一種用于檢測(cè)kras基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，利用鉗夾技術(shù)封閉野生型KRAS基因序列，從而提高sanger測(cè)序法的靈敏度和KRAS基因突變的檢出率。本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、安全，不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟(jì)高效；同時(shí)還具有操作時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)檢測(cè)過程可在4～6小時(shí)內(nèi)完成。
【專利說明】—種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]RAS基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種:HRAS、KRAS和NRAS，分別定位在11、12和I號(hào)染色體上。KRAS因編碼21kD的ras蛋白又名p21基因。在RAS基因中，KRAS對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān):當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。她參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng)KRAS基因突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。
[0003]KRAS基因可以是正常狀態(tài)(稱為野生型)或異常狀態(tài)(突變型)。正常生理情況下，在細(xì)胞受到外界刺激后激活生長(zhǎng)因子等信號(hào)通路時(shí)，野生型的K-Ras被活性生長(zhǎng)因子等酪氨酸激酶磷酸化后短暫活化，活化后的KRAS可以激活該信號(hào)通路中的下游信號(hào)蛋白，而后K-ras迅速失活。KRAS激活/失活效應(yīng)是受控的。突變型K-Ras蛋白導(dǎo)致蛋白功能異常，在無生長(zhǎng)因子活化信號(hào)刺激下仍處于激活狀態(tài)，其功能狀態(tài)不可控，導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)增殖等。
[0004]目前用于基因突變檢測(cè)的方法有Sanger測(cè)序法、高效液相色譜法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。Sanger基因測(cè)序技術(shù)經(jīng)過了 30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對(duì)長(zhǎng)達(dá)1，OOObp的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，而且對(duì)每一個(gè)堿基的讀取準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%。由于具有很高的讀取準(zhǔn)確率，Sanger法測(cè)序成為基因突變、單核苷酸多態(tài)性等基因分析的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0005]腫瘤組織中，KRAS野生型細(xì)胞與突變型細(xì)胞混雜，而Sanger測(cè)序法的靈敏度僅為10~20%，即當(dāng)突變型細(xì)胞占整體檢測(cè)細(xì)胞的10~20%時(shí)才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測(cè)序法的應(yīng)用。
[0006]肽核酸(peptide nucleic acids, PNA) 一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對(duì)的形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補(bǔ)DNA具有I個(gè)堿基不匹配時(shí)，其溶解溫度會(huì)下降8 V~20°C，2個(gè)堿基不匹配時(shí)則完全不能雜交。鑒于上述諸多DNA分子不具備的優(yōu)點(diǎn)，近十年來，人們?yōu)槠湓谠S多高【技術(shù)領(lǐng)域】找到了用途。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明采用PNA鉗夾技術(shù)封閉野生型BRAF基因序列，從而提高檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的敏感度和突變檢出率。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、PNA試劑、酶消化液、測(cè)序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液，所述PCR反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列為SEQ.1D N0.2，所述探針的序列為SEQ.1D N0.3，所述探針的5’端的熒光基團(tuán)為FAM，3’端的熒光基團(tuán)為BHQl ;所述PNA的序列為SEQ.1D N0.4 ;所述測(cè)序反應(yīng)液中含有Bi gdye、Bigdye緩沖液和測(cè)序引物。
[0010]上述方案中，所述PCR緩沖液由100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/LMgCl2組成；所述dNTPs的摩爾濃度為2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L ;所述探針的摩爾濃度為IOymol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/ μ I ;所述PNA試劑的摩爾濃度為10 μ mol/L。
[0011]上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶I和堿性磷酸酶。
[0012]上述方案中，所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5:2。
[0013]上述方案中，所述測(cè)序反應(yīng)液含有5XBigdye、2.5XBigdye緩沖液和3 μ mol/L的測(cè)序引物。
[0014]上述方案中，所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶液。
[0015]上述方案中，在所述PCR正向引物的5’端插入通用Ml3序列:
[0016]TGTAAAACGACGGCCAGT，在所`述PCR反向引物的5’端插入通用Ml3序列:
[0017]CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測(cè)序引物序列為:
[0018]TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0019]一種利用上述試劑盒檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的方法，具體包括如下步驟:
[0020](I)目的基因熒光定量PCR擴(kuò)增:使用試劑盒中熒光定量PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到目的基因的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；
[0021](2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，使用試劑盒中的酶消化液，對(duì)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后PCR產(chǎn)物；
[0022](3)使用試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)液，對(duì)步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，得到測(cè)序PCR產(chǎn)物；
[0023](4)使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化液，對(duì)步驟(3)得到的測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后測(cè)序PCR產(chǎn)物；
[0024](5)將步驟(4)得到的純化后測(cè)序PCR產(chǎn)物加樣至測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，測(cè)序所得基因序列與NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中KRAS基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，并查看峰圖，判斷是否存在KRAS基因熱點(diǎn)突變:若峰圖中KRAS基因熱點(diǎn)突變區(qū)域12位點(diǎn)GGT峰圖下游典型的突變套峰，或者完全為突變峰圖，可知樣本中部分或全部細(xì)胞含有KRAS熱點(diǎn)突變區(qū)域12位點(diǎn)。本發(fā)明的有益效果:
[0025](I)本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，在對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用PNA試劑封閉野生型KRAS基因序列，提高sanger測(cè)序法的靈敏度和KRAS基因突變的檢出率。[0026](2)本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、安全，同時(shí)不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟(jì)高效。
[0027](3)本發(fā)明檢測(cè)方法操作時(shí)間短，整個(gè)檢測(cè)過程可在4~6小時(shí)內(nèi)完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為KRAS基因突變熱點(diǎn)區(qū)域序列，其中下劃線代表引物序列或引物結(jié)合位點(diǎn)，方框代表探針序列或探針結(jié)合位點(diǎn)，下劃虛線代表PNA序列或PNA結(jié)合位點(diǎn)，斜體字母代表突變位點(diǎn)。 [0029]圖2為實(shí)施例1中KRAS基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0030]圖3為實(shí)施例1中KRAS基因測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、表格、實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)例。
[0032]實(shí)施例1
[0033]1、試劑盒中PCR反應(yīng)液中的引物、探針序列的合成和PNA序列的合成
[0034]根據(jù)KRAS基因熱點(diǎn)突變區(qū)域和測(cè)序片段的要求(見圖1)，設(shè)計(jì)如下引物、探針和PNA，并用人工合成的方法合成如下引物、探針和PNA:
[0035]KRAS12F:ACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTA (SEQ.1D N0.1)
[0036]KRAS12R:CTTTATCTGTATCAAAGAATGGTCCTG (SEQ.1D N0.2)
[0037]KRAS12P:FAM-ACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGT-BHQ1 (SEQ.1D N0.3)
[0038]KRAS12PNA:GGAGCTGGTGGCGTAGGC (SEQ.1D N0.4)
[0039]上述引物、探針和PNA序列均為5’端至3’端，12表示KRAS突變熱點(diǎn)區(qū)域密碼子編號(hào)，F(xiàn)表示正向引物，R表示反向引物，P表示探針，F(xiàn)AM表示探針中突光基團(tuán)，BHQl表示淬滅基團(tuán)。
[0040]在上述正向引物的5’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在反向引物的5’端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC，該通用引物插入的意義在于能夠使本實(shí)驗(yàn)方案后于的測(cè)序反應(yīng)均使用統(tǒng)一的測(cè)序引物。
[0041]2、目的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增:利用上述合成的PCR引物、探針和PNA序列，通過熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到熒光定量PCR產(chǎn)物。
[0042](I)提取樣本DNA:人工合成KRAS基因突變熱點(diǎn)區(qū)域野生型和突變型基因，KRAS基因突變熱點(diǎn)區(qū)域野生型的序列為SEQ.1D N0.5，KRAS基因突變熱點(diǎn)區(qū)域突變型的序列為SEQ.1D N0.6，分別轉(zhuǎn)化入DH5 α大腸桿菌后培養(yǎng)，然后以野生型菌:突變型菌濃度比為99:1混合，再提取混合菌液DNA，得到樣本DNA ；
[0043](2)使用試劑盒中PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對(duì)上述樣本DNA進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)擴(kuò)增，得到目的片段DNA，PCR反應(yīng)體系為25 μ I體系:
[0044]FCR反燉液4.2μΙ
PNAI μ!
樣木DNA2μ1
雙蒸水17.8μΙ
[0045]上述PCR反應(yīng)液含有10X100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KC1、15mmol/LMgCl2、、
2.5mmol/L dNTPs、10 μ mol/L 正向引物、10 μ mol/L 反向引物、10 μ mol/L 探針、5U/μ I TaqDNA聚合酶；上述PNA試劑的摩爾濃度為10 μ mol/L ;其中正向引物的序列為SEQ.1D N0.1，反向引物的序列為SEQ.1D N0.2，探針的序列為SEQ.1D N0.3，PNA的序列為SEQ.1D N0.4。
[0046](3) PCR擴(kuò)增程序如下表:
[0047]表1PCR擴(kuò)增程序
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液、PNA試劑、酶消化液、測(cè)序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液，所述PCR反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列為SEQ.1D N0.2，所述探針的序列為SEQ.1D N0.3，所述探針的5’端的熒光基團(tuán)為FAM，3’端的熒光基團(tuán)為BHQl ;所述？嫩的序列為SEQ.1D N0.4 ;所述測(cè)序反應(yīng)液包含Bigdye、Bigdye緩沖液和測(cè)序引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液由lOOmmol/LTris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2 組成；所述 dNTPs 的摩爾濃度為 2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩爾濃度為10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩爾濃度為ΙΟμπιοΙ/L;所述探針的摩爾濃度為10 μ mol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/μ I ;所述PNA試劑的摩爾濃度為10 μ mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶I和堿性磷酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述測(cè)序反應(yīng)液含有5XBigdye、2.5 X Bigdye緩沖液和3 μ mol/L的測(cè)序引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端 插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列:CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測(cè)序引物序列為:TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一種使用權(quán)利要求1~7所述試劑盒檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的方法，其特征在于它包括如下步驟: (1)目的基因熒光定量PCR擴(kuò)增:使用試劑盒中的PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到目的基因的熒光定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物； (2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，使用試劑盒中的酶消化液，對(duì)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后PCR產(chǎn)物； (3)使用試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)液，對(duì)步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，得到測(cè)序PCR產(chǎn)物； (4)使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化 液，對(duì)步驟(3)得到的測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后測(cè)序PCR產(chǎn)物； (5)將步驟(4)得到的純化后測(cè)序PCR產(chǎn)物加樣至測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，測(cè)序所得基因序列與KRAS基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，并查看峰圖，判斷是否存在KRAS基因熱點(diǎn)突變。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571947SQ201310466108
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】葉倫, 李雪梅, 付金玲, 陳剛 申請(qǐng)人:武漢康錄生物技術(shù)有限公司