一種大規(guī)?；蛑亟M方法及其在生產(chǎn)生物基化學品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種大規(guī)?；蛑亟M方法及其在生產(chǎn)生物基化學品中的應用，是將宿主原生質(zhì)體與外源基因組混合制備得到融合子，并利用融合子發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學品。本發(fā)明方法易于操作，成功率高，相對于其他手段，對設備的要求較低；本發(fā)明方法還可結合高通量的篩選手段，使流程相對簡單，結果事半功倍。
【專利說明】一種大規(guī)?；蛑亟M方法及其在生產(chǎn)生物基化學品中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種進行大規(guī)?；蛑亟M方法及其在生產(chǎn)生物基化學品中的應用，屬于分子遺傳學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]合成生物學旨在利用測序技術、計算機建模及模擬技術、生物工程技術、化學合成技術等，在工程學思想的指導下，從頭設計并構建新的生物組件、設備和系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的、天然的生物系統(tǒng)進行重新設計和改造，以達到利用工程化的生物系統(tǒng)或生物模塊來處理信息、操作化合物、制造材料、生產(chǎn)能源、提供食物、保持和增強人類健康以及改善環(huán)境等目的。合成生物學的研究目標非常明確:從頭合成新的生命體，或者對已有生命體進行工程化改造，從而實現(xiàn)新的功能。為了實現(xiàn)這些目標，科學家們從不同層次、不同角度進行了探索。目前，合成生物學的研究主要集中在3個方面:(I)生物元件標準化及生物模塊的設計與構建；(2)最小基因組研究；(3)基因組的設計、合成與組裝。圍繞合成生物學研究目標，合成生物學各研究內(nèi)容之間互為聯(lián)系:生物元件標準化及生物模塊的設計與構建使得我們在深入認識復雜生命體系的基礎上，實現(xiàn)對生命體有目的的設計與改造；最小基因組研究為新設計的生物模塊的功能實現(xiàn)提供理想的表達載體；而合成基因組技術則為前面二者的實現(xiàn)提供堅實的技術支撐.三者互為促進，從而最終實現(xiàn)具有特定功能的、有實際應用價值的嶄新的生命體。
[0003]基因組改組技術是基于DNA改組技術上的一項新的技術，以包含多種正突變子的突變庫為出發(fā)菌株，通過不同方法對突變子的全基因組進行隨機重組，并篩選出目的性狀得到優(yōu)化的重組子作為下一輪融合的出發(fā)菌株。通過遞推式基因組改組，突變庫中的基因組得到較充分的重排，同時獲得表型最優(yōu)的后代。該方法成功率高，但是該方法耗時長，較難完成，對操作技術要求甚高。通過F致育因子的轉(zhuǎn)導實現(xiàn)基因組改組，是通過細菌的菌毛來實現(xiàn)不同細菌之間遺傳物質(zhì)交換以及重組的。該方法雖然簡單，不需要太高的設備要求，但是在交換過程中不能被打斷，因而導致該方法的成功率不是很高。現(xiàn)有技術需要一種耗時短、不需要太高的設備要求、成功率高的基因重組方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種進行大規(guī)?；蛑亟M的方法，是將宿主原生質(zhì)體與外源基因組混合制備得到融合子。
[0005]本發(fā)明具體步驟如下:
[0006]I)制備宿主原生質(zhì)體；
[0007]2)提取外源微生物基因組；
[0008]3)培養(yǎng)宿主原生質(zhì)體，離心洗滌后重懸，加入外源微生物tRNA，溫和混勻，加入含有外源微生物基因組的培養(yǎng)基中，加入Fusion Buffer進行融合；[0009]4)篩選得到融合子。
[0010]所述FusionBuffer含有PEG8000,所述Fusion Buffer組成如下:Tris 15_25mM,NaCl 490-510mM，MgCl2 15_25mM，PEG8000 8_12%。
[0011]所述宿主為大腸桿菌，所述外源微生物為釀酒酵母。
[0012]更進一步，本發(fā)明優(yōu)選步驟如下:
[0013]I)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體；
[0014]2)提取釀酒酵母基因組；
[0015]3)培養(yǎng)宿主原生質(zhì)體濃度為5-50X 107CFU/mL，離心洗滌后重懸，加入IOug釀酒酵母tRNA，溫和混勻，加入19.9-20.1uL含有外源微生物基因組的培養(yǎng)基中，加入FusionBuffer 進行融合；Fusion Buffer 組成為:Tris 2OmM，NaCl 500mM, MgCl2 20mM, PEG800010% ；
[0016]4)篩選得到融合子。
[0017]此處需要說明，本發(fā)明方法具有可重復性高的優(yōu)點，不像誘變育種具有不確定性。誘變是在全基因組的基礎上大規(guī)模進行突變，其結果具有不可預知。誘變后菌株出現(xiàn)記憶退化，需要對菌株進行好幾代的馴化，才能穩(wěn)定誘變后的菌種。而基因組移植后的菌，同樣是在全基因組水平上面對菌進行改造，所不同的是，他是將外源基因整合進染色體，改造后的菌株及其穩(wěn)定，經(jīng)過測試，傳代培養(yǎng)3代后，菌株不發(fā)生退化。
[0018]本發(fā)明還提供一種 大規(guī)?；蛑亟M方法在生產(chǎn)生物基化學品中的應用，是將目的基因?qū)胪庠次⑸?，將含有外源微生物基因組與宿主原生質(zhì)體融合篩選得到融合子，利用融合子發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學品。
[0019]優(yōu)選，將與異戊二烯及其衍生物合成有關基因?qū)脶劸平湍?，提取含有與異戊二烯合成有關基因的基因組，并將其與大腸桿菌原生質(zhì)體融合篩選得到融合子，利用融合子發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯及其衍生物。
[0020]本發(fā)明提供的方法，是在8%_12% PEG8000介導下進行大腸桿菌和釀酒酵母進行基因組移植，其中優(yōu)選PEG8000濃度為10%。研究發(fā)現(xiàn)，如果PEG8000濃度低于8%，酵母菌基因組無法融入大腸桿菌，如果PEG8000濃度高于12%，導致Fusion Buffer粘度太大，酵母菌基因組同樣無法融入大腸桿菌。只有PEG8000濃度為8%-12%時才能實現(xiàn)酵母菌基因組大規(guī)模與大腸桿菌感受態(tài)細胞融合。另外，大腸桿菌感受態(tài)細胞濃度也非常重要，感受態(tài)細胞不在5-50X 107CFU/mL范圍內(nèi)也無法實現(xiàn)酵母菌基因組融入大腸桿菌。
[0021]經(jīng)過重復驗證以及分子表征，該方法效果良好，可行性高。
[0022]本本發(fā)明提出用基因組移植方法進行大規(guī)?；蚋慕M具有以下優(yōu)點:
[0023]1.本發(fā)明首次實現(xiàn)了在跨種屬之間(酵母菌到大腸桿菌)大規(guī)?；虻霓D(zhuǎn)移；
[0024]2.方法易于操作，成功率高，相對于其他手段，對設備的要求較低；
[0025]3.本發(fā)明方法可結合高通量的篩選手段，使流程相對簡單，結果事半功倍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1擴增大腸桿菌ACS基因的電泳圖；
[0027](I為陰性對照，2為陽性對照，3-10為單克隆菌液PCR結果，11為IK的DNA子
量標準)。[0028]圖2擴增釀酒酵母ACS基因電泳圖；
[0029](I為IK的DNA分子量標準，2為陰性對照，3為陽性對照，4_11為單克隆菌液PCR結果)。
[0030]圖3融合子16srDNA擴增的電泳圖片；
[0031](1，3為融合子16s的電泳條帶；2, marker)。
[0032]圖4融合子ERG-12片段擴增的電泳圖片；
[0033](I, marker ;2，陰性對照；3，陽性對照；4，樣品I ;5，樣品2 ;6，樣品3)。
[0034]圖5融合子IDIl片段擴增的電泳圖片；
[0035](I, marker ;2,陰性對照；3,陽性對照；4,樣品I ;5,樣品2 ;6,樣品3)。
[0036]圖6融合子ERG19片段擴增的電泳圖片；
[0037](1，marker ;2，克隆I ;3，陰性對照；4，陽性對照；5，克隆2 ;6，克隆3 ;7，克隆4)。
[0038]圖7融合子ERG 8片段擴增的電泳圖片；
[0039](I, marker ;2，陰性對照；3，陽性對照；4，樣品I ;5，樣品2 ;6，樣品3)。
【具體實施方式】
[0040]實施例1:將酵母基因組移植至大腸桿菌中得到融合子的方法
·[0041]菌株活化:取適量菌液，接種于LB液體培養(yǎng)基中37°C，180rpm夜活化。
[0042]原生質(zhì)體制備:大腸桿菌細菌細胞，3mL LB, 37°C 180rpm過夜,0.5mL轉(zhuǎn)入50mLLB,條件同上,OD=0.9 左右，收菌，4°C,8000rpmX5min, IOmM Tris (pH8.0)洗漆兩遍,重懸于 5mL Tris (0.1Μ,ρΗ8.0,鹿糖，20%,w/v),加入 2mg/mL 溶菌酶,終濃度 100ug/mL, 37°C,12hrs。
[0043]菌株活化:取適量菌液，接種于YPD液體培養(yǎng)基中30°C，180rpm夜活化。
[0044]菌液擴大培養(yǎng):取活化后的菌液按照1%接種量轉(zhuǎn)接至50mLYPD中，30°C，180rpm培養(yǎng)0D600至2左右。
[0045]基因組提取:按照北京索來寶的酵母基因組提取試劑盒進行基因組提取。提取后的基因組跑1%瓊脂糖凝膠電泳驗證純度。
[0046]將制備的原生質(zhì)體用6mL LB (20%蔗糖，w/v)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌體濃度達到5-50父10^^/11^后，101:，45748\1011^11，用 Tris-NaCl (IOmM, 250mM, pH7.0)洗滌一次，用200uL 0.1M CaCl2重懸，冰浴30min，加入IOug酵母tRNA，溫和混勻，加入到400uL含有20uL酵母基因組的液體LB中，加入等體積的Fusion BufferCTris 20mM, NaCl 5OOmM, MgCl220mM, PEG8000 10%)，溫和震蕩 lmin，37°C 50min，加入 IOmL LB, 37°C, 180rpm, 3hrs0
[0047]融合子初篩:溫育后的菌液45748父151^11，101:，重懸于0.7mL LB中，l_200uL涂布于 YNBE 瓊脂板(6.7g/L YNB, 50g/L 乙醇，20g/L 瓊脂)上，37°C培養(yǎng) l_2d。
[0048]融合子復篩:選取釀酒酵母以及大腸桿菌的ACS基因為目的基因，對融合子進行PCR擴增。如表1，2所示，其中X=59，Y=3。
[0049]PCR結束后，用0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。(結果見圖1，2。以下如無特殊說明，程序和體系相同，步驟類似)
[0050]表1 PCR反應體系表
[0051]_^_體積/μ?_
^ 14.75uL
5 xPSbulTer 5μ1
dNTPs 2uL
引物(20mM) 2*0.1uL
Taq 酶 ().25uL
模板 I uL
_終體積_25uL_
[0052]表2 PCR實驗程序
[0053]
階段 I_95?_3min_
95 V30s
階段 2X0C30s35cyclcs
72°C \ Him_階段 3_72V_IOmin_
[0054]融合子分子鑒定；將鑒定后的陽性單克隆活化并擴培后進行基因組提取，然后進行16srDNA PCR擴增，其中X=54，Y=2。擴增結束后，進行切膠回收(見圖3)，并測序，序列結果見 SEQ ID N0.1。
[0055]融合子的分子表征:將陽性單克隆分別進行ERG-8、ERG-12、ERG-19、ID1-1四個片段進行PCR擴增，其中X=56，Y=2，結果見圖4-7。
[0056]實施例2將枯草芽孢桿菌基因組移植至大腸桿菌(具體分子生物學方法參照實施例I)
[0057]將大腸桿菌進行原生質(zhì)體制備后，同時把枯草芽孢桿菌的基因組利用試劑盒進行提取。將制備的原生質(zhì)體用6mL LB (20%蔗糖，w/v)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌體濃度達到5-50父10^^/11^后，101:，45748\1011^11，用 Tris-NaCl (IOmM, 250mM, pH7.0)洗滌一次，用200uL 0.1M CaCl2重懸，冰浴30min，加入IOug酵母tRNA，溫和混勻，加入到400uL含有20uL酵母基因組的液體LB中，加入等體積的Fusion Buffer (Tris 20mM, NaCl500mM, MgCl2 20mM, PEG8000 8%_12%)，溫和震蕩 lmin，37 °C 50min，加入 IOmL LB, 37 °C,180rpm，3hrS。將復活后的菌液涂布于含有淀粉為唯一碳源的瓊脂平板上先進性融合子的篩選。
[0058]實施例7:融合子的發(fā)酵異戊二烯的性能表征
[0059]轉(zhuǎn)化:5uLpACY-mvaE-mvaS-gppS2_iSP4 與 5uL pTrc-low 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 IOOuL重組菌株的感受態(tài)細胞中(見文章Yang, J., et al., Bio-1soprene productionusing exogenous MVA pathway and isoprene synthase in Escherichia col1.Bioresour Technol, 2012.104:p.642-7)，冰浴 30min, 42 °C 熱擊 90s，冰浴 3min，加A 450uL LB, 37 °C , 180rpm搖床復活lh。同時做陽性對照，取5uL pTrc-low與5uLpACY-mvaE-mvaS-gppS2-1SP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入100uLBL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，以下操作同上。
[0060]篩選:復活后的菌液IOOuL涂布于LB瓊脂板(Cm+Amp，I %。)，37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[0061]活化及擴培:挑取上一步白色單克隆(12h內(nèi)長出的)進行小瓶活化，3mLLB (Cm+Amp, 1%。)，37°C搖床搖菌。菌濃為1.0左右轉(zhuǎn)接至30mL LB (Amp+Cm)中進行擴培，作為種子
[0062]發(fā)酵:取擴培后的菌液按1%接種量接入IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C搖菌，菌濃長至
1.0左右加入IPTG，終濃度為0.5mM,加瓶塞，進行厭氧發(fā)酵。30°C，180rpm搖菌。
[0063]檢測:檢測方法:GC，頂空抽氣；進樣量:lmL ;儀器型號:山東魯南瑞虹SP-6890 ；檢測器:FID ;分離柱:安捷倫Innowax HP-1 column ;柱頭壓:0.1Mpa ;柱室溫度:50°C恒溫；氣化室:100°C ;檢測器溫度:50°C ；Rt ^ 1.8min。
[0064]經(jīng)測定產(chǎn)異戍二烯的重組大腸桿菌產(chǎn)量高達106.1665mg/L,而未經(jīng)過改造的大腸桿菌產(chǎn)量為73.98148mg/L0
[0065]發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下(IOOmL):Κ2ΗΡ04.3H20:0.98g，一水合檸檬酸:0.21g，檸檬酸鐵銨:0.03g, MD牛肉粉:0.9g ，葡萄糖:0.2g, MgS04(lM):200uL，微量元素:100uL，氨芐青霉素:100uL，氯霉素:100uL。
【權利要求】
1.一種大規(guī)?；蛑亟M方法，其特征在于，步驟如下: 1)制備宿主原生質(zhì)體； 2)提取外源微生物基因組； 3)培養(yǎng)宿主原生質(zhì)體,離心洗滌后重懸,加入外源微生物tRNA，溫和混勻，加入含有外源微生物基因組的培養(yǎng)基中，加入Fusion Buffer進行融合； 4)篩選得到融合子。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述FusionBuffer含有8_12%PEG8000。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)宿主原生質(zhì)體至5-50X107CFU/mL。
4.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體； 2)提取釀酒酵母基因組； 3)培養(yǎng)大腸桿菌原生質(zhì)體至5-50X 107CFU/mL,洗滌后CaCl2重懸，加入釀酒酵母tRNA，溫和混勻，加入含有釀酒酵母基因組的培養(yǎng)基中，加入Fusion Buffer進行融合；所述Fusion Buffer 含有 8_12%PEG8000 ； 4)篩選得到融合子。
5.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體； 2)提取枯草芽孢桿菌基因組； 3)培養(yǎng)大腸桿菌原生質(zhì)體至5-50X IO7CFUAiL，離心洗滌后CaCl2重懸，加入枯草芽孢桿菌tRNA，溫和混勻，加入含有枯草芽孢桿菌基因組的培養(yǎng)基中，加入Fusion Buffer進行融合；所述 Fusion Buffer 含有 8_12%PEG8000 ； 4)篩選得到融合子。
6.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體； 2)提取釀酒酵母基因組； 3 )培養(yǎng)大腸桿菌原生質(zhì)體濃度為5-50 X 107CFU/mL,離心洗滌后CaCl2重懸，加入9.5-10.5ug釀酒酵母tRNA，溫和混勻，加入19.9-20.1uL含有釀酒酵母基因組的培養(yǎng)基中，加入 Fusion Buffer ；Fusion Buffer 組成為:Tris 15_25mM, NaCl 490-5IOmM, MgCl215-25mM, PEG8000 8-12%。 4)篩選得到融合子。
7.如權利要求1所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體； 2)提取釀酒酵母基因組； 3)培養(yǎng)大腸桿菌原生質(zhì)體濃度為5-50X107CFU/mL，離心后Tris-NaCl洗滌一次，用200uL 0.1M CaCl2重懸，冰浴30min，加入IOug酵母tRNA，溫和混勻，加入到400uL含有20uL酵母基因組的液體LB中，加入等體積Fusion Buffer，溫和震蕩lmin，37°C下放置50min，加入IOmL LB培養(yǎng)基，37°C下180rpm搖床培養(yǎng)3小時；Fusion Buffer組成為:Tris20mM, NaCl 500mM, MgCl2 20mM, PEG8000 10% ； 4)篩選得到融合子。
8.權利要求1所述大規(guī)?；蛑亟M方法得到的融合子用于發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學品。
9.一種應用權利要求1所述方法生產(chǎn)異戊二烯的方法，其特征在于，步驟如下: 1)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體； 2)提取枯草芽孢桿菌基因組； 3)培養(yǎng)大腸桿菌原生質(zhì)體至一定濃度，洗漆后CaCl2重懸,加入枯草芽孢桿菌tRNA,溫和混勻，加入含有枯草芽孢桿菌基因組的培養(yǎng)基中，加入Fusion Buffer進行融合；所述Fusion Buffer 含有 PEG8000 ； 4)篩選得到融合子，將與異戊二烯合成有關基因?qū)肴诤献樱? 5)利用融合子發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
10.如權利要求9所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)制備大腸桿菌宿主原生質(zhì)體； 2)提取釀酒酵母基因組； 3)培養(yǎng)大腸桿菌原生質(zhì)體濃度為5-50X107CFU/mL，離心后Tris-NaCl洗滌一次，用200uL 0.1M CaCl2重懸，冰浴30min，加入IOug酵母tRNA，溫和混勻，加入到400uL含有20uL酵母基因組的液體LB中，加入等體積Fusion Buffer，溫和震蕩lmin，37°C下放置50min，加入IOmL LB培養(yǎng)基，37°C下180rpm搖床培養(yǎng)3小時；Fusion Buffer組成為:Tris20mM, NaCl 500mM, MgCl2 20mM, PEG8000 10% ； 4)篩選得到融合子,將·5uL pACY-mvaE-mvaS-gppS2_iSP4 與 5uL pTrc-low 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入IOOuL融合子感受態(tài)細胞中，得到重組融合子； 5)利用步驟4)得到的重組融合子發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
【文檔編號】C12N1/21GK103571875SQ201310474232
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權日:2013年10月12日
【發(fā)明者】咸漠, 楊建明, 任萌, 馮紅茹 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所