甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜mapk1基因家族及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPK1基因家族及其應用；所述包括甘藍MAPK1基因和白菜MAPK1基因，所述甘藍型油菜MAPK1基因家族包括2個成員：BnMAPK1-1基因和BnMAPK1-2基因；蕓薹屬4個MAPK1基因之間具有較高的同源性；本發(fā)明還公開了上述基因家族在植物分子育種中的應用，通過構(gòu)建正義超量表達植物載體，轉(zhuǎn)化甘藍型油菜品種中油821后，獲得12株轉(zhuǎn)基因植株。與非轉(zhuǎn)基因的外植體對照相比，轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育加快，植株粗壯，同時抗性提高，是油菜品種改良的新資源。
【專利說明】甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPK1基因家族及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及甘藍型油菜(Brassica napus)及其親本物種甘藍(Brassica oleracea)和白菜(Brassica rapa)MAPKl基因家族及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]蕓薹屬(Brassica)是蕓薹科(Brassicacease)最重要的一個屬,含有世界性的重要蔬菜、油料和觀賞作物，如白菜(B.rapa)、甘藍(B.0leracea)和甘藍型油菜(B.napus),而且甘藍型油菜是由白菜和甘藍通過天然種間雜交并加倍而形成的異源四倍體。擬南芥(Arabidopsis thaliana)則是來自蕓薹科的研究最深入的模式植物。染色體分子標記共線性研究發(fā)現(xiàn)，蕓薹屬植物之間以及蕓薹屬與擬南芥之間均存在基因組水平和基因水平的保守性。同為蕓薹科的模式植物擬南芥功能基因組學的研究成果，為推動蕓薹屬植物重要性狀的分子機理研究和比較基因組學研究提供了重要參考。
[0003]蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是調(diào)控細胞響應各種外源信號的重要機制，MAPKs (促分裂原活化蛋白激酶)級聯(lián)途徑在內(nèi)源、外源信號傳導過程中發(fā)揮著重要的作用。植物中的MAPK通路是多種生長信號跨膜傳遞的共同通路，它可以將外源刺激轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)并引發(fā)細胞應答，從而調(diào)控基因表達、細胞生長 發(fā)育、細胞分裂分化以及凋亡等過程，因此，植物MAPK通路越來越受到人們的關(guān)注。MAPKl基因目前只在模式植物擬南芥中有研究，而在甘藍型油菜、甘藍和白菜等蕓薹屬植物MAPKl基因的成員數(shù)、蛋白特征、進化關(guān)系、表達的組織特異性、誘導表達特性和在基因工程中的應用等都未見報道。本研究通過克隆出甘藍型油菜、甘藍和白菜MAPKl基因，對其進行基本的生物信息學研究和表達特征研究，并在甘藍型油菜黑籽品種中正義超量表達MAPKl基因家族的一個成員，研究結(jié)果有助于進一步了解植物MAPK7的功能，為油菜油菜品種改良提供重要參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPKl基因家族。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明分別克隆了甘藍型油菜、甘藍、白菜MAPKl基因家族成員的全長cDNA和對應的基因組序列，并進行了系統(tǒng)的生物信息學分析和功能比較基因組學研究。結(jié)果顯示:
[0006]所述甘藍MAPKl (BoMAPKI)基因全長cDNA序列如SEQ ID N0.1所示；
[0007]所述白菜MAPKl (BrMAPKl)基因全長cDNA序列如SEQ ID N0.3所示；
[0008]所述甘藍型油菜MAPKl (BnMAPKl)基因家族包括2個成員:ΒηΜΑΡΚ1_1基因和BnMAPKl-2基因；所述BnMAPKl-1全長cDNA序列如SEQ ID N0.5所示；所述BnMAPKl-2全長cDNA序列如SEQ ID N0.7所示。
[0009]所述BoMAPKI的基因組DNA序列如SEQ ID N0.2所示；[0010]所述BrMAPKl的基因組DNA序列如SEQ ID N0.4所示；
[0011]所述BnMAPKl-1的基因組DNA序列如SEQ ID N0.6所示，所述BnMAPKl-2的基因組DNA序列如SEQ ID N0.8所示。
[0012]蕓薹屬MAPKl基因家族4個成員的4條MAPKl基因之間具有較高的同源性，基因組DNA水平一致率為91.9-99.9%，編碼區(qū)水平的一致率為96.7_100%，基因組DNA水平一致率為91.9-99.9%,編碼區(qū)水平的一致率為96.7-100% ;蕓薹屬MAPKl基因家族4個MAPKl成員與與擬南芥AtMPKl基因間因組DNA水平一致率為57.9-59.0%，編碼區(qū)水平的一致率為89.3-89.4%，一致率為94.3-94.9%，相似率為96.0-96.5%。核酸水平的序列比對、系統(tǒng)發(fā)生聚類、特征性變異堿基、特征性變異氨基酸等方面都表明，蕓薹屬4條MAPKl基因都是AtMPKl基因的垂直同源基因，具有相似的結(jié)構(gòu)特征。
[0013]實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，三個物種中MAPKl基因在檢測的器官中均有表達。在甘藍型油菜中，MAPKl基因在根和莖中的表達量較高，蕾和花中的表達量則較低。在甘藍中，MAPKl基因在葉片的表達量最高，而在其它器官中的表達量差別不大，均約為葉片中的1/2。在白菜中，MAPKl基因主要在根中表達，其它器官中的表達量很低，在蕾和花中只檢測到微弱的表達。
[0014]實時熒光定量PCR還檢測發(fā)現(xiàn)，在不同的外源誘導條件下，甘藍型油菜MAPKl有不同的應答反應。在植物激素脫落酸(abscisic acid, ΑΒΑ),水楊酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理后，甘藍型油菜MAPKl基因的表達量均有所上升，并在2h時達到最高。在逆境條件下，甘藍型油菜MAPKl基因的表達也發(fā)生變化。在損傷(wounding)和高溫(heat)條件下，甘藍型油菜MAPKl基因的表達量發(fā)生上調(diào)，并在2h時達到最高。在H2O2處理后，甘藍型油菜MAPKl基因的表達迅速上調(diào)，在0.5h時達到最高，而在Ih后的表達量則保持穩(wěn)定。在真菌核菌盤(Sclerotinia sclerotiorum)的誘導下,甘藍型油菜MAPKl基因上調(diào)相對較為緩慢，在3h時無明顯的上調(diào)，而在6h時則達到最大，隨后表達量下降，在48h時恢復至原來的水平。
[0015]本研究分析表明，甘藍型油菜MAPKl能夠被機械損傷，茉莉酸甲酯(MeJA)，水楊酸(SA)，脫落酸(ABA)，過氧化氫(H2O2),高溫和核菌盤誘導表達量升高，除水楊酸外，其它誘導條件下，甘藍型油菜MAPKl基因均只出現(xiàn)了少量的上調(diào)，而在水楊酸誘導性，甘藍型油菜MAPKl基因出現(xiàn)了大幅度的提升。除過氧化氫和核菌盤外，在其它誘導條件下，甘藍型油菜MAPKl的表達量幾乎都在2h達到頂峰。
[0016]基于上述結(jié)果，利用本發(fā)明的BoMAPKl、BrMAPKl、BnMAPKl基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建MAPKI基因重組表達載體和轉(zhuǎn)化體，用于MAPKI基因的超量表達、反義抑制、RNA干擾等。
[0017]本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍、白菜、甘藍型油菜MAPKl基因家族在植物品種改良和抗性育種中的應用。
[0018]為達到上述目的，本發(fā)明選取BnMAPKl基因家族I個正義超量表達片段BnMAPKl-1ox,(核苷酸序列與 SEQ ID N0.5 的 l_1620bp—致，并分別與 SEQ ID N0.1 的l-1620bp、SEQ ID N0.3 的 l_1599bp、SEQ ID N0.7 的 l_1604bp 高度相似)，將其插入PC2301M1B1載體的35S啟動子和NOS終止子之間，構(gòu)建了 BnMAPKl-1基因的正義超量表達載體pCM-BnMAPKl-lox培養(yǎng)pCM-BnMAPKl_lox工程菌株，并通過根癌農(nóng)桿菌介導的下胚軸侵染法轉(zhuǎn)入甘藍型油菜典型黑籽品種中油821，得到了 12株外源基因超量表達的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株在外觀性狀上總體上與非轉(zhuǎn)基因植株差異不大，背景性狀基本上一致，但與非轉(zhuǎn)基因的外植體對照相比，轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育加快，同時抗性提高，是油菜品種改良的新資源。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了 MAPKl基因在甘藍型油菜、甘藍、白菜中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、進化關(guān)系、表達的器官組織特異性和誘導特性等，并采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在甘藍型油菜黑籽品種中正義超量表達MAPKl基因家族的一個成員，轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育加快，同時抗性得到提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中:
[0021]圖1甘藍型油菜、甘藍、白菜MAPKl基因家族全長cDNA擴增的電泳圖。其中(A)M:Trans2K plus DNA marker, I =BnMAPKl-1cDNA, 2 =BnMAPK1-2cDNA, (B) M:Trans2Kplus DNAmarker, I:BoMAPKlcDNA, 2:BrMAPKlcDNA。
[0022]圖2甘藍型油菜、甘藍、白菜MAPKl基因家族基因組DNA擴增的電泳圖。其中(A)M:Trans2K plus DNA marker, I:BnMAPKl-lgDNA, 2:BnMAPKl-2gDNA, (B)M:Trans2KplusDNA marker,I =BoMAPKlgDNA,2:BrMAPKIgDNA。
[0023]圖3BnMAPKl、BoMAPKUrMAPKl家族間及與AtMAPKl間的蛋白多重比對。
[0024]圖4BnMAPKl、BoMAPKl、BrMAPKl家族與擬南芥(At)等植物的同源蛋白的系統(tǒng)樹，各植物物種拉丁學名后面的第I個括弧為蛋白質(zhì)檢索號(protein id)。
[0025]圖5甘藍型油菜、甘藍和白菜MAPKl基因家族總體組織特異性檢測，其中Root:根，Stem:?, Leaf:葉,Bud:蕾,Flower:花,Seed:種子。
[0026]圖6誘導處理后BnMAPKlmRNA水平變化，其中CK:對照，Wounding:損傷，Heat:高溫,S.sclerotiorum:核菌盤,MeJA:茉莉酸甲酯,ABA:脫落酸,H2O2:過氧化氫,SA:水楊酸。
[0027]圖7ΒηΜΑΡΚ1-1的超量表達片段的擴增的電泳圖，其中M:Trans2K plus DNAmarker ； 1:ΒηΜΑΡΚ1-1οχ。
[0028]圖8 酶切圖，其中 A 為 pC2301MlBl 的 Xbal+StuI 雙酶切圖，M: λ-HindIII DNAmarker, 1:未酶切的pC2301MlBl質(zhì)粒，2:對應的Xbal+StuI雙酶產(chǎn)物；B為BnMAPKl-1基因重組T載體的Xbal+StuI完全雙酶切圖，其中M:Trans2K plus DNA marker, 1:未酶切的pGEM-T-BnMAPKl-lox 質(zhì)粒，2:對應的 Xbal+StuI 雙酶切產(chǎn)物。
[0029]圖9ΒηΜΑΡΚ1家族正義超量表達載體農(nóng)桿菌液的PCR檢測電泳圖，其中A、B、C分別為引物組合 F35S3N+R0VMAPK1-1、F0VMAPK1-1+RN0S5N、F35S3N+RN0S5N 的擴增產(chǎn)物。M:Trans2K plus DNA marker ； 1-3:農(nóng)桿菌工程菌株菌液。
[0030]圖10中油821轉(zhuǎn)化pCM-BnMAPKl-lox后的Basta抗性愈傷再生出小芽。
[0031]圖11中油821 RKpCM-BnMAPKl-1ox后再生小苗的生根。
[0032]圖12中油821轉(zhuǎn)化pCM-BnMAPKl-lox后再生植株抗Basta復檢，#1~#12是12株轉(zhuǎn)基因再生植株，CK是非轉(zhuǎn)基因中油821陰性對照。
[0033]圖13中油821轉(zhuǎn)化pCM-BnMAPKl-lox后抗Basta再生植株的PCR檢測，A、B、C分別為引物組合 F35S3N+R0VMAPK1-1、F0VMAPK1-1+RN0S5N、F35S3N+RN0S5N 的擴增產(chǎn)物。M:Trans2K plus DNA marker, 1-12:轉(zhuǎn)基因再生植株，13:陽性對照(工程菌株)，14:陰性對照(中油821)。
[0034]圖14CK (中油 821)、#2、#6 和 #9 接種核菌盤(Sclerotinia sclerotiorum) 48 小時。
[0035]圖15中油821超量表達BnMAPKl-1的轉(zhuǎn)基因苗#2、#6、#9和對照(中油821)【具體實施方式】
[0036]以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0037]優(yōu)選實施例采用的植物材料:甘藍型油菜為典型黑籽系中油821，白菜為白菜型油菜亞種(B.rapa ssp.0leifera)的黑籽系09L597，甘藍為羽衣甘藍變種(B.0leraceaacephala)的黑籽系09L598,均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供,常規(guī)大田試驗條件種植。
[0038]優(yōu)選實施例采用的試劑及試劑盒=TRIzol和GeneRacer試劑盒購于美國Invitrogen 公司。PrimeScript RT reagent Kit、DNA Ligation Kit、RNase Inhibitor 及λ-HindIII DNA Marker購自大連寶生物(TaKaRa)生物工程有限公司；pGEM_T easy載體連接試劑盒購自美國Promega公司；RNase_free DNase I和限制性內(nèi)切酶Xba1、StuI等購自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium, including vitamins)培養(yǎng)基為荷蘭 Duchefa 公司產(chǎn)品； EasyPurePlant Genomic DNA Kit、Trans2K plus DNA marker>Easy-Taq酶、dNTPs等試劑購自北京全式金(Transgen)生物技術(shù)有限公司；氨節(jié)青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、鏈霉素(Str)、頭孢霉素(Cef)、瓊脂糖、Tris, CTAB,Tris 飽和酌.(pH=8.0)、Tryptone、Yeast Extract、X_gal、IPTG> CTAB 等其它生化與分子生物學試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。
[0039]優(yōu)選實施例采用的主要儀器:ABI9700型PCR儀和Veriti?多重控溫PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；以及分子生物學和植物基因工程的其它常規(guī)儀器、設(shè)備和設(shè)施。
[0040]一、白菜、甘藍、甘藍型油菜MAPKl基因家族的克隆
[0041]所用引物見表1。
[0042]表1PCR 引物
[0043]
【權(quán)利要求】
1.甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPKl基因家族，其特征在于: 所述甘藍MAPKl基因全長cDNA序列如SEQ ID N0.1所示； 所述白菜MAPKl基因全長cDNA序列如SEQ ID N0.3所示； 所述甘藍型油菜MAPKl基因家族包括2個成員:ΒηΜΑΡΚ1-1基因和BnMAPKl-2基因；所述BnMAPKl-1全長cDNA序列如SEQ ID N0.5所示；所述BnMAPKl-2全長cDNA序列如SEQID N0.7 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPKl基因家族，其特征在于: 所述甘藍MAPKl的基因組DNA序列如SEQ ID N0.2所示； 所述白采MAPKl的基因組DNA序列如SEQ ID N0.4所不； 所述BnMAPKl-1的基因組DNA序列如SEQ ID N0.6所示，所述BnMAPKl-2的基因組DNA序列如SEQ ID N0.8所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPKl基因家族中任一種或多種基因或基因截短片段的重組表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體為含有正義超量表達片段的正義超量植物表達載體，所述正義超量表達片段的核苷酸序列與SEQ IDN0.5 的 l-1620bp 一致。.
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于:所述正義超量植物表達載體是將正義超量表達片段插入PC2301M1B1載體的35S啟動子和NOS終止子之間而得到。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述重組表達載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
7.權(quán)利要求1或2所述甘藍型油菜及其親本物種甘藍和白菜MAPKl基因家族在植物品種改良和抗性育種中的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK103468713SQ201310389076
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月31日
【發(fā)明者】梁穎, 柴友榮, 盧坤, 陸俊杏, 李加納, 陸奇豐, 張凱, 曲存民 申請人:西南大學