一種用于檢測braf基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，利用鉗夾技術(shù)封閉野生型BRAF基因序列，從而提高sanger測序法的靈敏度和BRAF基因突變的檢出率。本發(fā)明檢測方法操作簡單、安全，不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟高效；同時還具有操作時間短的優(yōu)點，整個檢測過程可在4～6小時內(nèi)完成。
【專利說明】—種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]BRAF基因位于7q34，長約190kb，轉(zhuǎn)錄mRNA長2.5kb，編碼783個氨基酸的蛋白。BRAF蛋白由783個氨基酸組成，功能上從N端到C端為RAS結(jié)合區(qū)、富含半胱氨酸區(qū)(Cys)、甘氨酸環(huán)(Gloop)和激活區(qū)。在絕大多數(shù)組織和細胞類型中，BRAF是MEK/ERK最為關(guān)鍵的激活因子。它主要有CRl、CR2和CR3三個保守區(qū)，其中CRl區(qū)含RBD區(qū)(ras banding domain,為RAS蛋白結(jié)合區(qū))和富含半胱氨酸區(qū)(Cys) ;CR3區(qū)為激酶結(jié)構(gòu)域，含甘氨酸環(huán)(Gloop)，為ATP結(jié)合位點和激活區(qū)，該區(qū)T598和S601兩個位點的磷酸化對BRAF蛋白的激活至關(guān)重要。BRAF蛋白的主要磷酸化位點為S364、S428、T439、T598和S601。BRAF蛋白的完全活化需要T598和S601兩個位點的磷酸化，這兩個位點氨基酸的置換將導(dǎo)致激酶持續(xù)性激活。
[0003]研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突變。BRAF突變主要有兩種類型:1.11%位于exonll上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等的點突變；2.89%的突變發(fā)生在exonl5上的激活區(qū)，其中約92%位于第1799核苷酸上，T突變?yōu)锳(T1799A以前認為是T1796A)，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E以前被認為是V599E)。此外，僅不到I %的癌組織同時存在BRAF突變與RA S突變，且在這I %中，BRAF突變幾乎均為非V600E突變。以上兩種類型的突變均能使BRAF激酶活性及NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化能力提高，但以后者更為重要。V600E突變能模擬T598和S601兩個位點的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
[0004]目前用于基因突變檢測的方法有Sanger測序法、高效液相色譜法、實時熒光定量PCR法等。Sanger基因測序技術(shù)經(jīng)過了 30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對長達1，OOObp的DNA片段進行測序，而且對每一個堿基的讀取準確率高達99.999%。由于具有很高的讀取準確率，Sanger法測序成為基因突變、單核苷酸多態(tài)性等基因分析的金標(biāo)準。
[0005]腫瘤組織中，BRAF野生型細胞與突變型細胞混雜，而Sanger測序法的靈敏度僅為10~20%，即當(dāng)突變型細胞占整體檢測細胞的10~20%時才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測序法的應(yīng)用。
[0006]肽核酸(peptide nucleic acids, PNA) 一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過計算機設(shè)計構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補DNA具有I個堿基不匹配時，其溶解溫度會下降8 V~20°C，2個堿基不匹配時則完全不能雜交。鑒于上述諸多DNA分子不具備的優(yōu)點，近十年來，人們?yōu)槠湓谠S多高【技術(shù)領(lǐng)域】找到了用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明采用PNA鉗夾技術(shù)封閉野生型BRAF基因序列，從而提高檢測BRAF基因熱點突變的敏感度和突變檢出率。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、PNA試劑、酶消化液、測序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液，所述PCR反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列為SEQ.1D N0.2，所述探針的序列為SEQ.1D N0.3，所述探針的5’端的熒光基團為FAM，3’端的熒光基團為BHQl ;所述PNA的序列為SEQ.1D N0.4 ;所述測序反應(yīng)液中含有Bi gdye、Bigdye緩沖液和測序引物。
[0010]上述方案中，所述PCR緩沖液由100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/LMgCl2組成；所述dNTPs的摩爾濃度為2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L ;所述探針的摩爾濃度為IOymol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/ μ I ;所述PNA試劑的摩爾濃度為10 μ mol/L。
[0011]上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶I和堿性磷酸酶。
·[0012]上述方案中，所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5:2。
[0013]上述方案中，所述測序反應(yīng)液含有5XBigdye、2.5 X Bigdye緩沖液和3 μ mol/L的測序引物。
[0014]上述方案中，所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶液。
[0015]上述方案中，在所述PCR正向引物的5’端插入通用Ml3序列:
[0016]TGTAAAACGACGGCCAGT,在所述PCR反向引物的5’端插入通用Ml3序列:
[0017]CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測序引物序列為:
[0018]TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0019]一種利用上述試劑盒檢測BRAF基因熱點突變的方法，具體包括如下步驟:
[0020](I)目的基因熒光定量PCR擴增:使用試劑盒中熒光定量PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，得到目的基因的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；
[0021](2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，使用試劑盒中的酶消化液，對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進行純化，得到純化后PCR產(chǎn)物；
[0022](3)使用試劑盒中的測序反應(yīng)液，對步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)，得到測序PCR產(chǎn)物；
[0023](4)使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化液，對步驟(3)得到的測序PCR產(chǎn)物進行純化，得到純化后測序PCR產(chǎn)物；
[0024](5)將步驟(4)得到的純化后測序PCR產(chǎn)物加樣至測序儀進行序列分析，測序所得基因序列與NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中BRAF基因標(biāo)準序列進行比對，并查看峰圖，判斷是否存在BRAF基因熱點突變:若峰圖中BRAF基因熱點突變區(qū)域600位點GTG峰圖下游典型的突變套峰，或者完全為突變峰圖，可知樣本中部分或全部細胞含有BRAF熱點突變區(qū)域600位點。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026](I)本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，在對樣本DNA進行PCR擴增反應(yīng)中，利用PNA試劑封閉野生型BRAF基因序列，提高sanger測序法的靈敏度和BRAF基因突變的檢出率。
[0027](2)本發(fā)明檢測方法操作簡單、安全，同時不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟高效。
[0028](3)本發(fā)明檢測方法操作時間短，整個檢測過程可在4~6小時內(nèi)完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為BRAF基因突變熱點區(qū)域序列，其中下劃線代表引物序列或引物結(jié)合位點，方框代表探針序列或探針結(jié)合位點，下劃虛線代表PNA序列或PNA結(jié)合位點，斜體字母代表突變位點。
[0030]圖2為實施例1中BRAF基因熒光定量PCR擴增曲線。
[0031]圖3為實施例1中BRAF基因測序圖。
【具體實施方式】
[0032]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、表格、實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實例。
[0033]實施例1`
[0034]1、熒光定量PCR反應(yīng)液中的引物、探針序列的合成和PNA序列的合成
[0035]根據(jù)BRAF基因熱點突變區(qū)域和測序片段的要求(見圖1)，設(shè)計如下引物、探針和PNA，并用人工合成的方法合成如下引物、探針和PNA:
[0036]BRAF600F:CTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG (SEQ.1D N0.1)
[0037]BRAF600R:TCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAG (SEQ.1D N0.2)
[0038]BRAF600P:FAM-CTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCA-BHQ1 (SEQ.1D N0.3)
[0039]BRAF600PNA:CTAGCTACAGTGAAATCTC (SEQ.1D N0.4)
[0040]上述引物、探針和PNA序列均為5’端至3’端，600表示BRAF突變熱點區(qū)域密碼子編號，F(xiàn)表示正向引物，R表示反向引物，P表示探針，F(xiàn)AM表示探針中突光基團，BHQl表示淬滅基團。
[0041]在上述正向引物的5’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在反向引物的5’端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC，該通用引物插入的意義在于能夠使本實驗方案后序的測序反應(yīng)均使用統(tǒng)一的測序引物。
[0042]2、目的基因片段的熒光定量PCR擴增
[0043](I)提取樣本DNA:人工合成BRAF基因突變熱點區(qū)域野生型和突變型基因，BRAF基因突變熱點區(qū)域野生型的序列為SEQ.1D N0.5，BRAF基因突變熱點區(qū)域突變型的序列為SEQ.1D N0.6，分別轉(zhuǎn)化入DH5 α大腸桿菌后培養(yǎng)，然后以野生型菌:突變型菌濃度比為99:1混合，再提取混合菌液DNA，即為樣本DNA ；[0044](2)使用試劑盒中PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對上述樣本DNA進行熒光PCR反應(yīng)擴增，得到目的片段DNA，PCR反應(yīng)體系為25 μ I體系:
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測BRAF基因熱點突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液、PNA試劑、酶消化液、測序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液，所述PCR反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列為SEQ.1D N0.2，所述探針的序列為SEQ.1D N0.3，所述探針的5’端的熒光基團為FAM，3’端的熒光基團為BHQl ;所述？嫩的序列為SEQ.1D N0.4 ;所述測序反應(yīng)液包含Bi gdye、Bigdye緩沖液和測序引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液由lOOmmol/LTris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2 組成；所述 dNTPs 的摩爾濃度為 2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L;所述探針的摩爾濃度為10 μ mol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/μ I ;所述PNA試劑的摩爾濃度為10 μ mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述酶消化液包括核酸外切酶I和堿性磷酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述測序反應(yīng)液含有5XBigdye、 2.5 X Bigdye緩沖液和3 μ mol/L的測序引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端插入通用Ml3序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC,則所述的測序引物序列為:TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一種使用權(quán)利要求1~7所述試劑盒檢測BRAF基因熱點突變的方法，其特征在于它包括如下步驟: (1)目的基因熒光定量PCR擴增:使用試劑盒中的PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，得到目的基因的熒光定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物； (2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，使用試劑盒中的酶消化液，對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進行純化，得到純化后PCR產(chǎn)物； (3)使用試劑盒中的測序反應(yīng)液，對步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)，得到測序PCR產(chǎn)物； (4)使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化液，對步驟(3)得到的測序PCR產(chǎn)物進行純化，得到純化后測序PCR產(chǎn)物； (5)將步驟(4)得到的純化后測序PCR產(chǎn)物加樣至測序儀進行序列分析，測序所得基因序列與BRAF基因標(biāo)準序列進行比對，判斷是否存在BRAF基因熱點突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571948SQ201310466109
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】陳剛, 葉倫, 李雪梅, 付金玲 申請人:武漢康錄生物技術(shù)有限公司