一種基因載體系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基因載體系統(tǒng)，包括：pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)；所述pH敏感遮蔽體系為聚谷氨酸酯與2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巰基乙酸反應(yīng)并脫叔丁氧羰基保護得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亞胺或小分子烷胺引發(fā)γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐開環(huán)聚合得到；所述pH敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(2～100)：1；所述pH敏感遮蔽體系與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(5～80)：1；所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。本發(fā)明還提供了一種基因載體系統(tǒng)的制備方法以及一種氨基酸聚合物。本發(fā)明提供的基因載體引入了更多的帶電基團，減少了遮蔽體系的用量，降低了應(yīng)用時因遮蔽體系而產(chǎn)生的細胞毒性。
【專利說明】ー種基因載體系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物載體領(lǐng)域，特別涉及基因載體系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療作為一種新興的治療模式已經(jīng)有了很大的發(fā)展，在人類攻克遺傳疾病及癌癥等頑癥的過程中占據(jù)著重要地位，并逐步成為ー種常見的有效手段?；蛑委熓侵笇⑼庠凑；?qū)氚屑毎约m正基因的缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的的生物醫(yī)學新技木。利用載體將外源基因?qū)氚屑毎签`種基因治療的有效方法，成功的基因治療對基因載體的依賴性很大。常見的載體包括病毒類載體和非病毒載體，但是病毒類載體在臨床應(yīng)用中存在著很大的安全隱患，在基因治療歷史上不乏有患者死亡事件及并發(fā)癥等的出現(xiàn)，在很大程度上都是由病毒類基因載體的不安全性造成的。
[0003]非病毒載體多為高分子陽離子聚合物，因其安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點，已成為病毒類載體最有希望的替代者。其中陽離子聚合物聚乙烯亞胺是非病毒類載體中受到關(guān)注最多的一個(Molecular design oi functional polymers lor gene therapy.JeongJH, Kim SW, Park TG.Park.Prog.Polym.Sc1.2007 ；32(11):1239-1274),它在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染實驗中得到應(yīng)用并取得了一定的效果，但由于其毒性高、轉(zhuǎn)染效率低于病毒類載體、在體內(nèi)運輸過程的非特異性吸附以缺乏靶向性等缺點，阻礙了它的進ー步發(fā)展(Genetransfer with lipospermines and poiyethyienimines.Remy JS，Abdalian B，ZantaMAj Boussif 0，Behr JPj Demeneix B.Adv.Drug Deliver.Revl998Mar2 ；30(l-3):85-95.)D
[0004]腫瘤的理想基因治療過程為:載有基因物質(zhì)的基因載體在血液中循環(huán)，到達腫瘤組織后被腫瘤細胞內(nèi)吞并完成轉(zhuǎn)染治療。但是，血液中含有很多帶負電的蛋白類物質(zhì)，帶正點的載體容易與其吸附凝聚成大顆粒而發(fā)生沉淀(Poly (glycoamidoamine) s for genedelivery, structural ef`iects on cellular internalization, Duffermg capacity, andgene expression。Liu，Y，and Reineke，T.M.Bioconjugate Chem.2007 ;18，19-30.);而且，正常體液環(huán)境中的細胞表面帶負電，帶正電的載體也容易接近正常細胞，被正常細胞內(nèi)呑，因此，載體難于到達腫瘤組織，導致轉(zhuǎn)染效率低。
[0005]為了提高基因載體體系進入目標組織細胞的效率，常用的方法是引入遮蔽體系。遮蔽體系通常選用帶負電的高分子材料，復合在基因載體體系表面，使整個顆粒帶負電。避免在血液運輸過程中的非特異性吸附。但引入的遮蔽體系表面所帯的負電會與細胞表面帶負電荷產(chǎn)生斥力，影響載體體系與細胞的結(jié)合效率，致使其轉(zhuǎn)染效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供ー種基因載體系統(tǒng)，本發(fā)明提供的基因載體系統(tǒng)具有較高的轉(zhuǎn)染效率。
[0007]本發(fā)明提供了ー種基因載體系統(tǒng)，包括:pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)；[0008]所述pH敏感遮蔽體系為聚谷氨酸酯與2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巰基こ酸反應(yīng)并脫叔丁氧羰基保護得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亞胺或小分子烷胺引發(fā)
Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐開環(huán)聚合得到；
[0009]所述pH敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(2~100):1 ；
[0010]所述pH敏感遮蔽體系與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(5~80):1 ;
[0011]所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。
[0012]優(yōu)選的，所述聚谷氨酸酯中，Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為(1.5~50):1, y -丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與小分子燒胺的質(zhì)量比為(2 ~200):1。
[0013]優(yōu)選的，所述pH敏感遮蔽體系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩爾數(shù)與2-叔丁氧羰基氣基こ硫醇中所含疏基和疏基こ酸所含疏基的摩爾數(shù)之和的比例為1:(2~20);所述
2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇與巰基こ酸的摩爾比為1:(0.1~10)。
[0014]優(yōu)選的，所述陽離子載體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(0.5~50):1。
[0015]優(yōu)選的，所述陽離子載體為聚乙烯亞胺，其數(shù)均分子量為500~40000。
[0016]優(yōu)選的，所述pH敏感遮蔽體系中，聚乙烯亞胺具有式I線性結(jié)構(gòu)或式II支化結(jié)
構(gòu)，
[0017]
【權(quán)利要求】
1.ー種基因載體系統(tǒng)，包括:pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)； 所述PH敏感遮蔽體系為聚谷氨酸酯與2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巰基こ酸反應(yīng)并脫叔丁氧羰基保護得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亞胺或小分子烷胺引發(fā)Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐開環(huán)聚合得到； 所述PH敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(2~100):1 ； 所述PH敏感遮蔽體系與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(5~80):1 ； 所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中，Y-丙炔基--谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為(1.5~50):1，Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與小分子燒胺的質(zhì)量比為(2~200):1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述PH敏感遮蔽體系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩爾數(shù)與2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇中所含巰基和巰基こ酸所含巰基的摩爾數(shù)之和的比例為1:(2~20);所述2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇與巰基こ酸的摩爾比為1:(0.1 ~10)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述陽離子載體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(0.5~50):1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述陽離子載體為聚乙烯亞胺，其數(shù)均分子量為500~40000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述pH敏感遮蔽體系中，聚乙烯亞胺具有式I線性結(jié)構(gòu)或式II支化結(jié)構(gòu)，
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述pH敏感遮蔽體系中，聚乙烯亞胺的數(shù)均分子量為500~25000，小分子烷胺的分子量為50~500。
8.ー種基因載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟: A)將基因物質(zhì)與陽離子載體混合孵育，得到二元復合物； 所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA ; B)將所述二元復合物與pH敏感遮蔽體系混合，得到基因載體系統(tǒng)； 所述PH敏感遮蔽體系為聚谷氨酸酯與2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巰基こ酸反應(yīng)并脫叔丁氧羰基保護得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亞胺或小分子烷胺引發(fā)Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐開環(huán)聚合得到； 所述PH敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(2~100):1 ； 所述PH敏感遮蔽體系與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(5~80):1 ； 所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中，Y-丙炔基-し-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為(1.5~50):1，Gamma-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與小分子燒胺的質(zhì)量比為(2~200):1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述混合孵育的時間為10~30分鐘。
11.一種氨基酸聚合物，為聚谷氨酸酯與2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巰基こ酸反應(yīng)并脫叔丁氧羰基保護得到的聚合物；所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亞胺或小分子烷胺引發(fā)Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐開環(huán)聚合得到。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的氨基酸聚合物，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中所含氮的摩爾數(shù)與2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇中所含巰基和巰基こ酸所含巰基的摩爾數(shù)之和的比例為1: (2~20);所述2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇與巰基こ酸的摩爾比為1:(0.1~10);所述Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為(1.5~50):1 ;所述Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐與小分子烷胺的質(zhì)量比為(2~200):1。
【文檔編號】C12N15/87GK103497961SQ201310442744
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】田華雨, 焦自學, 陳學思, 林琳, 郭兆培, 陳杰 申請人:中國科學院長春應(yīng)用化學研究所