一種改良的解磷菌分離鑒別及解磷能力測(cè)定方法
【專利摘要】一種改良的解磷菌分離鑒別及解磷能力測(cè)定方法，取土壤樣品并進(jìn)行初篩和復(fù)篩，篩選出解磷菌，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，以溶磷圈直徑和培養(yǎng)液中含磷量來(lái)綜合反映菌株解磷能力的強(qiáng)弱。本發(fā)明以溴酚藍(lán)指示劑作為篩選標(biāo)記，通過(guò)加入溴酚藍(lán)作為解磷菌初篩的指示劑，通過(guò)觀察溶磷圈進(jìn)行復(fù)篩，可以有效、快速、直觀的篩選出目標(biāo)菌株。同時(shí)通過(guò)測(cè)定液體培養(yǎng)液中磷含量，對(duì)解磷菌的分解能力做到定量。
【專利說(shuō)明】一種改良的解磷菌分離鑒別及解磷能力測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于解磷菌的選擇性分離培養(yǎng)及解磷能力檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，缺磷會(huì)影響植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)。土壤是植物磷素的主要來(lái)源，我國(guó)大部分的土壤都處于缺磷的狀態(tài)，這不是因?yàn)橥寥乐腥狈@種元素，而是土壤中的磷素絕大部分存在于難溶態(tài)的鈣、鐵、鋁等磷酸鹽或復(fù)雜的有機(jī)磷化合物中，能為植物吸收利用的有效磷含量一般小于土壤全磷的5%。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，磷素化肥施用是必須的，但由于磷礦資源的有限性和不可再生性，以及長(zhǎng)期施用化肥引起的土壤板結(jié)等問(wèn)題，人們便開(kāi)始關(guān)注土壤磷素資源的合理利用和土壤改良劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。在環(huán)境中和生物體內(nèi)存在能夠通過(guò)溶解、攝磷、絡(luò)合等作用，使無(wú)效態(tài)磷如礦物態(tài)磷和有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)橛行Я?，滿足植物對(duì)磷素需求的微生物，這種微生物被稱為解磷菌，這一類微生物對(duì)改善土壤結(jié)構(gòu)，提高植物對(duì)磷的利用率，增強(qiáng)植物抗逆、抗病能力方面有著重要作用。土壤中解磷菌種類及數(shù)量的變化及其在土壤中的某些生物化學(xué)過(guò)程強(qiáng)度在一定程度上反映了土壤養(yǎng)分礦化的速度及存在的狀態(tài)，直接影響土壤的供磷狀況。因此，快速準(zhǔn)確的解磷菌分離檢測(cè)方法對(duì)于篩選高效解磷菌、開(kāi)發(fā)生物肥料產(chǎn)品有重要價(jià)值，同時(shí)對(duì)于監(jiān)測(cè)土壤供磷能力也有一定指示作用。但傳統(tǒng)的解磷菌分離檢測(cè)方法分離培養(yǎng)基培養(yǎng)周期長(zhǎng)、分離不完全、篩選標(biāo)記不明顯，常常導(dǎo)致解磷菌目標(biāo)菌株篩選的誤判或遺漏等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是 針對(duì)傳統(tǒng)方法在分離篩選解磷菌中存在的不足，提供一種以溴酚藍(lán)為篩選標(biāo)記，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入一定比例的土壤浸提液以豐富微量元素來(lái)源的解磷菌初篩方法，并結(jié)合溶磷圈及溶磷能力測(cè)定進(jìn)行復(fù)篩和驗(yàn)證，快速、直觀、準(zhǔn)確的解磷菌分離鑒別及解磷能力測(cè)定方法。
[0004]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0005]一種改良的解磷菌分離鑒別及解磷能力測(cè)定方法，包括如下步驟:
A、解磷菌的初篩:配制改良的解磷菌分離培養(yǎng)基，配方為葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)2
4-5g/L、(NH4)2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO4 0.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母膏 0.1-0.2g/L、質(zhì)量濃度0.4%且pH 6.7的溴酚藍(lán)6mL /L,同時(shí)加入制備好的質(zhì)量濃度10%的土壤浸提液100 ml/L、瓊脂粉15 g/L，培養(yǎng)基pH 7.(T7.2，將配制好的培養(yǎng)基于115°C滅菌20-30分鐘后倒板；稱取25g 土壤樣品于225ml無(wú)菌生理鹽水懸浮混勻，制成1:10的樣品勻液，用Iml無(wú)菌吸管吸取1:10的樣品勻液Iml注入盛有9ml無(wú)菌水的無(wú)菌試管中，制成1:100的樣品勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋樣品勻液，取3-4個(gè)適宜濃度的稀釋液0.1ml涂布于分離培養(yǎng)基上，28-30°C倒置培養(yǎng)2-3天，通過(guò)觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色變化情況，進(jìn)而初步篩選解磷菌，若菌落周圍培養(yǎng)基顏色由紫色逐漸變?yōu)辄S色，則可初步確定該菌株為解磷菌，由此獲取得到初篩菌株；B、解磷菌的復(fù)篩:配制解磷菌的固體復(fù)篩培養(yǎng)基，配方為葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)2
5-6 g/L、MgCl2 5 g/L、MgSO4 0.25 g/L、KCl 0.2 g/L、(NH4)2SO4 0.1 g/L、瓊脂粉 15 g/L,固體復(fù)篩培養(yǎng)基pH 7.0 ;將配制好的培養(yǎng)基于115°C滅菌20-30分鐘后倒板；基于步驟A所得初篩菌株，采用三點(diǎn)點(diǎn)植法將初篩菌株點(diǎn)接在固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)6-7天，觀察菌落周圍是否有溶磷圈，從而進(jìn)一步判定是否為解磷菌，若菌落周圍培養(yǎng)基沉淀逐漸消失變透明，出現(xiàn)明顯的透明圈，則可確定初篩菌株為解磷菌；
C、解磷能力的測(cè)定:分別配制液體復(fù)篩培養(yǎng)基和固體復(fù)篩培養(yǎng)基，液體復(fù)篩培養(yǎng)基和固體復(fù)篩培養(yǎng)基的配方均與步驟B的固體復(fù)篩培養(yǎng)基相同，采用測(cè)量溶磷圈直徑和鑰銻抗比色法測(cè)定液體培養(yǎng)液中磷含量來(lái)綜合反映目標(biāo)菌株解磷能力的強(qiáng)弱，具體步驟為:選取初篩菌株用點(diǎn)植法點(diǎn)接于固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)6-7天，測(cè)量溶磷圈直徑；同時(shí)將初篩菌株按1%的接種量接入液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)液作為對(duì)照，于28-30°C, 200 rpm下振蕩培養(yǎng)6-7天，取培養(yǎng)液10000 rpm離心10 min，采用鑰銻抗比色法測(cè)定培養(yǎng)液中含磷量；以溶磷圈直徑和培養(yǎng)液中含磷量來(lái)綜合反映菌株解磷能力的強(qiáng)弱。
[0006]本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)基中加入土壤浸提液來(lái)替代原培養(yǎng)基中所需鐵鹽、錳鹽等微量元素，豐富了培養(yǎng)基中微量元素來(lái)源及其他營(yíng)養(yǎng)成分，以提高篩選能力。并以溴酚藍(lán)指示劑作為篩選標(biāo)記，通過(guò)加入溴酚藍(lán)作為解磷菌初篩的指示劑，通過(guò)觀察溶磷圈進(jìn)行復(fù)篩，可以有效、快速、直觀的篩選出目標(biāo)菌株。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基相比，更直觀、快速，僅培養(yǎng)2-3天即可判定，初篩準(zhǔn)確率達(dá)到90%以上；為了剔除假陽(yáng)性判定結(jié)果，本發(fā)明配制復(fù)篩培養(yǎng)基通過(guò)觀察是否出現(xiàn)溶磷圈進(jìn)一步判別初篩結(jié)果，復(fù)篩準(zhǔn)確率達(dá)99%以上，同時(shí)通過(guò)測(cè)定液體培養(yǎng)液中磷含量，對(duì)解磷菌的分解能力做到定量。該方法具有快速、直觀、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，提供了一種解決傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基培養(yǎng)周期長(zhǎng)、篩選標(biāo)記不明顯而導(dǎo)致誤判或遺漏等問(wèn)題的檢測(cè)方法。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制。
[0008]1、植物根際土中解磷菌的初篩:
(1)分離培養(yǎng)基的配制:
配方為葡萄糖 9-10 g/L、Ca3(PO4)2 4-5g/L、(NH4)2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO40.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母膏 0.1-0.2 g/L、質(zhì)量濃度 0.4% 且pH 6.7 的溴酚藍(lán) 6mL /L，同時(shí)加入制備好的質(zhì)量濃度10%的土壤浸提液100 ml/L、瓊脂粉15 g/L，培養(yǎng)基pH 7.(T7.2，將配制好的培養(yǎng)基于115°C滅菌20-30分鐘后倒板；
(2)土壤樣品稀釋與培養(yǎng):
土壤樣品來(lái)源于植物根際土壤，稱取25g 土壤樣品于225ml無(wú)菌生理鹽水懸浮混勻，制成1:10的樣品勻液，用Iml無(wú)菌吸管吸取1:10的樣品勻液Iml注入盛有9ml無(wú)菌水的無(wú)菌試管中，制成1:100的樣品勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋樣品勻液，取3-4個(gè)適宜濃度(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中平板上菌落數(shù)為20-200個(gè)的稀釋梯度較為適宜)的稀釋液0.1ml涂布于分離培養(yǎng)基上，28-30°C倒置培養(yǎng)2-3天；
(3)初篩菌株:
溴酚藍(lán)顏色會(huì)隨PH變化而變化，解磷菌在分解難溶性磷的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)酸，從而改變培養(yǎng)基的酸堿度，使得培養(yǎng)基變色。判定依據(jù)為:若菌落周圍甚至整個(gè)平板培養(yǎng)基顏色由紫色逐漸變?yōu)辄S色，則可初步確定該菌株為解磷菌，由此得到初篩菌株。
[0009]2、植物根際土壤中解磷菌的復(fù)篩:
(1)復(fù)篩培養(yǎng)基的配制:
配制解磷菌的固體復(fù)篩培養(yǎng)基，配方為葡萄糖9-10 g/L、Ca3(PO4)2 5-6 g/L、MgCl2 5g/L、MgS04 0.25 g/L、KCl 0.2 g/L、(NH4)2SO4 0.1 g/L、瓊脂粉 15 g/L，固體復(fù)篩培養(yǎng)基 pH
7.0 ;將配制好的固體復(fù)篩培養(yǎng)基于115°C滅菌20-30分鐘后倒板；
(2)培養(yǎng)及結(jié)果判別:
采用三點(diǎn)點(diǎn)植法將初篩菌株點(diǎn)接在固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)6-7天，若菌落周圍培養(yǎng)基中的沉淀逐漸消失變透明，出現(xiàn)明顯的透明圈，磷酸鈣沉淀已被分解，即為溶磷圈，則可確定初篩菌株為解磷菌；
初篩疑似解磷菌菌株經(jīng)復(fù)篩驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)均有溶磷圈，都具有解磷能力，表明初篩培養(yǎng)基中加入的溴酚藍(lán)指示劑具有較好的判別效果，初篩判別準(zhǔn)確率可達(dá)到90%以上，可作為監(jiān)測(cè)土壤或其他環(huán)境中解磷菌數(shù)量較為理想的選擇性培養(yǎng)基。復(fù)篩后有溶磷圈的菌株經(jīng)液體培養(yǎng)法檢測(cè)磷含量，發(fā)現(xiàn)菌株的解磷能力強(qiáng)弱與溶磷圈大小相吻合，表明復(fù)篩培養(yǎng)基對(duì)篩選高效解磷菌具有較好的判別作用，且復(fù)篩判別準(zhǔn)確率可達(dá)到99%以上。
[0010]3、解磷能力的測(cè)定
分別配制液體復(fù)篩培養(yǎng)基和固體復(fù)篩培養(yǎng)基，采用測(cè)量溶磷圈直徑(D)和鑰銻抗比色法測(cè)定液體培養(yǎng)液中磷含量來(lái)綜合反映目標(biāo)菌株解磷能力的強(qiáng)弱。具體步驟為:選取初篩菌株點(diǎn)植法將初篩菌株點(diǎn)接于固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)6-7天，測(cè)量溶磷圈直徑(D);同時(shí)將初篩菌株按1%的接種量接入液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)液作為對(duì)照，于28-30°C、200 rpm下振蕩培養(yǎng)6-7天，取一定量的培養(yǎng)液10000 rpm離心10 min，采用鑰銻抗比色法測(cè)定。以測(cè)量得到的溶磷圈直徑D值和培養(yǎng)液中含磷量來(lái)綜合反映菌株解磷能力的強(qiáng)弱，溶磷圈直徑和磷含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0011]表1解磷菌@磷能力的測(cè)定結(jié)果 __
檢測(cè)項(xiàng)目I對(duì)照|P1 |P4
磷含量(tig/mL)0 0.126 0.177`
溶磷圈直徑 D (cm) I無(wú) |l.3~1.5 |l.8~2.^~
上表中，PU P4分別代表2株不同的菌。
[0012]從溶磷圈直徑大小和磷含量高低，可以看出P4的解磷能力較強(qiáng)，且溶磷圈直徑大小與培養(yǎng)液中磷含量高低相吻合。
【權(quán)利要求】
1.一種改良的解磷菌分離鑒別及解磷能力測(cè)定方法，其特征在于，包括如下步驟: A、解磷菌的初篩:配制改良的解磷菌分離培養(yǎng)基，配方為葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)24-5g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO4 0.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母膏 0.1-0.2g/L、質(zhì)量濃度0.4%且pH 6.7的溴酚藍(lán)6mL /L,同時(shí)加入制備好的質(zhì)量濃度10%的土壤浸提液100 ml/L、瓊脂粉15 g/L，培養(yǎng)基pH 7.(T7.2，將配制好的培養(yǎng)基于115°C滅菌20-30分鐘后倒板；稱取25g 土壤樣品于225ml無(wú)菌生理鹽水懸浮混勻，制成1:10的樣品勻液，用Iml無(wú)菌吸管吸取1:10的樣品勻液Iml注入盛有9ml無(wú)菌水的無(wú)菌試管中，制成1:100的樣品勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋樣品勻液，取3-4個(gè)適宜濃度的稀釋液0.1ml涂布于分離培養(yǎng)基上，28-30°C倒置培養(yǎng)2-3天，通過(guò)觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色變化情況，進(jìn)而初步篩選解磷菌，若菌落周圍培養(yǎng)基顏色由紫色逐漸變?yōu)辄S色，則可初步確定該菌株為解磷菌，由此獲取得到初篩菌株； B、解磷菌的復(fù)篩:配制解磷菌的固體復(fù)篩培養(yǎng)基，配方為葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)25-6g/L、MgCl2 5 g/L、MgSO4 0.25 g/L、KCl 0.2 g/L、(NH4)2SO4 0.1 g/L、瓊脂粉 15 g/L,固體復(fù)篩培養(yǎng)基pH 7.0 ;將配制好的培養(yǎng)基于115°C滅菌20-30分鐘后倒板；基于步驟A所得初篩菌株，采用三點(diǎn)點(diǎn)植法將初篩菌株點(diǎn)接在固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)6-7天，觀察菌落周圍是否有溶磷圈，從而進(jìn)一步判定是否為解磷菌，若菌落周圍培養(yǎng)基沉淀逐漸消失變透明，出現(xiàn)明顯的透明圈，則可確定初篩菌株為解磷菌； C、解磷能力的測(cè)定:分別配制液體復(fù)篩培養(yǎng)基和固體復(fù)篩培養(yǎng)基，液體復(fù)篩培養(yǎng)基和固體復(fù)篩培養(yǎng)基的配方均與步驟B的固體復(fù)篩培養(yǎng)基相同，采用測(cè)量溶磷圈直徑和鑰銻抗比色法測(cè)定液體培養(yǎng)液中磷含量來(lái)綜合反映目標(biāo)菌株解磷能力的強(qiáng)弱，具體步驟為:選取初篩菌株用點(diǎn)植法點(diǎn)接于固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)6-7天，測(cè)量溶磷圈直徑；同時(shí)將初篩菌株按1%的接種量接入液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)液作為對(duì)照，于28-30°C, 200 rpm下振蕩培養(yǎng)6-7天`，取培養(yǎng)液10000 rpm離心10 min，采用鑰銻抗比色法測(cè)定培養(yǎng)液中含磷量；以溶磷圈直徑和培養(yǎng)液中含磷量來(lái)綜合反映菌株解磷能力的強(qiáng)弱。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103667157SQ201310725654
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】薛紅芬, 陳云嬌, 張曉龍, 羅華元, 董石飛, 周芳芳, 周麗娟, 王娟 申請(qǐng)人:云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司, 紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司