醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法?，F(xiàn)有的試驗方法不能明確的對腸道桿菌進行區(qū)別和分類。本發(fā)明包括如下步驟：取實驗材料，首先，分別接種于腸道選擇培養(yǎng)基伊紅美蘭瓊脂平板EMB培養(yǎng)基和S.S瓊指平板培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中進行分離培養(yǎng)；其次，經(jīng)過37℃培養(yǎng)26小時后取可疑菌落，無色，半透明細菌菌落分別接種在雙糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)、鑒別；再次，進行腸道桿菌生化反應實驗，最后，進行W.C.D.J.A.染色實驗，進行血清學方法做進一步檢查。本發(fā)明的目的在于提供一種醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法。
【專利說明】醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
現(xiàn)有的試驗方法不能明確的對腸道桿菌進行區(qū)別和分類。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于提供一種醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，該方法包括如下步驟:取實驗材料，首先，分別接種于腸道選擇培養(yǎng)基伊紅美蘭瓊脂平板EMB培養(yǎng)基和S.S瓊指平板培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中進行分離培養(yǎng)；其次，經(jīng)過37°C培養(yǎng)26小時后取可疑菌落，無色，半透明細菌菌落分別接種在雙糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)、鑒別；再次，進行腸道桿菌生化反應實驗，最后，進行I C.D.J.A.染色實驗，進行血清學方法做進一步檢查。
[0005]所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，所述的伊紅美蘭瓊脂平板EMB培養(yǎng)基的制備方法:將PH7.6的普通瓊脂培養(yǎng)基滅菌溶化，冷至60°C左右時，每100ml培養(yǎng)基中加入滅菌20%乳糖溶液5ml，滅菌2%伊紅水溶液2ml，滅菌0.5%亞甲蘭水溶液2ml，充分混勻，傾入滅菌平板即 可；S.S瓊指平板培養(yǎng)基的制備方法:取普通瓊脂培養(yǎng)基100ml、乳糖lgm、枸椽酸鈉0.85gm、硫代硫酸鈉0.85gm、10%枸椽酸鐵溶液lml、l%中性紅水溶液0.25ml,1%煌綠水溶液0.033ml、3號膽鹽0.85gm，取高壓滅菌15磅30分鐘滅菌溶化的瓊脂培養(yǎng)基加入乳糖、枸椽酸鈉、硫代硫酸鈉、枸椽酸鐵溶液和3號膽鹽，混勻，調(diào)pH為7.0，用紗布過濾，高壓滅菌8磅20分鐘，待冷至65°C左右加入中性紅及煌綠水溶液，傾注于無菌平皿。
[0006]所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，所述的胃腸道細菌分離培養(yǎng)鑒定實驗，W.C.D.J.A.六區(qū)平板劃線法:左手將接種環(huán)按無菌操作法沾取少取標本或培養(yǎng)物，左手拿平板略開蓋，將標本涂于平板表面之一側(cè)邊緣，運用腕力作連續(xù)劃線要密但不要重疊，不要劃破瓊脂，占平板面積的1/4，旋轉(zhuǎn)平板70-90°，將接種環(huán)火焰滅菌，冷后通過第一次劃線區(qū)2-3次，再作同樣的連續(xù)劃線又占平板面積約，重復上述操作五次，劃完整個平板，將平板倒放于37°C溫箱內(nèi)，18-24小時，觀察各區(qū)菌落情況:所述的S.S瓊脂平板培養(yǎng)基中，埃希氏大腸桿菌會產(chǎn)生粉紅色菌落，菌落特點為邊緣整齊、光滑型菌落；志賀氏菌屬會形成具有無色透明，光滑濕潤凸起的中等大小菌落；所述的伊紅美蘭EMB瓊脂平板培養(yǎng)基中，大腸桿菌會生長為紫黑色有金屬光澤，大而凸起，不透明的菌落；志賀氏菌屬會形成無色半透明小菌落；沙門氏菌屬會生長成為無色半透明較小菌落。
[0007]所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，所述的W.C.D.J.A.染色實驗:取無菌玻片一張加鹽水一滴，取接種環(huán)按無菌操作方法挑取待檢細菌培養(yǎng)物放到鹽水中，混勻并涂成一薄層，接種環(huán)于火焰上燒灼滅菌，待涂片自然干燥，將標本片在酒精上火焰上來回通過火焰3次，殺死細菌并使細菌固定在玻片上，初染:將已制備好的涂片標本，冷后滴加結(jié)晶紫染液、蓋滿涂膜，約I分鐘、輕輕水洗；媒染:滴加盧戈碘液，約I分鐘，輕輕水洗；脫色:加95%酒精2-3滴，并立即頻頻搖動玻片數(shù)秒后，斜持玻片使酒精流去，立即水洗；復染:加石炭酸復紅稀釋液，復染I分鐘，水洗；染色完畢，待標本片干后或用吸水紙吸干后，即可鏡檢，實驗結(jié)果:埃希氏大腸桿菌:A染色陰性A—短小桿菌球桿狀；沙門氏菌屬:A染色陰性A—較細長的桿菌，散在排列；志賀氏菌屬:A染色陰性A—較細長的桿菌，散在排列。
[0008]所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，所述的腸道桿菌生化反應實驗中:制備單糖發(fā)酵管培養(yǎng)基:在已滅菌的100ml蛋白胨水培養(yǎng)基中，加入體積比為1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示劑0.1ml，再加入葡萄糖Ig或乳糖lg，混合后培養(yǎng)液呈鮮艷紫色；然后分裝于內(nèi)置有玻璃小倒置管的小試管中，每管約3ml，使小倒置管完全浸沒，塞好試管塞，包裝后置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)15到25分鐘滅菌，置溫度為4°C冰箱中備用；挑取可疑菌落接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖培養(yǎng)基中，然后接種于克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基中，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)26小時；
表1腸道桿菌的生化反應鑒別表
【權(quán)利要求】
1.一種醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:該方法包括如下步驟:取實驗材料，首先，分別接種于腸道選擇培養(yǎng)基伊紅美蘭瓊脂平板EMB培養(yǎng)基和S.S瓊指平板培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中進行分離培養(yǎng)；其次，經(jīng)過37°C培養(yǎng)26小時后取可疑菌落,無色，半透明細菌菌落分別接種在雙糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)、鑒別；再次，進行腸道桿菌生化反應實驗，最后，進行W.C.D.J.A.染色實驗，進行血清學方法做進一步檢查。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:所述的伊紅美蘭瓊脂平板EMB培養(yǎng)基的制備方法:將pH7.6的普通瓊脂培養(yǎng)基滅菌溶化，冷至60°C左右時，每100ml培養(yǎng)基中加入滅菌20%乳糖溶液5ml，滅菌2%伊紅水溶液2ml，滅菌0.5%亞甲蘭水溶液2ml，充分混勻，傾入滅菌平板即可；S.S瓊指平板培養(yǎng)基的制備方法:取普通瓊脂培養(yǎng)基100ml、乳糖lgm、枸椽酸鈉0.85gm、硫代硫酸鈉0.85gm、10%枸椽酸鐵溶液Iml、1%中性紅水溶液0.25ml ,1%煌綠水溶液0.033ml、3號膽鹽0.85gm，取高壓滅菌15磅30分鐘滅菌溶化的瓊脂培養(yǎng)基加入乳糖、枸椽酸鈉、硫代硫酸鈉、枸椽酸鐵溶液和3號膽鹽，混勻，調(diào)pH為7.0，用紗布過濾，高壓滅菌8磅20分鐘，待冷至65°C左右加入中性紅及煌綠水溶液，傾注于無菌平皿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:所述的胃腸道細菌分離培養(yǎng)鑒定實驗，W.C.D.J.A.六區(qū)平板劃線法:左手將接種環(huán)按無菌操作法沾取少取標本或培養(yǎng)物，左手拿平板略開蓋，將標本涂于平板表面之一側(cè)邊緣，運用腕力作連續(xù)劃線要密但不要重疊，不要劃破瓊脂，占平板面積的1/4，旋轉(zhuǎn)平板70-90°，將接種環(huán)火焰滅菌，冷后通過第一次劃線區(qū)2-3次，再作同樣的連續(xù)劃線又占平板面積約，重復上述操作五次，劃完整個平板，將平板倒放于37°C溫箱內(nèi)，18-24小時，觀察各區(qū)菌落情況:所述的S.S瓊脂平板培養(yǎng)基中，埃希氏大腸桿菌會產(chǎn)生粉紅色菌落，菌落特點為邊緣整齊、光滑型菌落；志賀氏菌屬會形成具有無色透明，光滑濕潤凸起的中等大小菌落；所述的伊紅美蘭EMB瓊脂平板培養(yǎng)基中，大腸桿菌會生長為紫黑色有金屬光澤，大而凸起，不透明的菌落；志賀氏菌屬會形成無色半透明小菌落；沙門氏菌屬會生長成為無色半透明較小菌落。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:所述的W.C.D.J.A.染色實驗:取無菌玻片一張加鹽水一滴，取接種環(huán)按無菌操作方法挑取待檢細菌培養(yǎng)物放到鹽水中，混勻并涂成一薄層，接種環(huán)于火焰上燒灼滅菌，待涂片自然干燥，將標本片在酒精上火焰上來回通過火焰3次，殺死細菌并使細菌固定在玻片上，初染:將已制備好的涂片標本，冷后滴加結(jié)晶紫染液、蓋滿涂膜，約I分鐘、輕輕水洗；媒染:滴加盧戈碘液，約I分鐘，輕輕水洗；脫色:加95%酒精2-3滴，并立即頻頻搖動玻片數(shù)秒后，斜持玻片使酒精流去，立即水洗；復染:加石炭酸復紅稀釋液，復染I分鐘，水洗；染色完畢，待標本片干后或用吸水紙吸干后，即可鏡檢，實驗結(jié)果:埃希氏大腸桿菌:A染色陰性A—短小桿菌球桿狀；沙門氏菌屬:A染色陰性A—較細長的桿菌，散在排列；志賀氏菌屬:A染色陰性A—較細長的桿菌，散在排列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:所述的腸道桿菌生化反應實驗中:制備單糖發(fā)酵管培養(yǎng)基:在已滅菌的100ml蛋白胨水培養(yǎng)基中，加入體積比為1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示劑0.1ml，再加入葡萄糖Ig或乳糖lg，混合后培養(yǎng)液呈鮮艷紫色；然后分裝于內(nèi)置有玻璃小倒置管的小試管中，每管約3ml,使小倒置管完全浸沒，塞好試管塞，包裝后置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)15到25分鐘滅菌，置溫度為4°C冰箱中備用；挑取可疑菌落接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖培養(yǎng)基中，然后接種于克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基中，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)26小時； 表1腸道桿菌的生化反應鑒別表
6.根據(jù)權(quán)利要求書I或2所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:所述的生化反應試驗中，將可疑菌落接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，VP試驗和甲基紅試驗，枸椽酸鹽培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基等生化培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24小時，根據(jù)生化反應進行鑒定，常見細菌的生化反應特點，見表2: 表2 常見腸道桿菌的生化反應鑒別表
7.根據(jù)權(quán)利要求書I或2所述的醫(yī)學微生物學實驗胃腸道細菌檢測方法，其特征是:所述的血清學鑒定實驗中，玻片凝集反應:實驗方法為:取玻片一張，先加上一滴相應多價診斷血清，判斷用沙門菌或志賀菌多價血清，同時滴一滴生理鹽水做對照，以接種環(huán)挑少許待檢菌于血清中研磨均勻，邊攪動邊看結(jié)果，出現(xiàn)明顯凝集者為陽性；同樣，以接種環(huán)挑少許待檢菌于生理鹽水中，生理鹽水對照應不凝集；試管凝集一肥達反應:實驗方法為:用小試管五排，每排七支，標明記號，每個試管中分別加入生理鹽水0.5ml ;取中號試管一支，加入生理鹽水2.7ml及被檢血清0.3ml，吸吹三次充分混勻，即為1: 10稀釋血清；吸取1:10稀釋的血清0.5ml分別加入每排的第一個支試管中吸吹三次充分混勻，再從第一個試管吸出0.5ml到第二個試管做倍比稀釋，混勻后，再從第二個試管吸出0.5ml到第三個試管并依次類推直至第六管為止，再從第六管吸0.5ml棄去，每排試管稀釋方法相同；每排各管的血清稀釋度分別為1:20，1:40,1:80,1:160,1:320,1:640，每排第七個試管不加血清，作為抗原對照，分別加入抗原，第一排各管加傷寒沙門菌O抗原0.5ml，第二排各管加傷寒沙門菌H抗原0.5ml，第三排各管加甲型(A)傷寒沙門菌抗原0.5ml，此時各管的病人血清稀釋度又增加一倍，依次為I:40,1:80,1:160,1:320,1:640，每管總量1.0ml，振蕩混勻，置37°C溫箱中18-24小時，取出觀察并記錄結(jié)果；觀察結(jié)果:先觀察對照管，應無凝集現(xiàn)象；再從各排第六管開始向前依次觀察，能見到明顯凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度即為該血清對某種抗原的凝集效價，H抗原呈絮狀凝集，O抗原呈顆粒狀凝集，分別記錄結(jié)果，并進行分析，一般認為，傷寒沙門菌O抗體凝集效價在1:80以上，H抗體在1:160以上，甲、乙、丙型副傷寒沙門菌凝集效價在1:80以上才有診斷意義。
【文檔編號】C12Q1/10GK103614453SQ201310510947
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月16日
【發(fā)明者】李建志 申請人:黑龍江中醫(yī)藥大學