控PIA形成的相關(guān)基因ica在黃芩素作用后的表達情況。實現(xiàn)本發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案為:
一種抑制金黃色葡 萄球菌生物膜形成的方法，包括PCR引物設(shè)計、提取RNA、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增目的基因和實時熒光定量PCR分析，具體步驟如下:
(1)PCR引物設(shè)計
根據(jù)Genebank中5: aNC_002952基因為模板，熒光定量用上、下游引物引物由Takara大連寶生物有限公司合成，以16srRNA為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，內(nèi)參基因16srRNA采用S.Sabersheikh, N.A.Saunders 的引物序列，目的基因引用 HeRdy Eleaume, SaRdJabbouri采用的引物序列，所擴增的片段大小見表1。
[0004]表1 qRT-PCR所用引物
【權(quán)利要求】
1.一種抑制金黃色葡萄球菌QS系統(tǒng)表達的方法，包括PCR引物設(shè)計、提取RNA、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增目的基因和實時熒光定量PCR分析，其特征在于，具體步驟如下: (1)PCR引物設(shè)計； (2)提取RNA A.細菌培養(yǎng)和收集:將復(fù)壯后的金黃色葡萄球菌置于3mlTSB-G液體培養(yǎng)基中，溫度35~37°C、轉(zhuǎn)速180rpm/min恒溫搖床培養(yǎng)10~12h后，將菌懸液1:100轉(zhuǎn)接至另一 TSB-G培養(yǎng)基中，加入黃芩素，加入黃芩素的濃度為16~64 μ g/ml，再加入DMSO，使培養(yǎng)基中的DMSO濃度一致，溫度35~37°C、轉(zhuǎn)速180rpm/min恒溫搖床培養(yǎng)l(Tl2h，培養(yǎng)5h后取Iml上述溶液于無菌且含RNA酶的1.5ml離心管中，溫度4~5°C、轉(zhuǎn)速6000rpm/min離心收集細菌，棄去上清液，用tip頭吸出剩余的培養(yǎng)液； B.用pH為8.0的TE buffer溶解溶菌酶和溶葡萄球菌酶，配成濃度為10mg/ml和Img/ml溶液，分別取100 μ I和10 μ I的重懸細胞，35~37 °C處理30min，離心lmin，棄上清液； C.加入1mlRNAiso? plus, tip頭吹打并用震蕩器使溶液混勻進行均質(zhì)化； D.將均質(zhì)化的樣品放置在冰上5min后，加入200 μ I氯仿，用震蕩器震蕩15s，再置于冰上2~3 min,溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm/min離心15min,分為酹氯仿相和水相； E.將水相轉(zhuǎn)移至一個新的離心管，加入0.8倍體積的異丙醇，振搖均勻，-20'25°C放置20min,后在溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm/min離心15min,棄上清液； F.加入70%酒精，洗去離心管沉淀的鹽分，用Tip頭將沉淀打散，在溫度4°C、轉(zhuǎn)速.12000rpm/min離心1min,棄上清液；室溫晾干后,加入無RNase的水溶解使DNase消化； G.DNase消化后用RNase-free水溶解，用紫外分光光度計分析RNA濃度，在260nm和.280nm測定吸光度，用I %瓊脂糖進行RNA電泳； (3)RNA逆轉(zhuǎn)錄 .1)取2yg步驟(2)提取的RNA作為模板，加入IyI引物，再加入DEPC水使總反應(yīng)體系體積為12 μ 1，混勻，離心，65飛8°C孵育5min，合成第一鏈； . 2)在步驟I)的反應(yīng)體系中依次加入4μ I 5Xreact1n buffer, I μ I 20u/ μ I虹1301001^1?應(yīng)酶抑制劑，2 4 I 1mM dNTP MIX, I μ I 200u/ μ I逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，離心，用PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為42°C、60min — 70°C、5min - 4°C>^ ； .3)將步驟2)逆轉(zhuǎn)錄獲得的RNA放置在4°C條件5min，用于qRT-PCR，為cDNA； (4)PCR擴增目的基因 以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進行PCR擴增， PCR反應(yīng)體系如下:試劑用量 ddH209.5 μ I
.2 X Taq PCR Master Mix12.5 μ I Forward PrimerI μ I Reverse PrimerI μ I cDNA 模板I μ I 總體積25 μ I PCR 反應(yīng)條件:熱啟動 95°C、5min，變性 94°C、lmin，退火 58°C、lmin，延伸 72°C、lmin，擴增35個循環(huán)；后在72°C溫育5min，取5 μ I PCR擴增產(chǎn)物，以I XTBE為緩沖液，120V電壓電泳25min，I型核酸染料染色，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照； (5)實時熒光定量PCR分析 用FastStart Universal SYBR Green Master突光定量PCR試劑盒配制目的基因及內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)體系，Setpone PIusABI實時熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)，以5μ gRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，依次將濃度稀釋10倍至15倍，以各濃度的cDNA為模板，分別配制好總反應(yīng)體系，4°C離心后置于實時熒光定量PCR儀進行擴增； 按下列組份配制熒光定量PCR反應(yīng)體系 試劑使用量 2 X SYBR Premix Ex Taq TM12.5 μ I 10 μ M PCR Forward Primer0.5 μ I 10 μ M PCR Reverse Primer0.5 μ I cDNA2 μ I 滅菌 ddH209.5 μ I Total25 μ I
熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C、1min激活DNA聚合酶；95°C、15s — 60°C、60s，進行40個循環(huán)，在每一步的延伸階段讀取熒光染料信號；最后測定產(chǎn)物溶解曲線，95°C、15s — 60 °C>60 s -* 95。。、15 S。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制金黃色葡萄球菌QS系統(tǒng)表達的方法，其特征在于，所述的逆轉(zhuǎn)錄整個過程均在冰上進行，所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系反應(yīng)液的配制均在冰上進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制金黃色葡萄球菌QS系統(tǒng)表達的方法，其特征在于，所述TSB-G液體培養(yǎng)基中含有0.5%葡萄糖。
【文檔編號】C12Q1/68GK104031981SQ201310748089
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】陳一強, 陳艷, 黃瑩瑩, 孔晉亮, 黃宏 申請人:陳一強