一種利用浮萍原料制備l-乳酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用浮萍原料制備L-乳酸的方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)和生物質(zhì)能源領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)加入中溫α-淀粉酶和糖化酶使浮萍糖化，獲得發(fā)酵菌種所需的碳源，浮萍自身含有的蛋白質(zhì)則可作為氮源，滅菌后即可作為發(fā)酵培養(yǎng)基；利用MRS培養(yǎng)基制備液體種子培養(yǎng)基，然后接種斜面保藏的產(chǎn)乳酸細(xì)菌，通過(guò)二級(jí)擴(kuò)繁得到液體種子；向裝有預(yù)處理好的浮萍細(xì)胞液發(fā)酵罐中接種體積比為6%的液體種子，通過(guò)靜態(tài)發(fā)酵得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明生產(chǎn)的L-乳酸具有環(huán)境友好的特點(diǎn)，不僅不會(huì)導(dǎo)致大氣中CO2的凈增加，也就不會(huì)引起溫室效應(yīng)。而且還可以和污水治理協(xié)同進(jìn)行。作為非糧作物的L-乳酸發(fā)酵的替代法又可以緩解世界范圍內(nèi)又面臨著糧食短缺的緊張局面。
【專利說(shuō)明】一種利用浮萍原料制備L-乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用浮萍原料制備L-乳酸的方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)和生物質(zhì)能源領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002]乳酸(LacticAcid)是三大有機(jī)酸之一，又名為α -羥基丙酸(a -hydroxypropanoic acid),根據(jù)旋光性的不同,可分為D-型和L-型兩種旋光異構(gòu)體，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品和環(huán)保等領(lǐng)域。而由于人體中僅存在代謝L-型乳酸的酶類，故體內(nèi)的D-乳酸或DL-乳酸超過(guò)一定量的話，將會(huì)導(dǎo)致二者因無(wú)法代謝掉而引起人體代謝功能紊亂甚至中毒?；诖?，L-乳酸在實(shí)際應(yīng)用中擁有廣闊的前景(周愛(ài)軍，李長(zhǎng)存，黎樹根，舒迪，楊麗欣.聚乳酸產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與合成技術(shù)研究進(jìn)展.化學(xué)與生物工程，2013，30(4):18-21.)0近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的日益加重，開(kāi)發(fā)可降解新型材料已經(jīng)是大勢(shì)所趨，而L-乳酸因具有很好的生物相容性和可生物降解，利用它來(lái)生產(chǎn)可降解生物塑料-聚乳酸(PLA)已經(jīng)得到全世界的廣泛親睞，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界塑料產(chǎn)品的年總消費(fèi)量已超過(guò)3億t，我國(guó)為3500萬(wàn)t以上，而如果10年~20年后替代石油基聚合物的消費(fèi)量按10%計(jì)，世界聚乳酸需求量每年將達(dá)3000萬(wàn)t以上，具有廣闊的發(fā)展前景。而目前L-乳酸的生產(chǎn)主要依靠淀粉類發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)，其原料又主要集中在玉米、馬鈴薯等糧食作物上，而目前世界范圍內(nèi)又面臨著糧食短缺的緊張局面，因此尋求非糧作物的L-乳酸發(fā)酵已經(jīng)迫在眉急。而目前關(guān)于利用浮萍為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-型乳酸的研究還沒(méi)有報(bào)道。
[0003]浮萍(duckweed)為單子葉水生植物，共有4屬(Lemna、Spirodela、Wolffia和ffolffiella)40個(gè)種，常用于污染水體的凈化，這主要是源于它可以通過(guò)根或葉狀體從水中吸收所需的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供自身生長(zhǎng)，同時(shí)達(dá)到凈化水體的目的。浮萍的營(yíng)養(yǎng)成分也非常豐富，富含蛋白質(zhì)，纖維含量低，淀粉含量在25%左右，個(gè)別浮萍種的蛋白含量高達(dá)75%(Klass D L.Duckweed Plants for ffaste-water Reuse and Biomass Production [M].Chicago:1nstitute of Gas Technology, 1993:423-432.)。特別是用于L_型乳酸發(fā)酵的乳酸菌自身合成B族維生素和氨基酸的能力有限，因此它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求也很高(葛向陽(yáng).菊芋發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究.江南大學(xué)2009屆博士學(xué)位論文，6-8.)，而浮萍富含蛋白，可以極大地滿足它對(duì)氨基酸的需求。有研究表明，在四川地區(qū)，利用浮萍凈化豬糞廢水，若接種量適宜，其淀粉含量可高達(dá)40%左右，以少根紫萍為例，每公頃每年大約能生產(chǎn)淀粉11.4t (趙昭，姚廣保，張藝瓊，趙玄.豬場(chǎng)污水中浮萍生物量和淀粉含量變化研究.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，49 (3):693-698)?？梢?jiàn)，將它作為生物能源的原料會(huì)有著很大的潛力。目前關(guān)于利用浮萍制備燃料乙醇、丁醇和生物柴油的報(bào)道已經(jīng)有較多報(bào)道，但是利用它為原料發(fā)酵產(chǎn)L-型乳酸的研究并未出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用浮萍原料制備L-乳酸的方法，該方法采用非糧食物質(zhì)發(fā)酵、廢水資源化、環(huán)保。
[0005]技術(shù)解決方案
[0006]方法步驟如下:
[0007]I)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:浮萍淀粉濃度保持在24_30g/L，酵母粉20_25g/L，CaCO3濃度保持在5-8% ；
[0008]2)發(fā)酵培養(yǎng)基的糖化:在溶液PH值為6.5時(shí)，先用中溫α -淀粉酶降解淀粉粒，滅活多余的酶活性后，再調(diào)節(jié)溶液PH值至4.5，再通糖化酶使其充分降解，糖化完成后以100°C滅活酶活性；
[0009]3)種子發(fā)酵液的制備:先用接種環(huán)將干酪乳桿菌株Lactobacillus casei目的菌種接種到100ml MRS液體培養(yǎng)基中，于30°C、150r/min —級(jí)搖瓶培養(yǎng)12h后，再進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后即得到液態(tài)種子；
[0010]4)按5 — 10%(V:V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min條件下于發(fā)酵36h-72h后，制備出L-乳酸。
[0011]本發(fā)明主要是針對(duì)氮、磷污水凈化過(guò)程中產(chǎn)生的大量浮萍資源進(jìn)行可再生能源的利用，利用浮萍這類可再生 資源為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，不僅不會(huì)導(dǎo)致大氣中CO2的凈增加，也就不會(huì)引起溫室效應(yīng)，而且還可以和污水治理協(xié)同進(jìn)行，因此，利用該技術(shù)具有廣闊的前
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【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下將結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
[0014]這里DNS法的原理在于:淀粉是多糖的一種，它水解后可產(chǎn)生多種還原糖，在堿性條件下它們能與二硝基水楊酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成的產(chǎn)物3-氨基-5-硝基水楊酸在沸水浴條件下呈現(xiàn)出棕紅色，且在特定的范圍內(nèi)，該產(chǎn)物的顏色深淺與還原糖的量成正比。
[0015]乳酸含量的測(cè)定采用間接法來(lái)完成。其原理是基于絡(luò)合反應(yīng)，用過(guò)量CaCO3和發(fā)酵液中的乳酸發(fā)生反應(yīng)形成乳酸鈣〔(CH3CHOHCOO)2Ca.5H20)后，之后用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定乳酸鈣中所含有的鈣，然后依據(jù)乳酸與鈣定量反應(yīng)的關(guān)系，來(lái)間接計(jì)算出乳酸含量。
[0016]離子交換法中所用的交換柱是732和711，這兩類樹脂經(jīng)過(guò)浸泡和酸堿處理后分別轉(zhuǎn)換成H型(陽(yáng)離子交換柱)和OH型(陰離子交換柱)。離子交換法轉(zhuǎn)酸及除陰離子的原理如下:(1)732陽(yáng)離子交換樹脂具有解鹽的能力，可與乳酸?丐進(jìn) fi"反應(yīng)，BP 2R-SO；,H + Cii (CHsCHOHCOOh^ (R-SOi)2Ca +2CH:;CHOHCOOH:
(2)711陰離子交換樹脂除S042_等陰離子的反應(yīng)為:2RN (C1-K)iOH + SO42^: RN
(CH.； )3) 2 SO42'+ 20H': RN (CH:;),OH + Cl"-RN (CH；,):; Cl"十OIT
[0017]種子制備:乳酸菌菌種選取干酪乳桿菌株Lactobacillus casei,利用MRS培養(yǎng)基接種干酪乳桿菌后制備液體種子；[0018]MRS培養(yǎng)基包括下列原料，按質(zhì)量比:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨 2.0g，葡萄糖 20.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20)2.0g，硫酸鎂(MgSO4.7Η20) 0.58g，硫酸錳(MnSO4.Η20) 0.25g ;將上述原料與吐溫 80 1.0mL混合，將混合后的物料用蒸餾水定容至lOOOmL，pH6.2~6.6，最后用高壓鍋在115°C滅菌30min備用；
[0019]采用二級(jí)培養(yǎng):先用接種環(huán)將目的菌種干酪乳桿菌株接種到100ml MRS液體培養(yǎng)基中，于30°C、150r/min 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)12h后，再進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后即得到液態(tài)種子。
[0020]浮萍淀粉糖化液的制備:將浮萍干燥粉碎后過(guò)60目篩，利用pH值為6.5的磷酸緩沖液將其調(diào)制成質(zhì)量體積比濃度為1:9的懸濁液，先用中溫α -淀粉酶降解淀粉粒，制備成淀粉酶解液，為了保證酶解效果，向制備成的物料中加入質(zhì)量體積濃度為0.2%的CaCl2，將溫度升至60°C液化，直至碘液測(cè)試結(jié)果呈棕橙色，然后再加熱煮沸10分鐘，滅活酶活性；待液化液冷卻后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4.5，接著繼續(xù)加入糖化酶使其充分降解，糖化完成后以100°C滅活酶活性，從而制備出發(fā)酵所需的糖化液，最后利用DNS法(參照陳毓荃主編.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，北京:科學(xué)出版社，2002))測(cè)定其糖的含量。
[0021]具體方法如下:樣品液適當(dāng)稀釋，使糖濃度為0.l-1.0mg/ml，取稀釋后的糖液
1.0ml于15ml刻度試管中，加DNS試劑2.0ml，沸水煮沸2min，冷卻后用水補(bǔ)足到15ml刻度，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖mg/ml數(shù)。求出樣品中糖含量。
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:根據(jù)上一步測(cè)得的糖質(zhì)量體積濃度，使浮萍淀粉質(zhì)量體積比濃度保持在24g/L，酵母粉20g/L，CaC038%，然后按5_10%(V:V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min條件下于發(fā)酵36h_72h后，利用EDTA滴定法測(cè)定乳酸鈣含量(參照孫靚，孫菲菲，黃艷燕，盧福芝，黃日波.木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)條件優(yōu)化.中國(guó)釀造，2009，7:33-37)，進(jìn)而計(jì)算出乳酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
`[0023]具體方法如下:取發(fā)酵液2mL,8000r/min離心5min,取上清液ImL于IOOmL蒸懼水中，加入1.0moI/L的NaOHlOmL,加鈣指示劑2滴，用0.05mol/LNa2EDTA試劑滴定，終點(diǎn)為溶液顏色變?yōu)榧兯{(lán)色。由Na2EDTA體積計(jì)算乳酸鈣和乳酸的含量。
[0024]乳酸鈣含量:WCaL2=218.2c X V (mg)
[0025]L-乳酸含量:WLa=180c X V (g/L)
[0026]式中:V表示滴定消耗Na2EDTA的量，mL ；c表示Na2EDTA的濃度，mol/L。
[0027]L-乳酸提取:采用離子交換法從發(fā)酵液中分離純化L-乳酸。
[0028]實(shí)施例1
[0029]取8g浮萍粉(淀粉含量30%，蛋白質(zhì)含量15%)、4.8g CaCO3置于250ml的三角瓶中加入47.2ml的蒸餾水，分別用中溫α -淀粉酶和糖化酶使其糖化后，115°C滅菌20分鐘，然后按6%(V:V)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min條件下于靜態(tài)發(fā)酵48h后，利用EDTA滴定法測(cè)定乳酸鈣含量，最后通過(guò)離子交換法分離純化出乳酸，并對(duì)其進(jìn)行定量。
[0030]實(shí)施例2
[0031]取8g浮萍粉(淀粉含量30%，蛋白質(zhì)含量15%)、酵母粉1.2g置于250ml的三角瓶中，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至6.3，加入46ml的蒸餾水，并向制備成的物料中加入質(zhì)量體積濃度為0.2%的CaCl2以保證酶解效果，接著分別用中溫α -淀粉酶和糖化酶使其糖化后，115° C滅菌30分鐘，最后向其中加入經(jīng)過(guò)干熱滅菌的CaC034.8g，然后按8%(V: V)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min條件下于靜態(tài)發(fā)酵72h后，利用EDTA滴定法測(cè)定乳酸鈣含量，最后通過(guò)離子交換法分離純化出乳酸，并對(duì)其進(jìn)行定量。
【權(quán)利要求】
1.一種利用浮萍原料制備L-乳酸的方法，其特征在于，方法步驟如下: O發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:浮萍淀粉濃度保持在24-30g/L，酵母粉20-25g/L ； 2)發(fā)酵培養(yǎng)基的糖化:在溶液PH值為6.5時(shí)，先用中溫α -淀粉酶降解淀粉粒，滅活多余的酶活性后，再調(diào)節(jié)溶液PH值至4.5，再通糖化酶使其充分降解，糖化完成后以100°C滅活酶活性； 3)種子發(fā)酵液的制備:先用接種環(huán)將干酪乳桿菌株Lactobacilluscasei目的菌種接種到100ml MRS液體培養(yǎng)基中，于30°C、150r/min —級(jí)搖瓶培養(yǎng)12h后，再進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后即得到液態(tài)種子； 4)按5-10%(V:V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min條件下于發(fā)酵36h-72h后，制備出L-乳酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用浮萍原料制備L-乳酸的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基還包括質(zhì)量濃度為5-8%的CaCO3。
【文檔編號(hào)】C12P7/56GK103614423SQ201310626363
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】潘建剛, 蔡祿, 張艾艾, 常亞, 時(shí)陪福 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古科技大學(xué)