一種用于豬病診斷的三重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，三重同步核酸定性檢測(cè)試劑，三重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)方法。本發(fā)明針對(duì)三種病毒核酸的特異性探針雜交后的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠同時(shí)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒等三種混合感染的常見病原，這種多重驗(yàn)證結(jié)點(diǎn)集成一體化設(shè)計(jì)極大提高了檢測(cè)結(jié)果的特異性與可靠性，本發(fā)明對(duì)原有的多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了調(diào)整，使檢測(cè)效率顯著提高的同時(shí)也降低了檢測(cè)成本。
【專利說明】一種用于豬病診斷的三重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物核酸分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種新技術(shù)的新領(lǐng)域應(yīng)用，SP豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒核酸同步多重連接擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法。 【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫問題成為了近些年國(guó)際社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題,我國(guó)加入WTO已逾十年，考慮到技術(shù)性貿(mào)易壁壘問題與輸入性傳染病風(fēng)險(xiǎn)問題，每年我國(guó)對(duì)大量進(jìn)出口畜牧產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量要求越來越高,要求檢測(cè)項(xiàng)目也越來越多，如各種致病性病原體以及人獸共患病病原體等。同時(shí)為了確保食品衛(wèi)生安全、保護(hù)國(guó)民健康安全，必須加強(qiáng)在源頭上對(duì)畜產(chǎn)品進(jìn)行安全性檢測(cè)。目前應(yīng)用于豬患病毒性傳染病的檢測(cè)方法有以下幾種:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、病毒分離培養(yǎng)鑒定法、電鏡觀察、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等?，F(xiàn)實(shí)中臨床上發(fā)病豬往往以多種病毒混合感染為主，上述方法檢測(cè)通量低成本高，操作不便，不利于同時(shí)多批量多重感染病原體的檢測(cè)。
[0003]多重連接擴(kuò)增技術(shù)(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)由荷蘭的Dr.Schouten JP于2002年發(fā)明，最初僅應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)目的，目前MLPA技術(shù)已應(yīng)用于多種領(lǐng)域的研究及基因診斷，如單核苷酸多態(tài)性(SNP)和基因突變檢測(cè)、染色體數(shù)目異常、遺傳疾病基因缺失重復(fù)、基因甲基化檢測(cè)、抑癌基因診斷及mRNA分析等。由于MLPA操作簡(jiǎn)便、成本低廉、應(yīng)用領(lǐng)域廣，這幾年來，已有超過上百篇的研究報(bào)告發(fā)表，但是在動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用尚無報(bào)道。
[0004]MLPA是將核酸的雜交檢測(cè)和PCR鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)靶分子的高效特異性分析。其核心的技術(shù)是合成序列特異的長(zhǎng)探針和短探針。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴(kuò)增的通用引物，一段是病毒序列特異的探針。長(zhǎng)探針由三段核苷酸組成，除了 PCR擴(kuò)增的通用引物互補(bǔ)序列和病毒特異性序列外，在兩者之間還加入特定大小的填充序列(指紋序列)。當(dāng)MLPA的兩種探針結(jié)合到彼此相鄰的靶序列上的時(shí)候，在連接反應(yīng)時(shí)，長(zhǎng)探針就和短探針發(fā)生連接，生成一條兩端分別含有上下游通用引物的全長(zhǎng)探針，并在通用引物的擴(kuò)增之下，使模板成鏈?zhǔn)椒糯?，?shí)現(xiàn)靶分子的高靈敏度檢測(cè)，其檢測(cè)極限可達(dá)3000-6000個(gè)靶分子拷貝。
[0005]MLPA并不是擴(kuò)增病毒特異的靶序列，而是擴(kuò)增與病毒靶序列結(jié)合的探針，換句話說，首先是給每種病毒特異的探針加入特定大小的指紋序列，然后通過通用引物將不同的“指紋”擴(kuò)增表現(xiàn)出來，最后通過對(duì)“指紋”的分析，實(shí)現(xiàn)多種核酸的檢測(cè)，同時(shí)序列特異的兩段探針確保了每種病原的指紋具有高度的特異性。MLPA利用核酸雜交、連接反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以在同一試管內(nèi)檢測(cè)多達(dá)45種不同核酸序列拷貝數(shù)變化。
[0006]該技術(shù)主要包括:探針與靶序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴(kuò)增和結(jié)果的檢測(cè)分析。針對(duì)每一個(gè)待測(cè)靶基因序列，均有一對(duì)MLPA探針，其一般由一個(gè)短的寡核苷酸片段(短探針)和一個(gè)長(zhǎng)的寡核苷酸片段(長(zhǎng)探針)組成。該技術(shù)的特色之一是僅擴(kuò)增連接完好的探針，而不是擴(kuò)增樣本靶序列。該技術(shù)的擴(kuò)增環(huán)節(jié)僅需兩條引物，即通用引物UPl和UP2。在所有短探針的5’端均有一段共同序列，該序列與引物UPl的核酸序列相同；在所有長(zhǎng)探針的3’端均有一段共同序列，該序列與引物UP2的核酸序列互補(bǔ)?？梢?，所有連接探針的PCR擴(kuò)增用的是同一對(duì)引物。若兩探針連接，則擴(kuò)增可進(jìn)行；而若兩探針未連接，則擴(kuò)增無法進(jìn)行。各長(zhǎng)探針在共同序列和與靶序列互補(bǔ)的序列間有不同長(zhǎng)度的填充片段，該片段長(zhǎng)度不同使連接后的MLPA探針長(zhǎng)度不同，故其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度亦不同。一般相臨兩產(chǎn)物的長(zhǎng)度相差6~8bp，因此可同時(shí)檢測(cè)基因組的多種不同靶基因。擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)分析比對(duì)，得出結(jié)論。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能同步檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒核酸的高特異性檢測(cè)方法。所述的多重同步核酸定性檢測(cè)方法的探針為選自以下病毒的特征片段:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬偽狂犬病毒(PRV)0本發(fā)明能夠同時(shí)檢測(cè)三種常見豬混感病毒包括兩種RNA病毒和一種DNA病毒，特異性極高。
[0008]本發(fā)明的一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，包括如下的序列組:
[0009]I)針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因的探針
[0010]左翼探針Probel05L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’
[0011]右翼探針Probel05R:5’TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’
[0012]2)針對(duì)豬瘟病毒E2基因的探針
[0013]左翼探針Probel25L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA 3’
[0014]右翼探針Probel25R:5’ GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3，
[0015]3)針對(duì)豬偽狂犬病毒TK基因的探針
[0016]左翼探針Probel50L:5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCAT 3’
[0017]右翼探針Probel50R:5’ GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3，
[0018]4)通用引物
[0019]正向引物UPl:5' TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT 3'
[0020]反向引物UP2:5' GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA 3'
[0021]所述右翼探針的5’端經(jīng)過磷酸化修飾。
[0022]所述5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT與通用的正向引物UPl序列相同；所述TCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’與通用的反向引物UP2序列反向互補(bǔ)。
[0023]本發(fā)明的一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重同步核酸定性檢測(cè)試劑，包括MLPA雜交液、MLPA連接液、PCR反應(yīng)液、RNA/DNA共提液、RT反應(yīng)液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、探針混合液、通用引物混合液、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理水；
[0024]MLPA 雜交液包括 SALSA MLPA buffer ；
[0025]MLPA 連接液包括 Ligase_65buffer A, Ligase_65buffer B, Ligase-65 連接酶；
[0026]PCR 反應(yīng)液包括 2 X Taq Master Mix ；
[0027]RNA/DNA共提液包括苯酚、8_羥基喹啉、異硫氰酸胍、β -巰基乙醇；
[0028]RT 反應(yīng)液包括 M-MLV5 X Reaction Buffer,200U M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、2000U RNase 抑制劑、IOmM dNTP Mix ；
[0029]陽性對(duì)照品為含1.0X 108COpy/ml濃度的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒基因E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的DNA片段；
[0030]陰性對(duì)照品為不含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的pSURE-Τ重組質(zhì)粒；
[0031]探針混合液為權(quán)利要求1所述的左翼探針、右翼探針；
[0032]通用引物混合液為權(quán)利要求1所述的UPl與UP2的混合液。
[0033]所述PCR 反應(yīng)液是由 Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs 以及 PCR 穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系，濃度為2X，預(yù)配好的PCR混合液中加入了溴芬藍(lán)染料(藍(lán)色)，反應(yīng)結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)；75%乙醇需使用DEPC處理水配制。
[0034]本發(fā)明的一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)方法，有以下步驟:
[0035]1)將疑似已經(jīng)感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的發(fā)病豬或死亡豬尸體內(nèi)的血液、分泌液體以及淋巴結(jié)樣品進(jìn)行核酸提取處理，得到待測(cè)樣品；
[0036]2)將待測(cè)樣品進(jìn)行同步反轉(zhuǎn)錄處理，得到待雜交檢測(cè)模板；
[0037]3)將待雜交檢測(cè)模板與探針進(jìn)行雜交處理，得到雜交產(chǎn)物；
[0038]4)將雜交產(chǎn)物進(jìn)行連接處理，得到連接產(chǎn)物；
[0039]5)將連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)處理，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0040]6)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸電泳處理，隨后進(jìn)行凝膠成像分析得到檢測(cè)結(jié)
果O
[0041 ] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為:1、本發(fā)明能夠同時(shí)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒等三種混合感染的常見病原。2、本發(fā)明采用針對(duì)三種病毒核酸的特異性探針雜交后的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相當(dāng)于利用了傳統(tǒng)PCR技術(shù)校對(duì)了長(zhǎng)、短探針與目的基因是否同時(shí)正確雜交以及二者是否正確連接，這種多重驗(yàn)證結(jié)點(diǎn)集成一體化設(shè)計(jì)極大提高了檢測(cè)結(jié)果的特異性與可靠性。3、本發(fā)明約束了原有的多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(MLPA)的擴(kuò)增譜，以長(zhǎng)探針中加入的特定指紋序列為標(biāo)尺，使擴(kuò)增后的探針連接產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后即可方便地進(jìn)行結(jié)果的判定。4、本發(fā)明針對(duì)原有的多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(MLPA)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了調(diào)整，使檢測(cè)效率顯著提高的同時(shí)也降低了檢測(cè)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1是MLPA技術(shù)原理示意圖；
[0043]圖2是MLPA電泳檢測(cè)結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0044]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0045]實(shí)施例:
[0046]1.用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物的設(shè)計(jì)與合成
[0047]選擇高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因作為檢測(cè)目標(biāo)基因，通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov)，選擇并下載有代表性的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因40條序列、豬瘟病毒基因E2基因40條序列以及豬偽狂犬病毒TK基因20條序列，使用MAGA5.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析，在基因區(qū)選擇一段相對(duì)保守序列如下所示:
[0048]N0.1 PRRSV ORF5 gene
[0049]5’ GGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATC 3’ ；
[0050]N0.2 CSFV E2 gene
[0051]5’
[0052]TGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGCCAGCAAGAT CCAAT 3，；
[0053]N0.3PRV TK gene
[0054]5，
[0055]TGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCATGCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAG ATCCAATCTGTGCCAGCAAGATCCAATCTG 3’
[0056]人工合成引物及 探針如下表:
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，其特征在于，包括如下的序列組: 1)針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因的探針
左翼探針 Probel05L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’右翼探針 Probel05R:5’ TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’ 2)針對(duì)豬瘟病毒E2基因的探針
左翼探針 Probel25L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA 3’
右翼探針 Probe 125R:5’ GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3， 3)針對(duì)豬偽狂犬病毒TK基因的探針 左翼探針 Probel50L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCAT 3’
右翼探針 Probe 150R:5’ GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3， 4)通用引物
正向引物 UP1: 5' TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT 3'` 反向引物 UP2:5' GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA 3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，其特征在于:所述右翼探針的5’端經(jīng)過磷酸化修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，其特征在于:所述5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT與通用的正向引物UPl序列相同；所述TCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’與通用的反向引物UP2序列反向互補(bǔ)。
4.一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重同步核酸定性檢測(cè)試劑，其特征在于:包括MLPA雜交液、MLPA連接液、PCR反應(yīng)液、RNA/DNA共提液、RT反應(yīng)液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、探針混合液、通用引物混合液、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理水； MLPA 雜交液包括 SALSA MLPA buffer ； MLPA 連接液包括 Ligase_65buffer A, Ligase_65buffer B, Ligase-65 連接酶； PCR 反應(yīng)液包括 2 X Taq Master Mix ； RNA/DNA共提液包括苯酚、8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇； RT反應(yīng)液包括M-MLV5XReaction Buffer,200U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、2000U RNase抑制劑、IOmM dNTP Mix ； 陽性對(duì)照品為含1.0X 108COpy/ml濃度的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒基因E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的DNA片段； 陰性對(duì)照品為不含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的pSURE-T重組質(zhì)粒； 探針混合液為權(quán)利要求1所述的左翼探針、右翼探針；通用引物混合液為權(quán)利要求1所述的UPl與UP2的混合液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重同步核酸定性檢測(cè)試劑，其特征在于:所述PCR反應(yīng)液是由Taq DNAPolymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系，濃度為2X，預(yù)配好的PCR混合液中加入了溴芬藍(lán)染料，反應(yīng)結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)；75%乙醇需使用DEPC處理水配制。
6.一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于有以下步驟: 1)將疑似已經(jīng)感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的發(fā)病豬或死亡豬尸體內(nèi)的血液、分泌液體以及淋巴結(jié)樣品進(jìn)行核酸提取處理，得到待測(cè)樣品； 2)將待測(cè)樣品進(jìn)行同步反轉(zhuǎn)錄處理，得到待雜交檢測(cè)模板； 3)將待雜交檢測(cè)模板與探針進(jìn)行雜交處理，得到雜交產(chǎn)物； 4)將雜交產(chǎn)物進(jìn)行連接處理，得到連接產(chǎn)物； 5)將連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)處理，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 6)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖`凝膠核酸電泳處理，隨后進(jìn)行凝膠成像分析得到檢測(cè)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103555861SQ201310564210
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】高慎陽, 周鐵忠, 查恩輝, 董筱萍, 遲陽 申請(qǐng)人:遼寧醫(yī)學(xué)院