一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，屬于酶制劑制備【技術領域】。以產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌（Bacillus?thermophilus）701為出發(fā)菌株，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝經液體深層發(fā)酵制備出一種耐高溫、耐堿性強、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活性的適合造紙、食品和飼料等領域的耐高溫堿性木聚糖酶。酶比活力為350-420IU/ml；最適反應溫度為65℃，適用溫度范圍為40-75℃；最適反應pH值為10.0，適用反應pH值范圍為5.0-11.0。
【專利說明】一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術領域】，特別是一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法?！颈尘凹夹g】
[0002]纖維素、半纖維素和木質素是植物半纖維素的主要成分，它們共同作用構成了植物細胞壁的支撐骨架，在三者之中半纖維素占據了植物干重的35%以上，半纖維素也是多種復合聚糖的總稱，其主要成分為木聚糖，它是一種復雜的多聚五碳糖。木聚糖的主鏈是通過β -1-4糖苷鍵把多個吡喃木糖基連接起來，側鏈上連接著不同的取代基，這樣有乙?；?、葡萄糖醛?；-阿拉伯糖基等(Collins et al.，2005)。所以木聚糖的完全降解就需要多種酶的共同參與。一般將木聚糖分為硬木木聚糖和軟木木聚糖。硬木木聚糖主要是由O-乙酰-4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖聚合而成，以β -1-4糖苷鍵相連。軟木聚糖由阿拉伯
4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖殘基聚合而成(Beg et al，2001)。有的分類方法也把木聚糖分為可溶性木聚糖和不可溶性木聚糖。
[0003]木聚糖酶(1，4-β _D_xylanase:EC3.2.1.8)是一種重要的工業(yè)用酶,在分解木聚糖時起生物催化作用，可以將木聚糖分解成多糖或單糖的蛋白質或RNA。木聚糖酶廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體內等都能產生木聚糖酶。
[0004]由于木聚糖酶在工業(yè)上潛在的應用價值，在近十年內引起了人們的更多注意，其中堿性木聚糖酶主要應用于紙漿和造紙企業(yè)。堿性木聚糖酶在造紙行業(yè)中的應用主要包括制漿、協助漂白、改纖維性質、廢紙脫墨等方面。
[0005]在工業(yè)生產中，制漿過程是在堿性的條件下，用高溫蒸煮的方法除去木質素，為使溶解制漿纖維素純度達到98%， 這就需要大量的氫氧化鈉處理紙漿，造成了嚴重的環(huán)境污染，為此許多學者轉而嘗試生物處理制漿，而用于制漿漂白的木聚糖酶應是耐熱和耐堿的。馮建良等(Kimura et al.2000)用木聚糖酶預處理麥草與常規(guī)化學法制漿進行了比較試驗，木聚糖酶預處理提高了原料的脫木素程度，還可以降低制漿的卡伯值。木聚糖酶在輔助漂白方面有較廣泛而深入的研究，且取得了很大成果。研究發(fā)現，無論是針葉木漿、闊葉木漿或是竹漿、草漿，木聚糖酶均可以降解紙漿中殘余的木質素，提高了白度(AL BALAA etal, 2006 ；Meek and Lipman, 1922)。用于紙衆(zhòng)漂白的木聚糖酶必須具有耐高溫特點,Khasin等得到了一個來源于堿性菌株Bacillus sterarothermophiIus T26木聚糖酶,該木聚糖酶在pH9.0及65°C時對紙漿有最好的漂白效果(Khasin et al，1993)，很多木聚糖酶不具備這樣的特點，限制了商業(yè)化應用。全世界每年產生的廢紙數量是驚人的，廢紙回收后再利用工作就變得尤為重要了，可以使在資源重復利用的同時也保護了環(huán)境。1991年，由韓國學者首次報道了應用木聚糖酶能將油墨從新聞廢紙漿中脫除。此后，人們開始研究利用木聚糖酶進行廢紙脫墨，以減輕或消除化學脫墨帶來的環(huán)境污染(曹軍衛(wèi)等，2004)。
[0006]目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經成為世界各國造紙業(yè)紙漿漂白發(fā)展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美洲的30余家大型紙廠得到應用，成為生物技術在造紙工業(yè)應用最成功的一例。其中加拿大有約10%的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項新工藝。丹麥諾維信公司和美國山道斯化學公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于制漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產品，但到目前為止，工業(yè)上應用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應溫度大多在50°C左右，眾所周知，紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強堿的條件下進行的，使得現有的低溫酸性木聚糖酶產品在此領域的應用受到極大的限制，另外，在飼料和食品領域，木聚糖酶應用在飼料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高溫條件下能夠保持較高的酶活，因此，研究開發(fā)耐高溫的木聚糖酶產品將會帶來良好的經濟效益和社會效益。
[0007]從天然微生物中篩選性質更為優(yōu)良的木聚糖酶產酶菌，是一個有效獲得高產木聚糖酶菌株的一個最有效的手段。自從木聚糖酶具有生物漂白功能以來，人們把更多的目光投向了堿性木聚糖酶，篩選了很多具有應用前景的堿性木聚糖酶的生產菌株，分離了很多堿性木聚糖酶。1973年，Horikoshi等首次發(fā)現了來自堿性細菌中的木聚糖酶(Horikoshiand Atsukawa, 1973),從堿性細菌Bacillus sp.N0.C25922中純化得到木聚糖酶,它的最適PH為6-8。之后，發(fā)現了來自堿性細菌Bacillus N0.C2125的2個木聚糖酶:木聚糖酶A及木聚糖酶N，其中木聚糖酶A在pH12時也有一定的酶活(Honda et al，1985)。Dey等(Deyet al，1992)分離的嗜堿嗜熱菌Bacillus sp.(NCM59)，能產生2個沒有纖維素酶活性的木聚糖酶，它們具有很好的耐堿性，最適pH為10.0。Nakamura等報道了來源于堿性菌株Bacillus sp.41M21的胞外木聚糖酶J它的最適pH為9.0 (Nakamura et al,1993)。大多數真菌產生的木聚糖酶一般為酸性木聚糖酶，但也有例外，Taneja等篩選到一株嗜堿真菌AspergillusnidulansKK299,它產的木聚糖酶的最適 pH 為 8(Taneja et al, 2002),并且該酶對硬木木聚糖比軟木木聚糖有更高的親和性。
[0008]中國專利CN101701205A公開了一種耐堿性木聚糖酶XynE2及其基因和應用，所產耐堿性木聚糖酶最適PH值7.8，最適溫度65°C ;中國專利CN102586134B公開了一株生產耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產色鏈霉菌菌株及其應用，所產木聚糖酶最適pH值6.0，最適溫度70°C ;中國專利CN102321558A公開了一種耐高溫木聚糖酶的高產菌種及利用該菌發(fā)酵產耐高溫木聚糖酶的方法及得到的酶，所產耐高溫木聚糖酶最適PH值7.0，最適溫度60。。。
[0009]由此看來，國際及國內諸多專家、學者及科研工作人員不惜資金、人力和時間，加大了對耐高溫、耐堿性木聚糖酶的研發(fā)力度，旨在將生物技術在造紙、食品、飼料等領域的應用推向一個更高、更新、更強的新時代，無論是新菌種的獲得，還是采用基因重組技術，雖然耗費了如此之大的財力及精力，但結果不盡人意，很難達到耐高溫、耐堿性木聚糖酶的研發(fā)目標及要求，要么耐溫不耐堿；要么耐堿不耐溫；要么耐堿耐高溫范圍不寬泛；要么木聚糖酶不純并有纖維素酶活性；要么作用底物不適等等，制備一種耐堿性更強、耐溫度更高、耐堿耐高溫范圍寬泛、不具有纖維素酶活性且適合造紙、食品和飼料等領域的耐高溫堿性木聚糖酶仍是本領域技術人員不懈的追求和研發(fā)方向。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明所解決的技術問題是克服現有耐高溫堿性木聚糖酶的產品缺陷，以產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)701為出發(fā)菌株,并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝制備出一種耐高溫、耐堿性強、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活性的適合造紙、食品和飼料等領域的耐高溫堿性木聚糖酶。
[0011]本發(fā)明提供的產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌701是從湖南省雪麗造紙廠采集土樣分離出一株嗜熱芽孢桿菌HYX0021，經反復的紫外誘變及亞硝基胍誘變篩選獲得，特性是耐高溫、耐堿性強。
[0012]本發(fā)明提供的產耐高溫堿性木聚糖酶的菌株具體為嗜熱芽孢桿菌701。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學，郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013537，分類命名為嗜熱芽孢桿菌701(Bacillus thermophilus701)。
[0013]本發(fā)明所制備的耐高溫堿性木聚糖酶比活力為350_420IU/ml，，適用溫度范圍為40-750C，最適反應溫度65°C，在75°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應pH值范圍為5.0-11.0，在pH值為11.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應pH值為10.0。
[0014]一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0015](I)菌種活化
[0016]將保存完好的嗜熱芽孢桿菌701的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，37_45°C培養(yǎng)24-36h進行菌種活化，如此活化2-3次；
[0017]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖2-5g,瓊脂 15-20g,中草藥劑粉 5-10g，蒸餾水 1000mL, pH 值 5-11，121°C滅菌 20min ；
[0018]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0019]以重量份數計，稱取黃芪20-30份，黨參10-18份，柴胡10_15份，黃芩10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0020]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。
[0021]所述混合酶的重量份數組成為:內β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0022]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0023](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0024]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種1-2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度38-43°C，培養(yǎng)時間10_15h ；
[0025]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0026]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度38-43°C，培養(yǎng)時間10_15h ；
[0027]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37-45°C，攪拌速度200_400rpm，通風量(V/V) 1:1-2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間 10-20h ；[0028]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0029]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥劑粉1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
[0030]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0031]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，樺木木聚糖0.1-0.8%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
[0032]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/mL ；
[0033](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0034]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度37_45°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，將步驟
(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45 °C，恒溫培養(yǎng) 15-20h ；
[0035]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15-30% ；
[0036]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5-11 ；
[0037]補料控制:當發(fā)酵液·中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/mL時,開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/mL-5mg/mL ；
[0038]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0039]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥劑粉30-50g，海藻糖30-40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4_8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值5-11，121°C滅菌 20min ；
[0040]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，中草藥劑粉5-10%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°C滅菌30_40min。
[0041]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0042]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值5-11，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pH5-ll，121-123°C滅菌30_40min備用。
[0043](4)發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶。
[0044]所述調配過程不添加任何防腐劑，可以加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥劑粉。
[0045]有益效果:
[0046]1.本發(fā)明的制備耐高溫堿性木聚糖酶的方法以具有耐高溫、耐堿性強的嗜熱芽孢桿菌701為菌種，制備的耐高溫堿性木聚糖酶酶比活力為350-420IU/mL ;適用溫度范圍為40-75°C，最適反應溫度65°C，在75°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應pH值范圍為5.0-11.0，在pH值為11.0時酶活完全穩(wěn)定,最適反應pH值為10.0。比現有的耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高，耐溫度高，耐堿性強，酶作用最適pH值范圍寬泛，特別適合造紙、食品和飼料等領域的工業(yè)化需求。
[0047]2.本發(fā)明耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了嗜熱芽孢桿菌701的抗應激能力，致使菌株產酶能力最大限度地顯現。并且本發(fā)明對嗜熱芽孢桿菌701培養(yǎng)基組成實施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，添加了具有調整和修復機體功能、增強機體的免疫功能、具有微生態(tài)調節(jié)功能的黃芪、黨參等，進一步增強了微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機體功能性、傳代適應性和共同協作性，進而增強嗜熱芽孢桿菌701的代謝功能，使得本發(fā)明所產耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強、適于工業(yè)化生產。
[0048]3.本發(fā)明耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法中培養(yǎng)基的重要組成部分中草藥粉劑采用酶解工藝和水提醇沉工藝相結合，不僅顯著提高了各種中草藥的有效成分，增強了中草藥的作用效力，而且還為微生物發(fā)酵提供了難得的營養(yǎng)物質(如中藥多糖等)。
【具體實施方式】
[0049]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0050]實施例1
[0051]本發(fā)明提供的產耐高 溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌701是從湖南省雪麗造紙廠采集土樣分離出一株嗜熱芽孢桿菌HYX0021，經反復的紫外誘變及亞硝基胍誘變篩選獲得，特性是耐高溫、耐堿性強。
[0052]本發(fā)明提供的產耐高溫堿性木聚糖酶的菌株具體為嗜熱芽孢桿菌701。該菌株已于2013年10月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCC M2013537。
[0053]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖
2-5g,瓊脂 15-20g,中草藥劑粉 5-10g，蒸餾水 lOOOmL, pH 值 5-11，121°C滅菌 20min ；
[0054]所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0055]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥劑粉1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
[0056]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0057]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨
0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，樺木木聚糖0.1-0.8%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
[0058]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥劑粉30-50g，海藻糖30-40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4_8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值5-11，121°C 滅菌 20min ；
[0059]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，中草藥劑粉5-10%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°C滅菌30_40min。
[0060]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0061]以重量份數計，稱取黃芪20-30份，黨參10-18份；柴胡10-15份，黃芩10_15份，分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0062]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。
[0063]所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0064]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0065]實施例2
[0066]一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0067](1)菌種活化
[0068]將保存完好的嗜熱芽孢桿菌701的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h進行菌種活化，如此活化2次；
[0069]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g,氯化鈉5g,蛋白胨IOg,葡萄糖2g,瓊脂15g,中草藥劑粉5g,蒸懼水lOOOmL, pH值5,121°C滅菌20min ；
[0070]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0071]以重量份數計，稱取黃芪20份，黨參10份，柴胡10份，黃芩10份，分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0072]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5%。
[0073]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶10份，外葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份。
[0074]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1。
[0075](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0076]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度38°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0077]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；[0078]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度38°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0079]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間IOh ；
[0080]所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0081]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥劑粉
1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補足，pH值5，121°C 滅菌 30min。
[0082]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0083]麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥劑粉1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%,檸檬酸鈉0.1%，樺木木聚糖0.1%，不足部分純凈水補足，pH 值 5，121°C滅菌 30min。
[0084]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個/mL ；
[0085](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0086]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V)l:l，培養(yǎng)時間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升`溫速率緩慢升溫至37°C，恒溫培養(yǎng)15h ；
[0087]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ；
[0088]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5 ；
[0089]補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/mL-8mg/mL時，開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/mL-5mg/mL ；
[0090]放罐標準:60%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0091]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥劑粉30g，海藻糖30g，樺木木聚糖5g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑0.1g,純凈水lOOOmL, pH值5，121°C滅菌20min ；
[0092]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥劑粉5%，不足部分純凈水補足，pH值5，121°C滅菌30min。
[0093]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0094]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值5，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15min，然后緩慢升溫至90°C保溫15min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pH5,121°C滅菌30min備用。
[0095](4)發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶。
[0096]所述調配過程不添加任何防腐劑，可以加入濃縮酶液總重量0.5%中草藥劑粉。
[0097]經上述制備方法得到的耐高溫堿性木聚糖酶液體酶比活力為350IU/mL。
[0098]實施例3[0099]一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0100](I)菌種活化
[0101]將保存完好的嗜熱芽孢桿菌701的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，41°C培養(yǎng)30h進行菌種活化，如此活化3次；
[0102]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏6g，氯化鈉Sg，蛋白胨15g，葡萄糖5g，瓊脂20g，中草藥劑粉8g,蒸懼水lOOOmL, pH值8,121°C滅菌20min ；
[0103]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0104]以重量份數計，稱取黃芪25份，黨參15份，柴胡12份，黃芩12份，分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至70°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0105]所述混合酶添加量為混合物料總重量的8%。
[0106]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶18份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0107]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.2。
[0108](2)液體種子擴大 培養(yǎng)
[0109]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0110]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0111]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間10-15h ；
[0112]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41 °C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0113]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0114]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.1%，中草藥劑粉1.8%，海藻糖2%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.2%，不足部分純凈水補足，pH值8,123°C滅菌 40min。
[0115]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0116]麥芽糊精10%，酵母粉0.6%，中草藥劑粉1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.3%，玉米漿
0.3%，磷酸氫二鉀1.1%，硫酸鎂0.08%,檸檬酸鈉0.3%，樺木木聚糖0.4%，不足部分純凈水補足，pH 值 8,123°C滅菌 40min。
[0117]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO8個/mL ；
[0118](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0119]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度41 °C，攪拌速度500rpm，通風量(V/V)l:2，培養(yǎng)時間12h ;然后以2°C /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h升溫速率緩慢升溫至41°C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0120]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧20% ；
[0121]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在8 ；
[0122]補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/mL-8mg/mL時，開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/mL-5mg/mL ；
[0123]放罐標準:70%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0124]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆餅粉20g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，樺木木聚糖10g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水lOOOmL, pH值8，121°C滅菌20min ；
[0125]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草藥劑粉8%，不足部分純凈水補足，pH值8，123°C滅菌40min。
[0126]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0127]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值8，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然后緩慢升溫至90°C保溫20min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pH8,123°C滅菌40min備用。
[0128](4)發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶。
[0129]所述調配過程不添加任何防腐劑，可以加入濃縮酶液總重量3%中草藥劑粉。
[0130]經上述制備方法得到的耐高溫堿性木聚糖酶液體酶比活力為400IU/mL。
[0131]實施例4
[0132]一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0133](1)菌種活化
[0134]將保存完好的嗜熱芽孢桿菌701的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，45°C培養(yǎng)36h進行菌種活化，如此活化3次；
[0135]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g，瓊脂20g,中草藥劑粉IOg,蒸懼水lOOOmL, pH值10,121°C滅菌20min ；
[0136]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0137]以重量份數計，稱取黃芪30份，黨參18份，柴胡15份，黃芩15份，分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0138]所述混合酶添加量為混合物料總重量的10%。
[0139]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
[0140]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.5。
[0141](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0142]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度43°C，培養(yǎng)時間15h ；
[0143]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；[0144]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度43°C，培養(yǎng)時間15h ；
[0145]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速度400rpm，通風量(V/V) 1:2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間20h ；
[0146]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0147]酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氫二鉀1.5%，中草藥劑粉2%，海藻糖3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補足，pH值10,123°C滅菌 40min。
[0148]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0149]麥芽糊精15%，酵母粉0.8%，中草藥劑粉2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米漿0.5%，磷酸氫二鉀1.5%，硫酸鎂0.1%，檸檬酸鈉0.5%，樺木木聚糖0.8%，不足部分純凈水補足，pH值 10，123°C滅菌 40min。
[0150]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO8個/mL ；
[0151](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0152]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速度700rpm，通風量(V/V)l:3，培養(yǎng)時間15h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至5°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)30h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2 V /h升溫速率緩慢升溫至45 °C，恒溫培養(yǎng)20h ；
[0153]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧30% ；
[0154]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在10 ；
[0155]補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/mL-8mg/mL時，開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/mL-5mg/mL ；
[0156]放罐標準:80%菌體衰老自溶,酶活力增長緩慢。
[0157]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥劑粉50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g，樺木木聚糖15，消泡劑Ig,純凈水lOOOmL, pH值10，121°C滅菌20min ；
[0158]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草藥劑粉10%,不足部分純凈水補足，pH值10，123°C滅菌40min。
[0159]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0160]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值10，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pHIO, 123°C滅菌40min備用。
[0161](4)發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶。
[0162]所述調配過程不添加任何防腐劑，可以加入濃縮酶液總重量5%中草藥劑粉。
[0163]經上述制備方法得到的耐高溫堿性木聚糖酶液體酶比活力為420IU/mL。
[0164]實施例5本發(fā)明堿性木聚糖酶用于麥草漿的漂白
[0165]1.酶處理條件
[0166]漿濃5% ;溫度75°C ;處理時間60min ;pH值11 ;酶用量20IU/g。
[0167]2.次氯酸漂白條件
[0168]漿濃6% ;溫度40°C;漂白時間120min ;漂液為次氯酸鈉，濃度為26.25g/L ;用氯量為 5%、2.5%ο
[0169]3.紙漿經酶處理及次氯酸鹽漂白結果如表1所示，其中h-Ο:未經酶處理、只用次氯酸漂白的紙漿；h_l:經酶處理、未用次氯酸漂白的紙漿；h-2、h-3:經酶處理、在漂白機里用次氯酸鈉漂白的紙漿；h-2、h-0漂白條件完全相同。
[0170]從表1中的結果分析:未漂漿經酶處理，可顯著改善麥草漿的次氯酸鹽漂白性能，當漂白用量為5%時，漂白原漿經酶處理比未經酶處理票后紙漿白度提高18.4%，當漂到65.0%左右時，原漿漂白用氯量為5%，經酶處理的紙漿比對照組可節(jié)省用氯50%。
[0171]表1:經不同處理后漂白紙漿的結果
[0172]
【權利要求】
1.一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述木聚糖酶以產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)701為出發(fā)菌株,并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝經液體深層發(fā)酵制備。
2.如權利要求1所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M2013537的斜面菌種經活化和一、二、三級種子培養(yǎng)及一級種子罐逐級擴大培養(yǎng)得到種子液，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度37-45°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至37_45°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶，所述調配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥劑粉。
3.如權利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥劑粉1.5-2%，海藻糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，檸檬酸鈉0.1-0.5%，樺木木聚糖0.1-0.8%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123 °C滅菌30_40mino
4.如權利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml。
5.如權利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥劑粉30_50g，海藻糖30-40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值5_11，121°C滅菌20mino
6.如權利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)pH值5-11，加入每克玉米粉3u的中溫淀粉酶與30u高溫淀粉酶，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15-30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pH5-ll，121-123°C滅菌30_40min備用。
7.如權利要求2-6任一所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下:以重量份數計，稱取黃芪20-30份，黨參10-18份，柴胡10-15份，黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45_60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2_4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的質量比例為1:1-1.5，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
8.如權利要求7所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5_10份，酸性磷酸酶5-10份。
9.如權利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)菌種活化 將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC Μ2013537的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，45°C培養(yǎng)36h進行菌種活化，如此活化3次； 所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g，瓊脂20g，中草藥劑粉IOg,蒸懼水1000mL, pH值10,121。。滅菌20min ； 所述中草藥粉劑的制備方法如下: 稱取黃芪30份；黨參18份；柴胡15份；黃芩15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑； 所述混合酶添加量為混合物料總重量的10% ； 所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶20份，外β -葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，`超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份； 所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.5 ; (2)液體種子擴大培養(yǎng) ①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度43°C，培養(yǎng)時間15h ； ②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同； ③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度43°C，培養(yǎng)時間15h ； ④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速度400rpm，通風量(V/V) 1: 2，罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間20h ； 所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為: 酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氫二鉀1.5%，中草藥劑粉2%，海藻糖3%，硫酸鈣Ig,氯化鎂2g，檸檬酸鈉3g，不足部分純凈水補足，pH值10，123°C滅菌 40min ； 所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為: 麥芽糊精15%，酵母粉0.8%，中草藥劑粉2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米漿0.5%，磷酸氫二鉀1.5%，硫酸鎂0.1%，檸檬酸鈉0.5%，樺木木聚糖0.8%，不足部分純凈水補足，pH值10,123°C滅菌 40min ； 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO8個/ml ； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵 將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速度700r/m，通風量(V/V)l:3，培養(yǎng)時間15h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至5°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)30h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2 V /h升溫速率緩慢升溫至45 °C，恒溫培養(yǎng)20h ； 溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧30% ； pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在10 ； 補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/mL-8mg/mL時,開始添加補料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/mL-5mg/mL ； 放罐標準:80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥劑粉50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g，樺木木聚糖15，消泡劑Ig,純凈水1000mL, pH值10，121°C滅菌20min ； 所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草藥劑粉10%，不足部分純凈水補足，pH值10，123°C滅菌40min ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法 為: 按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值10，加入中溫淀粉酶3u/g玉米粉與高溫淀粉酶30u/g玉米粉，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始PH10,123°C滅菌 40min 備用； (4)發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶，所述調配過程不添加任何防腐劑，可以加入濃縮酶液總重量5%中草藥劑粉。
10.利用權利要求2所述的耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法制得的木聚糖酶在紙漿漂白中的應用。
【文檔編號】C12R1/07GK103865902SQ201310682220
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李洪兵, 李海清, 胡永明, 劉文明, 易繼云, 雷敏 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司