棉花品種‘中棉所49號’的dna指紋檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種棉花品種‘中棉所49號’的DNA指紋檢測方法，該方法利用SSR標(biāo)記技術(shù)，使用選自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一種特征引物進(jìn)行PCR檢測，該方法包括如下步驟：DNA提取、SSR-PCR擴(kuò)增、電泳和銀染檢測。本發(fā)明方法簡單快速、準(zhǔn)確穩(wěn)定，僅需2d即可完成1份‘中棉所49號’樣品的純度與真?zhèn)螜z測。
【專利說明】棉花品種‘中棉所49號’的DNA指紋檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及棉花品種‘中棉所49號’的DNA指紋檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]‘中棉所49號’系中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所選育的常規(guī)早中熟陸地棉品種。該品種是西北內(nèi)陸棉區(qū)主栽棉花品種之一。2006~2013年，連續(xù)8年被農(nóng)業(yè)部推薦為西北地區(qū)棉花主導(dǎo)品種；2008~2013年，連續(xù)6年被列為國家西北內(nèi)陸棉區(qū)棉花早中熟組區(qū)域試驗(yàn)對照品種；2007~2013年，連續(xù)7年被列為自治區(qū)棉花早中熟組區(qū)域試驗(yàn)對照品種；2005~2012年在南疆和東疆累計(jì)推廣面積3207.1萬畝，年均400萬畝，占當(dāng)?shù)孛藁娣e30%左右。并因原棉品質(zhì)穩(wěn)定而優(yōu)異，被選為國家原棉實(shí)物標(biāo)樣。
[0003]然而，隨著棉花品種數(shù)量的日益增加和遺傳基礎(chǔ)的日益狹窄，使得完全根據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行棉花品種的辨別越來越困難，給種子生產(chǎn)、經(jīng)營、管理、維權(quán)等諸環(huán)節(jié)帶來不同程度的困難，造成諸如品種多、亂、雜的現(xiàn)象。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展使品種鑒定進(jìn)入到基因水平，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)相比，DNA標(biāo)記技術(shù)能揭示更多的多態(tài)性，具有準(zhǔn)確可靠、簡單快速、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，是品種鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢。與其它分子標(biāo)記相比，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記在DNA指紋鑒定上顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性:SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高，以孟德爾方式遺傳，呈共顯性。SSR標(biāo)記已成為品種鑒定首選技術(shù)之一，并已在玉米，水稻等作物上初步應(yīng)用。
[0004]目前，我國棉種的真實(shí)性與品種純度鑒定仍依靠田間小區(qū)種植鑒定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗時(shí)長，時(shí)效性差。武耀廷，張?zhí)煺妫涞冗M(jìn)行了陸地棉品種SSR標(biāo)記的多態(tài)性及用于雜交種純度檢測的研究；馬軒，杜雄明，孫君靈等進(jìn)行了 18個(gè)彩色棉品系的SSR指紋分析；殷劍美，陳旭升，狄佳春等進(jìn)行了雜交棉蘇雜118的SSR指紋圖譜構(gòu)建研究。研究者普遍認(rèn)為，利用分子標(biāo)記進(jìn)行棉花品種鑒定是可行的。但利用現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種鑒定缺乏系統(tǒng)性研究，存在鑒別能力不夠高、操作步驟較多、耗費(fèi)時(shí)間較長、實(shí)驗(yàn)成本較高等問題，不能完全適應(yīng)實(shí)踐檢測的需要。因此，有必要針對限制棉花DNA指紋鑒定實(shí)用化的因素，迅速開展我國棉花品種DNA指紋鑒定的研究工作，建立高效準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)簡便的以SSR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA指紋鑒定體系，在此基礎(chǔ)上開發(fā)棉花品種純度和真?zhèn)蜠NA指紋檢測專用試劑盒，為棉花品種質(zhì)量監(jiān)控及品種權(quán)保護(hù)提供有利的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供棉花常規(guī)種‘中棉所49號’的DNA指紋檢測方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于檢測棉花品種‘中棉所49號’的特異性 PCR 引物，所述 PCR 引物選自 CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Ghl32 和 BNLl 154 中的至少一對引物(表 I)。
[0007] 表1特異性PCR引物
【權(quán)利要求】
1.用于檢測棉花品種‘中棉所49號’的特異性PCR引物，其特征在于，所述PCR引物選自 CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPLO176, NAU3424、Gh132 和BNLl 154中的至少一對引物；
2.棉花品種‘中棉所49號’的DNA指紋檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的用于檢測棉花品種‘中棉所49號’的特異性PCR引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，包括CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Ghl32 和 BNL1154 的引物組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
5.棉花品種‘中棉所49號’的DNA指紋檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測棉花的基因組DNA； 2)以待測棉花的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，20μ L PCR反應(yīng)體系中包括:添加Mg2+的IOX 反應(yīng)緩沖液2.0 μ L，2.5mM dNTPsl.6 μ L，20 μ M上、下游引物各0.15μ L，2.5U/y L TaqDNA 聚合酶 0.4 μ L，20ng/ μ L 基因組 DNA2.0yL,余量為 ddH20。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min；94°C變性45s，55°C退火45s，72。。延伸45s，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸12min，4°C保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，使用銀染法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測棉花品種‘中棉所49號’中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937873SQ201310380280
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】匡猛, 楊偉華, 嚴(yán)根土, 王延琴, 周大云, 方丹, 馬磊, 許紅霞, 馮新愛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所