一株對田間抗Bt小菜蛾有高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株對田間抗Bt小菜蛾有高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株BacillusthuringiensisAHB-5及應(yīng)用，保藏號：CGMCC?No.8444，該菌攜帶有殺蟲蛋白編碼基因cry1Ac、cry2Ab和cry9Ea。該菌株以相對敏感小菜蛾、田間抗Bt小菜蛾、田間抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾為試蟲，經(jīng)毒力生物測定篩選對抗Bt及Cry1Ac毒蛋白小菜蛾有毒力的菌株。利用該菌株生產(chǎn)高效、廣譜的殺蟲劑，用于防治鱗翅目重要害蟲小菜蛾，同時對抗性害蟲具有很好的效果，有利于田間抗性小菜蛾的防治，提高了經(jīng)濟價值，且對人、畜及其他動物無害，不污染環(huán)境，具有良好經(jīng)濟、生態(tài)效益，具有良好的應(yīng)用推廣前景。
【專利說明】一株對田間抗Bt小菜蛾有高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株對田間抗Bt小菜蛾有高活性的蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis AHB-5菌株，以及該菌株在防治鱗翅目害蟲或/和抗Bt鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽孢桿菌(Zfeci77tts從簡稱Bt)是一種從土壤或死亡昆蟲體內(nèi)分離出來的革蘭氏陽性細(xì)菌。此類菌在芽孢形成時期產(chǎn)生一種或多種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs,又被稱為S -內(nèi)毒素)，可對鱗翅目、鞘翅目、半翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、毛翅目、脈翅目、蚤目、纓翅目、食毛目、蜚蠊目、螨類、虱目、吸蟲、絳蟲、鞭毛蟲、變形蟲和草履蟲等多種昆蟲及原生生物產(chǎn)生毒素活性。這種殺蟲晶體蛋白對人畜無害，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。該菌菌劑作為噴灑型殺蟲劑主要成分的使用時間已經(jīng)超過50年，是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的90% -95%。
[0003]蘇云金芽孢桿菌的不同殺蟲毒素由不同種類的cry基因控制，各種cry基因已經(jīng)被成功克隆，并根據(jù)不同需要，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入到不同作物中，用于害蟲等有害生物的防治。我國最早用于防治小菜蛾的Bt菌是庫斯塔克亞種(B.thuringiensis var.kurstaki),其主效成分是ciyiAc基因。目前已發(fā)現(xiàn)對小菜蛾P(guān)lutella xylostella (L.)有毒力的基因有:crylAa、cry IAb、cry IAc、cry IB、cry 1C、cry IF、cry2A、cry I1、cry7Bal 和
部分基因已在我國應(yīng)用。自1996年轉(zhuǎn)Bt cry基因作物的種植開始，轉(zhuǎn)Bt基因作物在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，種植面積逐年增長。據(jù)2012年的統(tǒng)計顯示，轉(zhuǎn)Bt基因作物的種植面積已增長至17，030萬公頃。
[0004]蘇云金芽孢桿菌菌劑的應(yīng)用及轉(zhuǎn)Bt cry基因作物的種植，在控制田間害蟲方面效果顯著，有利于作物的產(chǎn)量和質(zhì)量的提高，同時減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護發(fā)揮了積極的作用。然而蘇云金芽孢桿菌制劑和轉(zhuǎn)Bt基因作物廣泛應(yīng)用，也使得部分害蟲對Bt產(chǎn)生了一定抗性。目前在田間，已有3種害蟲(草地貪夜蛾分o而frugiperda、玉肩^客較嫌Jiusseola fusca、谷實敦^tHelicoverpa zea)對Bt 作物產(chǎn)生了抗性；溫室中粉紋夜蛾也已對Bt制劑產(chǎn)生抗性，但小菜蛾是最早在田間對Bt制劑產(chǎn)生抗藥性的害蟲。從田間采集 并結(jié)合室內(nèi)的繼續(xù)抗性篩選得到了害蟲抗性品系，而且目前田間抗性水平仍在繼續(xù)發(fā)展。
[0005]1985年McGaughey報道利用Bt粉劑在實驗室對印度谷螟in terpunc tel la進行抗性篩選得到抗Bt種群，隨后國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)報道鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等十余種害蟲室內(nèi)選育也可以使其對Bt產(chǎn)生抗性。目前大多數(shù)抗性品系昆蟲都是通過實驗室的篩選獲得，實驗室篩選的抗性品種通?；蜃兓鄬τ邢蓿荒芎w所有在大田中出現(xiàn)的抗性基因的可能。Tabashnik等于1989年檢測到田間種群對Bt制劑(kurstaki亞種)產(chǎn)生了 25倍的抗藥性，首次報道了田間小菜蛾對Bt殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。Tang等測定弗羅里達(dá)州田間小菜蛾對Bt制劑(BtK NRD12)的抗藥性大于1500倍。Wright等報道馬來西亞田間小菜蛾種群在室內(nèi)篩選飼養(yǎng)7代后對BtA和BtK制劑的抗藥性分別為330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等國家和地區(qū)也有抗Bt小菜蛾的報道。2000年Zhao等報道從美國南卡羅尼那州田間采集的對CrylC有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在實驗室先用CrylC原毒素繼續(xù)汰選，然后用表達(dá)高劑量的CrylC毒素的轉(zhuǎn)基因花椰菜汰選，26代后，該品系對CrylC毒素抗性高達(dá)63100倍(2齡幼蟲)。
[0006]國內(nèi)，馮夏等報道深圳、東莞地區(qū)等供港菜區(qū)小菜蛾對Bt的抗藥性為17.2-30.2倍。李建洪等通過對深圳、東莞和廣州菜區(qū)的田間小菜蛾種群檢測，發(fā)現(xiàn)小菜蛾對蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)品Cs3ab-1991的抗藥性倍數(shù)分別為8.9,6.5,2.1倍。周程愛等報道長沙地區(qū)的小菜蛾對Bt的抗藥性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍發(fā)展到2000年的6.2倍的低水平抗藥性。余德億等報道福建地區(qū)田間種群的小菜蛾對湖北Bt和福建Bt的抗藥性分別由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世儉等報道浙江省杭州、蕭山、金華、溫州四地的小菜蛾對Bt制劑還沒有產(chǎn)生抗藥性。王崇利等報道廣東惠州田間小菜蛾種群對CrylAb和CrylAc的抗性達(dá)到了高抗水平；對Btk制劑的抗性達(dá)到了中抗水平；對CrylAa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江蘇南京田間小菜蛾種群對CrylAbXrylAc具有低至中等水平抗性(8_28倍)，對Btk制劑具有低水平抗性(3.5-7倍)。害蟲對Bt抗藥性的產(chǎn)生，是Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中有效性和持效性最大的威脅。 [0007]以上可以看出，小菜蛾對Bt產(chǎn)生的抗性問題已經(jīng)十分突出，因此篩選到對抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害蟲已迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一株對抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌菌株，該菌株對鱗翅目害蟲、抗Bt鱗翅目害蟲、抗CrylAc毒蛋白鱗翅目害蟲及鞘翅目害蟲具有毒殺作用，利用該菌株能開發(fā)一種廣譜、高效且對抗Bt害蟲有效的Bt殺蟲劑。
[0009]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
從非正常飼養(yǎng)小菜蛾幼蟲體內(nèi)分離的一株蘇云金芽孢桿菌。用發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，培養(yǎng)至伴孢晶體脫落。對相對敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾及抗CrylAc毒蛋白小菜蛾進行生物測定，對上述供試害蟲均具有較強殺蟲作用。對菌株進行形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析，分析菌株所含的殺蟲晶體蛋白基因類型。其命名為蘇云金芽孢桿菌thuringiensisAHB-5，簡稱Bt.AHB-5。該菌株于2013年」i月日為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，其保藏號為CGMCC N0.8444，經(jīng)檢測存活。
[0010]本發(fā)明與先有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:本發(fā)明選擇了鱗翅目主要害蟲(小菜蛾)、為靶標(biāo)昆蟲，同時從田間采集對Bt (Kurstaki亞種)粉劑具抗性的小菜蛾種群并繼續(xù)汰選得到高抗的抗Bt小菜蛾種群和對CrylAc毒蛋白具有高抗的抗CrylAc毒蛋白小菜蛾種群，作為祀標(biāo)昆蟲，蘇云金芽孢桿菌thuringiensis AHB-5同時對上述鱗翅目主要害蟲及田間抗Bt及CrylAc毒蛋白害蟲，均具有較強的毒殺作用。含有的殺蟲基因組合不同，不同的Bt菌株所含有的Bt殺蟲Cry蛋白的種類不同，也相應(yīng)的對應(yīng)的殺蟲活性有差別，包括殺蟲譜，本發(fā)明菌株活性較好，對抗CrylAc小菜蛾和抗Bt小菜蛾均有明顯的活性。利用該菌株生產(chǎn)高效、廣譜的殺蟲劑，用于防止鱗翅目重要害蟲小菜蛾，同時對抗性害蟲具有很好的效果，有利于田間抗性小菜蛾的防治，提高了經(jīng)濟價值，且對人、畜及其他動物無害，不污染環(huán)境，具有良好經(jīng)濟、生態(tài)效益，具有良好的應(yīng)用推廣前景。由于Bt粉劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物的廣泛種植，小菜蛾對Bt抗性嚴(yán)重，對抗Bt小菜蛾有效的Bt殺蟲劑產(chǎn)品尚為見報道。
【具體實施方式】
[0011]下面通過【具體實施方式】的詳細(xì)描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
[0012]實施例1菌株分尚與培養(yǎng)
從田間采集的非正常死亡小菜蛾幼蟲進行表面處理，方法如下:用鑷子夾住幼蟲頭部，蘸取95%乙醇灼燒后，放入75%乙醇中2s，再放入3%次氯酸鈉溶液中浸泡3min，取出幼蟲用無菌水清洗3次。將處理好的蟲體放入裝有0.5 ml無菌水的1.5 ml離心管中打碎，制成蟲體懸液。取蟲體懸液0.1ml加入100ml無菌水中，30°C振蕩培養(yǎng)30min，在75_80°C水浴中熱處理14-20min將培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)濃度，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上，置于28_30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)3-4d后,挑選培養(yǎng)特征類似蘇云金桿菌的菌株涂片,用石碳酸復(fù)紅染色鏡檢，觀察有無芽孢和伴孢晶體。
[0013]分離培養(yǎng)基:牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、15~20 g瓊脂、水1000ml，調(diào)pH值至7.0。
[0014]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaClIOgJjC 1000ml，pH 值 7.0。
[0015]4、將產(chǎn)生芽孢和伴孢晶體的菌株檢出純化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，至伴孢晶體脫落；
5、取5ml發(fā)酵液與50 u 1 5%的TritonlOO混合均勻(TritonlOO終濃度為0.05%),采用浸葉法對相對敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗CrylAc毒蛋白小菜蛾進行室內(nèi)毒力測定。具體方法:選老嫩適中的甘藍(lán)葉片洗凈晾干，剪成直徑2cm大小，放入藥液(含TritonlOO終濃度為0.05%)中，浸泡1Os晾干，放入鋪有濕潤濾紙的平皿中。以無菌水混合TritonlOO(TritonlOO終濃度為0.05%)浸泡葉片作為對照。選取2_3齡小菜蛾幼蟲，每個處理10頭，設(shè)4個重復(fù)，置(溫度25°C、相對濕度65%-70%、光照比L:D=16:8)條件下飼養(yǎng)。3d后觀察幼蟲死亡情況，計算死亡率。
[0016]實施例2菌株的鑒定
根據(jù)上述實施方法，得到一株對鱗翅目害蟲、抗Bt鱗翅目害蟲、抗CrylAc毒蛋白鱗翅目害蟲及鞘翅目害蟲具有毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌菌株，命名為Bacillusthuringiensis AHB-5，該菌株于2013年11月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號:CGMCC N0.8444。具體鑒定結(jié)果如下:
1、蘇云金芽孢桿菌AaciJJy1S thuringiensis AHB-5的殺蟲活性:該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至伴孢晶體脫落，對鱗翅目害蟲小菜蛾xylostalla)相對敏感種群的致死中濃度(LC5tl)為2.94mg/L，對鱗翅目害蟲小菜蛾抗Bt種群的致死中濃度(LC5tl)為
.5.61mg/L,對鱗翅目害蟲小菜蛾抗CrylAc毒蛋白種群的致死中濃度(LC5tl)為5.92mg/L。顯示出較強毒殺作用。[0017]2、蘇云金芽孢桿菌抱^77心thuringiensis AHB-5的形態(tài)特征:菌落均呈白色圓形、扁平，表面干燥無光澤，邊緣缺刻；在普通LB平板上能生長，為好氧菌；細(xì)胞桿狀，有鞭毛，革蘭氏染色為陽性，且一個營養(yǎng)細(xì)胞只有一個芽孢，芽孢為中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶體存在。
[0018]3、蘇云金芽孢桿菌thuringiensis AHB-5的生理生化特性:
【權(quán)利要求】
1.一株蘇云金芽抱桿菌 CZfeciJJw1S thuringiensis AHB-5)，保藏號:CGMCC N0.8444。
2.如權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌在防治鱗翅目害蟲或/和抗Bt鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述鱗翅目害蟲是小菜蛾。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述小菜蛾是抗Bt小菜蛾。
【文檔編號】C12R1/07GK103627660SQ201310615455
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】張友軍, 朱勛, 楊峰山, 王少麗, 吳青君, 謝文, 徐寶云 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所