一株米曲霉及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了經(jīng)篩選誘變獲得的一株新菌株——米曲霉（Aspergillus?oryzae）2013-DP1，及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編：430072，保藏日期：2013年6月21日，保藏編號：CCTCC?No：M2013276。該菌株對稻草等低值的纖維素類物質(zhì)可以經(jīng)過發(fā)酵和酶解轉(zhuǎn)化，適當提高蛋白質(zhì)含量，提高其營養(yǎng)價值，可以促進飼料源的開發(fā)，提高了廢棄生物資源的利用率，有明顯的經(jīng)濟、生態(tài)意義。
【專利說明】一株米曲霉及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用(-)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及經(jīng)篩選誘變獲得的一株新菌株-米曲霉(Aspergillus oryzae)
2013-DP1，及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用。
(二)【背景技術】
[0002]我國人多地少，近年來，隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，人畜爭糧的矛盾相當突出，我國已成為一個飼料資源十分緊張的國家，尤其是蛋白質(zhì)飼料資源十分匱乏。由于蛋白質(zhì)是滿足畜禽生長發(fā)育和改善營養(yǎng)及品質(zhì)的主要營養(yǎng)成分之一，和能量成分構成了飼料的主體，飼料中蛋白含量及優(yōu)劣決定了飼料的營養(yǎng)價值。按最佳養(yǎng)殖技術，我國飼料中的蛋白質(zhì)資源量將缺口一半以上，隨著畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，蛋白質(zhì)飼料持續(xù)短缺并嚴重地制約著養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展。目前我國主要的飼料蛋白有魚粉和豆柏等，每年都大量進口。由于海洋資源的逐漸惡化和人類過度的捕撈，魚粉的供應量越來越不足，價格不斷增長。據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所的有關專家分析，到2020年，我國蛋白質(zhì)飼料供需缺口為0.48億噸。因此，單靠利用現(xiàn)有的常規(guī)蛋白飼料，已遠不能滿足我國飼料工業(yè)的需要，急需開發(fā)更多的新型蛋白飼料源。
[0003]微生物具有種類多、生長快速、營養(yǎng)要求簡單等優(yōu)點，能夠利用多種廢棄有機物生長繁殖并能轉(zhuǎn)化為動物可利用的有機營養(yǎng)物質(zhì)。例如，利用微生物發(fā)酵含有豐富纖維素的秸桿等有機物可以將難利用的大分子纖維素降解轉(zhuǎn)化為可利用的小分子有機物，同時，繁殖得到的大量的微生物菌體，菌體蛋白質(zhì)含量高于培養(yǎng)的有機物質(zhì)，并且含有豐富的氨基酸、維生素等。因此，利用微生物發(fā)酵有機物質(zhì)，是開發(fā)新型的蛋白飼料添加劑的極具潛力的途徑。
[0004]豆柏等柏類物質(zhì)是大豆等提取脂肪類物質(zhì)后的副產(chǎn)物，豆柏類物質(zhì)已經(jīng)成功開發(fā)成為可部分替代魚粉的植物蛋白飼料原料，近年來豆柏已經(jīng)在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應用。然而，豆柏中含有大量的抗營養(yǎng)因子，如大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子、大豆寡糖、植酸、棉酚草酸鹽、芥子油甙、單寧等。豆柏中也含有大豆球蛋白等抗原蛋白。這些抗營養(yǎng)因子物質(zhì)的存在會通過干擾動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、破壞正常的新陳代謝和引起不良的生理反應等方式影響動物的健康，在很大程度上影響了豆柏的利用。研究表明利用微生物發(fā)酵法處理豆柏后，可以通過微生物生長利用以及分泌的蛋白酶系對抗營養(yǎng)因子和抗原蛋白進行一定程度的降解，降低這些不良物質(zhì)在豆柏中的水平，顯著改善豆柏的營養(yǎng)品質(zhì)，實現(xiàn)豆柏的高效利用。
[0005]此外，我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品及輕工食品的加工生產(chǎn)中都會產(chǎn)生大量的富含纖維素、蛋白等物質(zhì)的有機物，如酒糟、秸桿、棉柏、工業(yè)廢棄有機物、米糠等，這些有機物都是很好的飼料原料，為生產(chǎn)菌體蛋白質(zhì)提供了充足的原料，只要能篩選出利用這些原料的微生物種類，可望開發(fā)出蛋白質(zhì)飼料添加劑。拿纖維素來說，我國有豐富的纖維素資源，僅秸桿每年的產(chǎn)量約5.7億噸，然而只有不到10%的量由于飼料生產(chǎn)，由于秸桿飼料粗纖維含量高，蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)含量低，畜禽消化率低，適口性差，從而限制了它的應用。經(jīng)過微生物處理加工后，可提升其品質(zhì)，包括降解大分子纖維素等物質(zhì)為容易消化吸收的小分子物質(zhì)，提高蛋白含量，提高營養(yǎng)價值，同時產(chǎn)生大量的有益微生物，改善動物腸道健康并提高動物產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，利用微生物發(fā)酵技術，開發(fā)非常規(guī)飼料資源來生產(chǎn)蛋白飼料添加劑，可有力緩解蛋白飼料資源的嚴重不足。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一株經(jīng)篩選誘變獲得的一株新菌株——米曲霉(AspergillusoryZae)2013-DPl，及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用。該菌可以利用豆柏、麩皮、稻桿等有機物為培養(yǎng)基生長，發(fā)酵后的有機物可以作為飼料添加劑。
[0007]本發(fā)明采用的技術方案是:[0008]米曲霉(Aspergillus oryzae)2013_DPl，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏編號=CCTCC No:M2013276。
[0009]本發(fā)明菌株最初是從自然條件下篩選獲得，產(chǎn)復合酶，包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等。在長期發(fā)酵培養(yǎng)有機物的過程中不斷提純復壯，進行改良。此外，對該菌進行了多輪紫外誘變育種，篩選得到了產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶能力提高的菌株2013-DP1，該菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化豆柏、秸桿等有機物的生產(chǎn)性能大大提高。
[0010]米曲霉菌株2013-DP1培養(yǎng)和繁殖方法:
[0011 ] 米曲霉可以在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯、瓊脂培養(yǎng)基)上培養(yǎng)，也可在查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)。可用于產(chǎn)朊假絲酵母KFl-1的生長和繁殖。培養(yǎng)溫度30°C。在該培養(yǎng)基上米曲霉生長旺盛，產(chǎn)生豐富的菌絲和大量的孢子。
[0012]PDA培養(yǎng)基配制:馬鈴薯200克(新鮮馬鈴薯去皮，切成塊狀，煮沸15min后，過濾取汁用)，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，自來水1000mL,自然pH。
[0013]查氏培養(yǎng)基配制=NaNO3,2g ；K2HP04, Ig ；KC1,0.5g ；MgS04,0.5g ；FeS04,0.01g ;蔗糖，30g ;瓊脂，15 ~20g ;水，lOOOmL，pH 自然。
[0014]上述兩種培養(yǎng)基在121°C下滅菌20分鐘。
[0015]菌落、形態(tài)學特征:米曲霉菌落質(zhì)地疏松，初白色至淡黃色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落中間部分開始產(chǎn)生大量的分生孢子，菌落正面變?yōu)榈G褐色，背面無色。菌落表面有絨毛狀菌絲，容易挑起。分生孢子梗著生在近球形的頂囊上，頂囊直徑150~300 μ m。分生孢子卵圓形、橢圓形，直徑3.5~5μπι。液體搖瓶培養(yǎng)時，菌絲易結(jié)球，產(chǎn)生大量的小菌絲球。
[0016]生理特性和代謝特性:米曲霉菌株2013-DP1能利用常見的單糖，如葡萄糖、半乳糖、果糖等。也能發(fā)酵利用二糖，如蔗糖、麥芽糖。糖蜜等混合物也是米曲霉生長利用的很好的碳源物質(zhì)。還可以發(fā)酵利用秸桿、糖渣、豆柏、麩皮、玉米粉、鋸末等含有大量多糖和蛋白質(zhì)的有機物質(zhì)，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)菌體蛋白、飼料添加劑、纖維素酶、淀粉酶等。
[0017]本發(fā)明還涉及所述的米曲霉2013-DP1在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用。
[0018]具體的，所述的應用為:取豆柏、麩皮、秸桿中的一種或多種，加水至含水量為40~50% (w/w)，再經(jīng)高溫滅菌制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接種米曲霉2013-DP1，進行好氧發(fā)酵培養(yǎng)48~64h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)烘干、粉碎后制成飼料添加劑。
[0019]通常，菌株在進行發(fā)酵培養(yǎng)之前，一般還需經(jīng)種子擴大培養(yǎng)，超低溫保存或凍干粉保存的菌種經(jīng)過PDA培養(yǎng)基平板上接種活化后，接種到種子搖瓶進行培養(yǎng)獲得種子液，然后接種到發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐進行菌體放大培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得大量菌體后，按照一定比例的接種量(一般為10%體積比)與豆柏、麩皮、秸桿粉等有機物基質(zhì)混合后培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵基質(zhì)含合適量的水分(40~50%)。經(jīng)過一定時間的發(fā)酵，微生物對多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進行降解和轉(zhuǎn)化。發(fā)酵過程中經(jīng)過翻料、溫度控制、透氣性調(diào)節(jié)等措施處理，來保證發(fā)酵的正常進行。發(fā)酵后的基質(zhì)進行烘干、粉碎后制成飼料添加劑成品。
[0020]米曲霉制備發(fā)酵豆柏等有機物制備飼料添加劑的工藝流程如下:
[0021]培養(yǎng)基物料的滅菌、熟化處理一料水配比、菌種接種一固態(tài)發(fā)酵一翻料透氣——烘干一一粉碎——成品。
[0022]具體的，所述的菌種米曲霉菌株2013-DP1可以在PDA培養(yǎng)基(每升含馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，自來水1000毫升，自然pH)上培養(yǎng)活化。低溫保藏的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置于30°C培養(yǎng)箱，進行活化培養(yǎng)72h?；罨木杲臃N3~5個單菌落到種子搖瓶(PDA培養(yǎng)基，不含瓊脂)，在轉(zhuǎn)速為200rpm，3(TC的搖床上進行種子液的制備。種子搖瓶進行培養(yǎng)24h后，按照10%菌種接種量接種到發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐(培養(yǎng)基同上)進行菌體放大培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，按照物料重量的10%進行接種，發(fā)酵。
[0023]發(fā)酵過程中，每隔24h翻料一次，以進行充分透氣，便于微生物進行充分的有氧發(fā)酵。同時，監(jiān)測發(fā)酵物料的溫度變化，物料堆的內(nèi)部溫度過高(大于50°C )時，進行翻料降溫。當沒有加熱設備，在自然環(huán)境條件下發(fā)酵時，如果環(huán)境溫度較低時，可以適當延長發(fā)酵時間。發(fā)酵過程中還需觀察發(fā)酵物料的狀況變化，包括顏色外觀、氣味的變化、發(fā)酵物中有沒有發(fā)黑、霉變、結(jié)塊等現(xiàn)象。
[0024]本發(fā)明菌株發(fā)酵豆柏后可以生產(chǎn)富含酸溶蛋白(小肽)等活性肽的蛋白飼料添加劑。該菌株分泌大量的高活性纖維素酶，利用該菌株可以高效發(fā)酵秸桿，并提高其蛋白質(zhì)的含量。由于我國廢棄的農(nóng)工業(yè)副產(chǎn)品量較大，利用本發(fā)明中的微生物菌株，開發(fā)出既能部分替代和補充現(xiàn)有飼料品種、又能 降低成本的新的蛋白質(zhì)飼料資源，對飼料工業(yè)具有極其重要的意義，且可行性較高。
[0025]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明中通過篩選培養(yǎng)和選育獲得了一株米曲霉菌株2013-DP1，該菌株產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等酶系的能力強，能夠?qū)Χ拱?、纖維素類的飼料原料物質(zhì)進行發(fā)酵降解和轉(zhuǎn)化。利用該菌株對豆柏進行發(fā)酵處理，可以顯著提高蛋白質(zhì)含量，對原料豆柏的粗蛋白含量提高6%以上，同時產(chǎn)生大量的可溶性小肽(酸溶蛋白含量達12%以上)。此外，該菌發(fā)酵的豆柏可以有效地降解豆柏中的抗營養(yǎng)因子和抗原蛋白，顯著提高豆柏的營養(yǎng)品質(zhì)，提高動物對豆柏的利用效率從而改善動物健康。該菌株對稻草等低值的纖維素類物質(zhì)可以經(jīng)過發(fā)酵和酶解轉(zhuǎn)化，適當提高蛋白質(zhì)含量，提高其營養(yǎng)價值，可以促進飼料源的開發(fā)，提高了廢棄生物資源的利用率，有明顯的經(jīng)濟、生態(tài)意義。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為米曲霉2013-DP1在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；
[0027]圖2為米曲霉發(fā)酵液粗酶液的纖維素酶活鑒定；
[0028]圖3為米曲霉在S*柏培養(yǎng)基上的水解圈。(五)【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0030]實施例1:菌株的篩選和選育
[0031 ] 分離產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶活性較高的米曲霉 [0032]從秸桿等廢棄植物樣品中分離米曲霉。制備PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，自來水lOOOmL，自然pH，121°C下滅菌20min)。取可能含有米曲霉的樣品，磨碎后取I克加入到99mL水中，充分振蕩混勻IOmin后取100 μ L涂布于PDA平板。放置于25°C培養(yǎng)48h后觀察菌落，挑選出候選的米曲霉菌株，進行單孢分離純化，進一步顯微鏡觀察鑒定后保存菌株進行進一步實驗。
[0033]初篩的菌株經(jīng)過多次培養(yǎng)和誘變育種后，篩選獲得對豆柏等具有發(fā)酵能力的菌株2013-DP1。該菌株的產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶活性鑒定如下:
[0034]剛果紅顯色法鑒定纖維素酶。剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復合物，但不能和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應，當在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅就會與纖維素結(jié)合形成剛果紅-纖維素紅色復合物，當培養(yǎng)基中的纖維素被分解后，剛果紅-纖維素復合物就無法形成，用氯化鈉洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，這樣培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素降解酶或菌為中心的透明圈。
[0035]米曲霉在液體培養(yǎng)液(上述馬鈴薯培養(yǎng)基不加瓊脂，補加10g/L的稻草粉)中培養(yǎng)后離心除去菌絲，取上清液(粗酶液)在含有纖維素底物的培養(yǎng)皿平板上進行鑒定。具體為:用含0.5%CMC-Na底物和20g/L瓊脂的水溶液制成固體培養(yǎng)皿，將10 μ L的粗酶液滴在培養(yǎng)皿上，蓋上蓋子，37 °C培養(yǎng)箱反應3~4h，用0.1 %的剛果紅染色液浸染30min，用水沖洗，再用IM的NaCl溶液脫色15min。出現(xiàn)明顯的黃色透明圈，說明米曲霉的發(fā)酵液有纖維素酶活性。剛果紅染色平板見圖2。
[0036]米曲霉菌株2013-DP1產(chǎn)蛋白酶活性鑒定。通過米曲霉在干酪素平板和豆柏平板上的水解圈，來判斷是否產(chǎn)蛋白酶及活性高低。
[0037]干酪素培養(yǎng)基平板，牛肉膏:3g，干酪素:10g，瓊脂:20g, Nacl:5g，水:lOOOmL，磷酸氫二鈉:28，最終？!1=7.4。按照以2g干酪素溶于50mL緩沖液(0.lmol/1磷酸氫二鈉一磷酸氫二鈉pH=8)微熱溶解。豆柏培養(yǎng)基平板，以1000mL培養(yǎng)基為標準，加入20g左右的豆柏粉，然后煮沸l(wèi)h，過濾豆柏粉渣，待其冷卻后加入20g瓊脂粉，混合攪拌，在121°C高壓濕熱滅菌15min，待冷卻后倒平板。將菌株接種在以上培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時后，觀察其水解圈大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌落邊緣有水解圈產(chǎn)生(圖3)。
[0038]以上結(jié)果顯示，本發(fā)明米曲霉菌株2013-DP1產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶能力較強。
[0039]實施例2:
[0040]PDA培養(yǎng)基配制:馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，自來水1000毫升，自然pH，121°C下滅菌20分鐘。
[0041]低溫保藏的米曲霉菌株CCTCC No:M2013276接種到PDA培養(yǎng)基上，置于30°C培養(yǎng)箱，進行活化培養(yǎng)72h。
[0042]活化的菌株接種3~5個單菌落到種子搖瓶(PDA培養(yǎng)基，不含瓊脂)，在轉(zhuǎn)速為200rpm, 30°C的搖床上進行培養(yǎng)24h后，得到種子液。[0043]取豆柏，加水至含水量為45%，121°C下滅菌20分鐘制成發(fā)酵培養(yǎng)基，按照10%體積比接種米曲霉種子液，進行好氧發(fā)酵培養(yǎng)64h (每隔24h翻料一次)，發(fā)酵結(jié)束后，取少許發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過烘干至水分大約10%左右，粉碎后過90目篩，檢測各指標含量。
[0044]原料豆柏的粗蛋白含量45.93%，酸溶蛋白含量4.58%。
[0045]發(fā)酵產(chǎn)物中:水分11.00%,粗蛋白53.63%，酸溶蛋白12.93%，揮發(fā)性鹽基氮35.23mg/100g。
[0046]實施例3:
[0047]米曲霉菌株CCTCC No:M2013276的活化及種子培養(yǎng)同實施例2。
[0048]取豆柏:麩皮:稻草粉質(zhì)量比1:1:1的混合物，加水至含水量為40%，121°C下滅菌20分鐘制成發(fā)酵培養(yǎng)基，按照10%體積比接種米曲霉種子液，進行好氧發(fā)酵培養(yǎng)48h (每隔24h翻料一次)，發(fā)酵結(jié)束后，取少許發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過烘干至水分大約10%左右，粉碎后過90目篩，檢測各指標含量。
[0049]各原料的粗蛋白含量:豆柏，45.93%;麩皮，14.57% ;稻草粉，2.89%。
[0050]發(fā)酵產(chǎn)物中:水分11.00%，粗蛋白25.63%，酸溶蛋白4.89%。
【權利要求】
1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae) 2013-DP1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏編號:CCTCC No:M2013276。
2.如權利要求1所述的米曲霉2013-DP1在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為:取豆柏、麩皮、秸桿中的一種或多種，加水至含水量為40~50%，再經(jīng)高溫滅菌制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接種米曲霉2013-DP1，進行好氧發(fā)酵培養(yǎng)48~64h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)烘干、粉碎后制成飼料添加劑。
【文檔編號】C12R1/69GK103642695SQ201310381698
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權日:2013年8月28日
【發(fā)明者】朱廷恒, 陳新愛, 汪琨, 林聰 , 崔志峰, 王渭霞 申請人:浙江工業(yè)大學