提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法，屬于大型真菌培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征為：將經(jīng)過固體誘導(dǎo)并擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，直接在液體培養(yǎng)基中，加入復(fù)合氨基酸及微量的子實(shí)體干粉，即可使菌絲體的產(chǎn)毒能力提高5.5～7.2倍。本發(fā)明具有操作簡單易實(shí)現(xiàn)、周期短、生產(chǎn)成本低、效益明顯、生態(tài)等特點(diǎn)。鵝膏毒素價(jià)值大應(yīng)用范圍廣，在開發(fā)新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮(zhèn)靜或麻醉藥等領(lǐng)域具有潛在地應(yīng)用，但至今因鵝膏資源珍稀、難以人工馴化、毒素的化學(xué)合成品無活性等問題尚難以開發(fā)應(yīng)用。本發(fā)明通過簡單的培養(yǎng)，即可使菌絲體的鵝膏毒肽產(chǎn)量明顯提高，為今后鵝膏毒素的有益生物轉(zhuǎn)化及可持續(xù)性開發(fā)利用等奠定了重要基礎(chǔ)。
【專利說明】提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是屬于有毒大型真菌室內(nèi)培養(yǎng)范疇。
【背景技術(shù)】
[0002]鵝膏菌屬—)隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價(jià)值的一個(gè)世界性廣布大屬,其物種多
樣性是非常豐富的。全球已報(bào)道近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。據(jù)考證，目前中國仍有不少種尚未研究和命名。但是如今隨著全球生態(tài)危機(jī)的出現(xiàn)，我國的許多大型真菌資源已告危，處于嚴(yán)重衰退及瀕危狀態(tài)，而部份種面臨著可能還沒有被人類認(rèn)識(shí)或發(fā)現(xiàn)其價(jià)值時(shí)，就已滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]鵝膏菌屬中的大部份種屬于著名劇毒菌，據(jù)知，因誤食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鵝膏菌所致?？茖W(xué)家們對(duì)鵝膏菌真正感興趣的是其毒性，因此，大約在140年前，人們就開始了鵝膏菌毒素的研究。鵝膏菌毒素可分為四類，其中最主要也是最重要的是肽類毒素，肽類毒素又包括鵝膏毒肽(amatoxins)、鬼筆毒肽(phallotoxins)和毒傘素類(virotoxins)三種，鵝膏毒肽是一類雙環(huán)八肽，已分離純化的天然鵝膏毒肽有9種。
[0004]鵝膏毒素的應(yīng)用研究主要體現(xiàn)在以下幾方面:①可用于研究真核生物基因的表達(dá)、調(diào)控及細(xì)胞定位，因鵝膏毒肽對(duì)真核生物RNA聚合酶II的活性有專一性抑制作用可開發(fā)抗菌、抗病毒特效新藥，已證明，皰疹病毒、腺病毒、12猿病毒、禽支氣管炎病毒等對(duì)amatoxins很敏感可篩選抗腫瘤藥物，已報(bào)道了 α -鵝膏毒肽的抗腫瘤活性可開發(fā)鎮(zhèn)靜、麻醉及其它特效藥，西伯利亞、印度、日本、美國等報(bào)道將毒蠅傘作為夢幻劑、鎮(zhèn)靜或麻醉藥、安眠藥等；⑤可用于生物`防冶等，鵝膏子實(shí)體對(duì)典型農(nóng)作物害蟲有明顯的殺滅及抑制活性。
[0005]目前導(dǎo)致鵝膏難以開發(fā)及可持續(xù)性利用的主要瓶頸問題有:①鵝膏資源珍稀，其種群小，個(gè)體少，產(chǎn)量低，分布數(shù)量極其有限，加之對(duì)生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬于特殊的致危生物類群，這增加了其進(jìn)一步被研究、利用的難度；②鵝膏菌屬，大多屬于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培，其絕大部份種仍屬于自然界中難培養(yǎng)或未能培養(yǎng)的微生物，難以人工、半人工栽培，雖然已有少數(shù)的種能進(jìn)行菌絲的純培養(yǎng)，但也存在一些問題，如菌絲生長緩慢、菌絲中毒素含量不高鵝膏多肽毒素，是一種由7-8個(gè)被修飾了的稀有氨基酸組成的環(huán)肽，可能不是基因編碼的直接產(chǎn)物，而是經(jīng)過加工后的次級(jí)產(chǎn)物，要克隆毒素的基因是復(fù)雜而困難的；④目前毒素的化學(xué)合成品幾乎沒有活性。因此，至今國內(nèi)外還沒有一種能規(guī)?；_發(fā)的毒素產(chǎn)品，現(xiàn)作為生化試劑的肽類毒素依然價(jià)格昂貴(10多年前每克在10萬美元左右一陳作紅等，1999)，難以滿足科研和應(yīng)用所需。
[0006]本發(fā)明在小豹斑鵝膏純培養(yǎng)技術(shù)有明顯突破的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)菌絲毒素產(chǎn)量低的問題進(jìn)行了重點(diǎn)研究和攻關(guān)，使菌絲體的鵝膏毒肽產(chǎn)量明顯提高，為鵝膏毒素的可持續(xù)性開發(fā)利用等奠定了重要基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，提供一種簡單、易實(shí)現(xiàn)、成本不高，能使鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力明顯增強(qiáng)的方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是，結(jié)合培養(yǎng)方式的改變及特殊物質(zhì)的添加，以共同提高菌絲體的產(chǎn)毒能力，主要按以下方式實(shí)現(xiàn):將經(jīng)過固體培養(yǎng)誘導(dǎo)并擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中同時(shí)加入復(fù)合氨基酸及微量的子實(shí)體干粉，可使菌絲體的產(chǎn)毒能力提高5.5~7.2倍；
所述菌絲體的固體誘導(dǎo)及擴(kuò)繁方法如下:在云南武定獅子山，采摘生長健狀、未完全開傘的幼嫩子實(shí)體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.3cm2大小，嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO40.50g/L,NH4NO3 0.35g/L、KN03 0.35g/L、維生素 B1 0.10mg/L、16.0 波美的麥芽汁 180ml、瓊月旨10.0Og/L,控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在23~24°C下暗培養(yǎng)40~45天，組織塊隆起，表面長出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將菌絲在固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)繁8~10代，每代培養(yǎng)48~55天后，擴(kuò)繁的菌絲及培養(yǎng)基中α-鵝膏毒肽總含量平均為420±25Pg/g.，其所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4
0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉40~50 g/L、16.0波美的麥芽汁180ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ;
所述擴(kuò)大培養(yǎng)基中，腐熟滇青R葉子粉的制備方法如下:武定獅子山收集滇青R葉子，帶回實(shí)驗(yàn)用地，按4:1~5:1的比例與豬糞拌勻，按葉子重量的0.5~1.0%加入尿素，混勻，加水至葉子濕透，上面覆蓋遮陰網(wǎng)，前I個(gè)月每隔4~5天揭開遮陰網(wǎng)，里外翻勻，加水濕透，然后再靜止發(fā)酵2~3個(gè)月，其間，看情況10~15天補(bǔ)水一次，90~120天后，將已腐熟的葉子攤開，曬干，粉碎，過80目分樣篩即可；
所述液體培養(yǎng)方法如下:將經(jīng)過固體平板培養(yǎng)的菌絲體，用直徑為6_的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，轉(zhuǎn)入含100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，每瓶接種6塊，置于轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為24°C的搖床上培養(yǎng)，其所述的液體培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青網(wǎng)葉子粉水提液200~250 ml/L、16.0波美的麥芽汁180ml，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，其中，腐熟滇青岡葉子粉水提液的制備方法如下:取以上腐熟滇青R葉子粉100g，加入800~1000ml蒸餾水，加熱煮沸I~1.5hr,過濾,濾液加熱濃縮成200~250ml ；
所述的復(fù)合氨基酸組成為谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸，四種氨基酸的加入量分別為谷氨酸0.40~0.60g/L,甘氨酸1.00~1.20g/L,丙氨酸1.00~1.20g/L,異亮氨酸
0.50 ~0.60g/L ；
所述子實(shí)體干粉的加入方法如下:將小豹斑鵝膏子實(shí)體在50~60°C下烘干，粉碎，按
0.005~0.008g/L的量加入到液體培養(yǎng)基中。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:直接在液體培養(yǎng)基中，添加少量特殊物質(zhì)，即可使菌絲的產(chǎn)毒能力明顯提高，其特點(diǎn)如下:
(I)操作簡單易實(shí)現(xiàn):將固體擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，直接在液體培養(yǎng)基中添加少量特殊物質(zhì)，常規(guī)培養(yǎng)即可；(2)周期比較短:相對(duì)于前期的固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)的時(shí)間縮短了近2倍；
(3)生產(chǎn)成本不高；本發(fā)明液體培養(yǎng)基中所添加的特殊物質(zhì)，為常見及普通的四種氨基酸，材料易得，價(jià)格便宜，小豹斑鵝膏子實(shí)體用量很微小，其野外采摘及貯備容易滿足規(guī)?；a(chǎn)所需,不會(huì)影響生產(chǎn)成本；
(4)效益明顯、生態(tài):毒素產(chǎn)量明顯提高，這種生物轉(zhuǎn)化比化學(xué)合成直接、有效，且有很好的生態(tài)優(yōu)勢及潛力，值得推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下的實(shí)施例子是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0011]實(shí)例一:
菌絲體的誘導(dǎo)及擴(kuò)繁:在云南武定獅子山，采摘生長健狀、未完全開傘的幼嫩子實(shí)體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.3cm2大小，嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、NH4NO3
0.35g/L、KNO3 0.35g/L、維生素 B1 0.10mg/L、16.0 波美的麥芽汁 180ml、瓊脂 10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在23~24°C下暗培養(yǎng)40天，組織塊隆起，表面長出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將菌絲在固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)繁8代，每代培養(yǎng)48天后，擴(kuò)繁的菌絲及培養(yǎng)基中α-鵝膏毒肽總含量平均為420±25Pg/g.其所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉40 g/L、16.0波美的麥芽汁180ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ；
腐熟滇青R葉子粉的制備方法如下:武定獅子山收集滇青R葉子，帶回實(shí)驗(yàn)用地，按5:1的比例與豬糞拌勻，按葉子重量的1.0%加入尿素，混勻，加水至葉子濕透，上面覆蓋遮陰網(wǎng)，前I個(gè)月每隔4天揭開遮陰網(wǎng)，`里外翻勻，加水濕透，然后再靜止發(fā)酵2個(gè)月，其間，10天補(bǔ)水一次，90天后，將已腐熟的葉子攤開，曬干，粉碎，過80目分樣篩即可；
將經(jīng)過固體培養(yǎng)誘導(dǎo)并已擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)方法如下:將經(jīng)過固體平板培養(yǎng)的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，轉(zhuǎn)入含100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，每瓶接種6塊，置于轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為24°C的搖床上培養(yǎng)，其所述的液體培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2
1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉水提液200 ml/L、16.0波美的麥芽汁180ml，補(bǔ)充谷氨酸0.40g/L、甘氨酸1.00g/L、丙氨酸1.00g/L、異亮氨酸0.50g/L、小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉0.005g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，其中，腐熟滇青岡葉子粉水提液的制備方法如下:將以上腐熟滇青R葉子粉100g，加入800ml蒸餾水，加熱煮沸l(wèi)hr，過濾，濾液加熱濃縮成200ml ;小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉的準(zhǔn)備方法如下:將子實(shí)體在50°C下烘干，粉碎，過120目分樣篩。
[0012]實(shí)例二:
菌絲體的誘導(dǎo)及擴(kuò)繁:在云南武定獅子山，采摘生長健狀、未完全開傘的幼嫩子實(shí)體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.3cm2大小，嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、NH4NO3
0.35g/L、KNO3 0.35g/L、維生素 B1 0.10mg/L、16.0 波美的麥芽汁 180ml、瓊脂 10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在23~24°C下暗培養(yǎng)45天，組織塊隆起，表面長出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將菌絲在固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)繁10代，每代培養(yǎng)55天后，擴(kuò)繁的菌絲及培養(yǎng)基中α-鵝膏毒肽總含量平均為420±15Pg/g.其所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉
50g/L、16.0波美的麥芽汁180ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ；
腐熟滇青R葉子粉的制備方法如下:武定獅子山收集滇青R葉子，帶回實(shí)驗(yàn)用地，按4:1的比例與豬糞拌勻，按葉子重量的0.5%加入尿素，混勻，加水至葉子濕透，上面覆蓋遮陰網(wǎng)，前I個(gè)月每隔5天揭開遮陰網(wǎng)，里外翻勻，加水濕透，然后再靜止發(fā)酵3個(gè)月，其間，15天補(bǔ)水一次，120天后，將已腐熟的葉子攤開，曬干，粉碎，過80目分樣篩即可；
將經(jīng)過固體培養(yǎng)誘導(dǎo)并已擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)方法如下:將經(jīng)過固體平板培養(yǎng)的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，轉(zhuǎn)入含100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，每瓶接種6塊，置于轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為24°C的搖床上培養(yǎng)，其所述的液體培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2
1.00g/L、KH2P04 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉水提液250ml/L、16.0波美的麥芽汁180ml，補(bǔ)充谷氨酸0.60g/L、甘氨酸1.20g/L、丙氨酸1.20g/L、異亮氨酸0.60g/L、小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉0.008g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，其中，腐熟滇青岡葉子粉水提液的制備方法如下:將以上腐熟滇青R葉子粉100g，加入1000ml蒸餾水，加熱煮沸1.5hr，過濾，濾液加熱濃縮成250ml ;小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉的準(zhǔn)備方法如下:將子實(shí)體在60°C下烘干，粉碎，過120目分樣篩。
[0013]實(shí)例 三:
菌絲體的誘導(dǎo)及擴(kuò)繁:在云南武定獅子山，采摘生長健狀、未完全開傘的幼嫩子實(shí)體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.3cm2大小，嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、NH4NO3
0.35g/L、KNO3 0.35g/L、維生素 B1 0.10mg/L、16.0 波美的麥芽汁 180ml、瓊脂 10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在23~24°C下暗培養(yǎng)43天，組織塊隆起，表面長出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將菌絲在固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)繁9代，每代培養(yǎng)50天后，擴(kuò)繁的菌絲及培養(yǎng)基中α-鵝膏毒肽總含量平均為420±l(^g/g.其所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉45g/L、16.0波美的麥芽汁180ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ；
腐熟滇青R葉子粉的制備方法如下:武定獅子山收集滇青R葉子，帶回實(shí)驗(yàn)用地，按
4:1的比例與豬糞拌勻，按葉子重量的0.8%加入尿素，混勻，加水至葉子濕透，上面覆蓋遮陰網(wǎng)，前I個(gè)月每隔5天揭開遮陰網(wǎng)，里外翻勻，加水濕透，然后再靜止發(fā)酵2.5個(gè)月，其間，15天補(bǔ)水一次，100天后，將已腐熟的葉子攤開，曬干，粉碎，過80目分樣篩即可；
將經(jīng)過固體培養(yǎng)誘導(dǎo)并已擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)方法如下:將經(jīng)過固體平板培養(yǎng)的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，轉(zhuǎn)入含100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，每瓶接種6塊，置于轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為24°C的搖床上培養(yǎng)，其所述的液體培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2
1.00g/L、KH2P04 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉水提液230ml/L、16.0波美的麥芽汁180ml，補(bǔ)充谷氨酸0.50g/L、甘氨酸1.10g/L、丙氨酸1.10g/L、異亮氨酸0.55g/L、小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉0.007g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，其中，腐熟滇青岡葉子粉水提液的制備方法如下:將以上腐熟滇青R葉子粉100g，加入900ml蒸餾水，加熱煮沸1.5hr，過濾，濾液加熱濃縮成230ml ;小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉的準(zhǔn)備方法如下:將子實(shí)體在55°C下烘干，粉碎，過120目分樣篩。
[0014]實(shí)例四:
菌絲體的誘導(dǎo)及擴(kuò)繁:在云南武定獅子山，采摘生長健狀、未完全開傘的幼嫩子實(shí)體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.3cm2大小，嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO3 0.35g/L、維生素 B1 0.10mg/L、16.0 波美的麥芽汁 180ml、瓊脂 10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在23~24°C下暗培養(yǎng)44天，組織塊隆起，表面長出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將菌絲在固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)繁9代，每代培養(yǎng)53天后，擴(kuò)繁的菌絲及培養(yǎng)基中α-鵝膏毒肽總含量平均為420±2(^g/g.其所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉48g/L、16.0波美的麥芽汁180ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ；
腐熟滇青R葉子粉的制備方法如下:武定獅子山收集滇青R葉子，帶回實(shí)驗(yàn)用地，按
5:1的比例與豬糞拌勻，按葉子重量的0.65%加入尿素，混勻，加水至葉子濕透，上面覆蓋遮陰網(wǎng)，前I個(gè)月每隔5天揭開遮陰網(wǎng)，里外翻勻，加水濕透，然后再靜止發(fā)酵2個(gè)月，其間，13天補(bǔ)水一次，110天后，將已腐熟的葉子攤開，曬干，粉碎，過80目分樣篩即可；
將經(jīng)過固體培養(yǎng)誘導(dǎo)并已擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)方法如下:將經(jīng)過固體平板培養(yǎng)的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，轉(zhuǎn)入含100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，每瓶接種6塊，置于轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為24°C的搖床上培養(yǎng)，其所述的液體培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2
1.00g/L、KH2P04 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉水提液220ml/L、16.0波美的麥芽汁180ml，補(bǔ)充谷氨酸0.55g/L、甘氨酸1.15g/L、丙氨酸1.15g/L、異亮氨酸0.58g/L、小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉0.006g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，其中，腐熟滇青岡葉子粉水提液的制備方法如下:將以上腐熟滇青R葉子粉100g，加入850ml蒸餾水，加熱煮沸1.2hr，過濾，濾液加熱濃縮成220ml ;小豹斑鵝膏子實(shí)體干粉的準(zhǔn)備方法如下:將子實(shí)體在58°C下烘干，粉碎，過120目分樣篩。
【權(quán)利要求】
1.一種提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法，其特征為，將經(jīng)過固體培養(yǎng)誘導(dǎo)并擴(kuò)繁的菌絲體，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中同時(shí)加入復(fù)合氨基酸及微量的子實(shí)體干粉，培養(yǎng)25~28天，菌絲產(chǎn)生的α -鵝膏毒肽總量為2330~3015Pg/g.干重，為固體培養(yǎng)時(shí)的5.5~7.2倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法,其特征為,菌絲體的誘導(dǎo)及擴(kuò)繁方法如下:在云南武定獅子山，采摘生長健狀、未完全開傘的幼嫩子實(shí)體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.3cm2大小，嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、NH4NO3.0.35g/L、KNO3 0.35g/L、維生素 B1 0.10mg/L、16.0 波美的麥芽汁 180ml、瓊脂 10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在23~24°C下暗培養(yǎng)40~45天，組織塊隆起，表面長出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將菌絲在固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)繁8~10代，每代培養(yǎng)48~55天后，擴(kuò)繁的菌絲及培養(yǎng)基中α-鵝膏毒肽總含量平均為420±25Pg/g.，其所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g/L、KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉40~50g/L、16.0波美的麥芽汁180ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為.5.6o
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌絲體擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征為，擴(kuò)大培養(yǎng)基中，腐熟滇青岡葉子粉的制備方法如下:在武定獅子山收集滇青岡葉子，帶回實(shí)驗(yàn)用地，按4:1~5:1的比例與豬糞拌勻，按葉子重量的0.5~1.0%加入尿素，混勻，加水至葉子濕透，上面覆蓋遮陰網(wǎng)，前I個(gè)月每隔4~5天揭開遮陰網(wǎng)，里外翻勻，加水濕透，然后再靜止發(fā)酵2~3個(gè)月，其間，看情況10~15天補(bǔ)水一次,90~120天后,將已腐熟的葉子攤開，曬干,粉碎,過80目分樣篩即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法，其特征為，液體培養(yǎng)方法如下:將經(jīng)過固體平板培養(yǎng)的菌絲體，用直徑為6_的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，轉(zhuǎn)入含100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，每瓶接種6塊，置于轉(zhuǎn)速為150r/min、溫度為24°C的搖床上培養(yǎng)，其所述的液體培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g/L,KH2PO4 0.50g/L、腐熟滇青岡葉子粉水提液 200 ~250 ml/L、16.0波美的麥芽汁180ml，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，其中，腐熟滇青岡葉子粉水提液的制備方法如下:取權(quán)利要求3中的腐熟滇青R葉子粉100g，加入800~1000ml蒸餾水，加熱煮沸I~1.5hr,過濾,濾液加熱濃縮成200~250ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法，其特征為，所述的復(fù)合氨基酸組成為谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸，四種氨基酸的加入量分別為谷氨酸.0.40 ~0.60g/L,甘氨酸 1.00 ~1.20g/L,丙氨酸 1.00 ~1.20g/L,異亮氨酸 0.50 ~0.60g/L0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高小豹斑鵝膏菌絲體產(chǎn)毒能力的方法，其特征為，子實(shí)體干粉的加入方法如下:將小豹斑鵝膏子實(shí)體在50~60°C下烘干，粉碎，過120目分樣篩，按.0.005~0.008g/L的量加入到液體培養(yǎng)基中。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103627757SQ201310630187
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】李宗菊, 馮遼遼, 張曦予, 趙昱, 左奎, 程霞, 唐萍 申請(qǐng)人:云南大學(xué)