一種副溶血弧菌vp核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種副溶血弧菌VP核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，具體地，本發(fā)明方法包括步驟：在反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增副溶血弧菌VP的特異性引物對(duì)。本發(fā)明方法能夠高特異性、高靈敏度、低污染、避免假陽(yáng)性、快速（常規(guī)50分鐘完成檢測(cè)）地對(duì)含有VPRNA的待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，具有檢測(cè)效率高，準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種副溶血弧菌VP核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食源致病性微生物的生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的副溶血弧菌(VP)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中使用的引物、探針及相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌,該菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可導(dǎo)致患者腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)。在多種食物如水產(chǎn)品、腌制品中常會(huì)發(fā)生副溶血性弧菌污染。1998年以來(lái)的資料顯示，副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，均己超過(guò)沙門(mén)氏菌食物中毒，躍居首位。
[0003]目前副溶血弧菌檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)方法及分子生物學(xué)方法。分離培養(yǎng)法操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，一般需要5~7天完成，不能滿足快速檢測(cè)的要求。分子生物學(xué)方法有PCR方法和LAMP方法。PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但這類(lèi)方法通常檢測(cè)成本高，需要比較昂貴的PCR儀，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作者技術(shù)要求也比較高。LAMP方法不需要昂貴儀器，操作也簡(jiǎn)便。但以上兩種方法檢測(cè)靶標(biāo)均為DNA，不能區(qū)分活菌與死菌，容易發(fā)生假陽(yáng)性結(jié)果。
[0004]實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(SimultaneousAmplification and Testing,簡(jiǎn)稱SAT)是一種直接快速檢測(cè)RNA的方法，與檢測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，不同之處，前者檢測(cè)體系多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟，核酸擴(kuò)增在一個(gè)溫度下進(jìn)行(42°C)，無(wú)需熱循環(huán)。SAT技術(shù)直接以病原微生物特異性RNA為擴(kuò)增靶標(biāo)，以擴(kuò)增產(chǎn)物RNA為檢測(cè)靶標(biāo)，在自然界中病原微生物死亡后靶`標(biāo)RNA會(huì)快速降解，而DNA會(huì)存在一段時(shí)間，通過(guò)對(duì)目標(biāo)RNA的檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)食品致病菌活菌檢測(cè)，降低假陽(yáng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種快速，高準(zhǔn)確度，污染易控，避免假陽(yáng)性，設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低的VP RNA檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的第一方面，提供了一種副溶血弧菌VP的擴(kuò)增方法，所述擴(kuò)增方法包括步驟:在反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所述的反應(yīng)體系中含有副溶血弧菌VP的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0007]在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系中還包括M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包括副溶血弧菌VP的捕獲探針。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包括副溶血弧菌VP的檢測(cè)探針。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針的一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)探針的5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，且檢測(cè)探針的3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針可與副溶血弧菌VP的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括:在另一陽(yáng)性(對(duì)照)反應(yīng)體系或陰性(對(duì)照)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)照反應(yīng)體系中含有所述特異性引物對(duì)、VP內(nèi)標(biāo)(VP ICRNA)、所述捕獲探針和所述檢測(cè)探針。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)探針用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VP靶標(biāo)核酸(VP RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)副溶血弧菌VP的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述方法為實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增法。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系中還含有待測(cè)的副溶血弧菌或衍生自所述副溶血弧菌核酸。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)核酸是來(lái)自各類(lèi)鮮凍水產(chǎn)品及腌制食品。
[0022]本發(fā)明的第二方面，提供了一種副溶血弧菌VP的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括:
用如本發(fā)明第一方面中所述的擴(kuò)增方法擴(kuò)增待測(cè)樣品；和
在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)副溶血弧菌VP的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括設(shè)置一個(gè)或多個(gè)對(duì)照組。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)照組包括:VP陽(yáng)性對(duì)照組、VP陰性對(duì)照組、VP內(nèi)標(biāo)對(duì)照組。
[0025]本發(fā)明的第三方面，提供了一種副溶血弧菌VP的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的擴(kuò)增副 溶血弧菌的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)
包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示;
以及使用說(shuō)明書(shū)。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種組分:
(b)捕獲探針；
(C)檢測(cè)探針；
(d)EV內(nèi)標(biāo)序列；和/或
(e)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括一種或多種酶。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的酶是M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV檢測(cè)探針存在于一檢測(cè)液中。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于VP檢測(cè)液中。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述VP內(nèi)標(biāo)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，并與VP靶標(biāo)核苷酸(VP RNA)使用同一對(duì)引物(Τ7和ηΤ7)。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括VP陽(yáng)性對(duì)照和/或VP陰性對(duì)照。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述捕獲探針是與副溶血弧菌的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針；和/或
所述檢測(cè)探針是與根據(jù)所述VP靶標(biāo)核酸(VP RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VP檢測(cè)探針。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針和/或所述的檢測(cè)探針還可與副溶血弧菌VP的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
所述檢測(cè)探針包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或
所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP內(nèi)標(biāo)序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針包括如S EQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包含以下組分:裂解液、核酸提取液、洗滌液、VP反應(yīng)液、VP檢測(cè)液、SAT酶液、VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照和VP內(nèi)標(biāo)；
其中，
所述裂解液包括硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ；
所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
所述洗滌液包括NaCl和SDS ；
所述VP反應(yīng)液包括dNTP和NTP ；
所述VP檢測(cè)液包括T7引物、nT7引物、EV檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；
所述SAT酶液包括M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Τ7 RNA聚合酶；
所述VP陽(yáng)性對(duì)照包括副溶血弧菌5’端的toxR基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
所述的VP陰性對(duì)照是不含有副溶血弧菌靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，較佳地，所述的陰性對(duì)照是生理鹽水；
VP內(nèi)標(biāo):含VP內(nèi)標(biāo)RNA(VP IC RNA,序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)稀釋物。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
A盒為標(biāo)本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；
B盒為核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元，包括所述VP反應(yīng)液、VP檢測(cè)液、SAT酶液、VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照及VP內(nèi)標(biāo)。
[0038]本發(fā)明的第四方面，提供了一種擴(kuò)增腸道病毒的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì) 包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0039]本發(fā)明的第五方面，提供了一種如本發(fā)明第三方面所述的試劑盒或如本發(fā)明第四方面所述的引物對(duì)的用途，其特征在于，對(duì)鮮凍水產(chǎn)品及腌制食品樣品中是否存在副溶血弧菌VP進(jìn)行定性檢測(cè)，和對(duì)是否存在副溶血弧菌VP活菌進(jìn)行判定。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的鮮凍水產(chǎn)品樣品包括貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)、蟹類(lèi)、海草等及其相應(yīng)加工產(chǎn)品等；所述的腌制產(chǎn)品包括各類(lèi)蔬菜、禽肉蛋類(lèi)腌制后的食品。
[0041]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為副溶血弧菌的靈敏度Fl通道檢測(cè)結(jié)果 圖2為副溶血弧菌的靈敏度F2通道檢測(cè)結(jié)果
圖3為實(shí)施列4中SAT檢測(cè)B管VP的檢測(cè)結(jié)果 圖4為實(shí)施列4中PCR檢測(cè)B管VP的檢測(cè)結(jié)果 圖5為實(shí)施列4中SAT檢測(cè)A管VP的Fl通道檢測(cè)結(jié)果 圖6為實(shí)施列4中SAT檢測(cè)A管VP的F2通道檢測(cè)結(jié)果 圖7為實(shí)施列4中PCR檢測(cè)A管VP的檢測(cè)結(jié)果 【具體實(shí)施方式】
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，經(jīng)過(guò)大量篩選和驗(yàn)證，開(kāi)發(fā)了高特異性，高靈敏的專(zhuān)用引物對(duì)。使用該特定的引物序列對(duì)副溶血弧菌VP的核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，具有高特異性，高靈敏等優(yōu)異優(yōu)點(diǎn)，可以用于準(zhǔn)確地檢測(cè)副溶血弧菌VP?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0043]引物和探針
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增引物和探針副溶血弧菌VP的特異性引物”指這樣的引物(對(duì))，它擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有副溶血弧菌VP的互補(bǔ)鏈序列。
`[0044]在引物設(shè)計(jì)上，為了能夠更好地滿足目前對(duì)副溶血弧菌VP檢測(cè)的需要，本發(fā)明人選擇了 VP病毒5’端的toxR基因中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。優(yōu)選的引物序列包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4組成的引物對(duì)。
[0045]在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，除引物外，反應(yīng)體系中還可以包括一個(gè)或多個(gè)探針，如檢測(cè)探針，捕獲探針等。
[0046]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“副溶血弧菌VP的捕獲探針”指可與副溶血弧菌VP的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合的核苷酸序列。本發(fā)明的一種優(yōu)選的捕獲探針具有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕獲探針特異結(jié)合于副溶血弧菌VP的靶標(biāo)核酸(VPRNA)序列。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述副溶血弧菌VP含有VP內(nèi)標(biāo)(VP IC RNA)時(shí)，所述捕獲探針還可以與所述VP內(nèi)標(biāo)序列特異結(jié)合，用于設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組。
[0047]VP檢測(cè)探針為分子信標(biāo)，是一類(lèi)高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價(jià)標(biāo)記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發(fā)夾型或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)的環(huán)部分和靶標(biāo)互補(bǔ)，兩頭由于互補(bǔ)而成為莖，分子信標(biāo)探針與線性的TaqMan探針相比，因其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開(kāi)需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。本發(fā)明的一種優(yōu)選的檢測(cè)探針具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。[0048]本發(fā)明的引物序列和探針序列根據(jù)引物探針設(shè)計(jì)原理，使用DNAStar、DNAMAN軟件和人工設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)副溶血弧菌VP的專(zhuān)用引物和檢測(cè)探針序列。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選比對(duì)靶標(biāo)檢測(cè)探針，選取靈敏度較優(yōu)者。在內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針設(shè)計(jì)中，需選取與靶標(biāo)RNA無(wú)交叉反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)(VP RNA)及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)探針，確保該內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針與靶標(biāo)檢測(cè)探針?lè)謩e對(duì)VP RNA與VP IC RNA無(wú)交叉信號(hào)，且對(duì)內(nèi)標(biāo)RNA檢測(cè)靈敏度較優(yōu)者。本發(fā)明的一種優(yōu)選的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)真具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0049]對(duì)照物
由于SAT擴(kuò)增易受多種因素影響而使擴(kuò)增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯(cuò)誤的結(jié)論，因此，在本發(fā)明的試劑盒中還可以設(shè)置對(duì)照物，以排除檢測(cè)結(jié)果失真的情況。
[0050]本發(fā)明中可以設(shè)置的參照物包括:VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照和VP內(nèi)標(biāo)中的一個(gè)或多個(gè)對(duì)照物。 [0051]VP陽(yáng)性對(duì)照可以是為體外轉(zhuǎn)錄的RNA，不具有生物學(xué)活性。通過(guò)檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照，可證明試劑盒檢測(cè)方法及材料無(wú)誤，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)可以監(jiān)測(cè)每次檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性及試劑盒批次間的差異。
[0052]此外，通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照品可制備臨界弱陽(yáng)對(duì)照(以生理鹽水和裂解液按1:1混合成為稀釋液，稀釋陽(yáng)性對(duì)照100倍作為臨界弱陽(yáng)對(duì)照)，可以提示處于臨界值狀態(tài)時(shí)的檢驗(yàn)操作情況，通過(guò)臨界弱陽(yáng)對(duì)照定期檢測(cè)SAT實(shí)驗(yàn)室，可進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，以防止檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)漏檢(假陰性)的情況。
[0053]VP內(nèi)標(biāo)可以是體外轉(zhuǎn)錄的RNA，不具有生物學(xué)活性。VP內(nèi)標(biāo)作為VP RNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可以作為參照物，用于防止假陰性結(jié)果的發(fā)生，通過(guò)檢測(cè)加入有內(nèi)標(biāo)的樣本，可了解整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系是否受抑制，更好的提示假陰性。
[0054]陰性對(duì)照可排除假陽(yáng)性，在正確使用試劑盒檢測(cè)方法和材料情況下，可保證檢測(cè)的特異性。
[0055]在另一優(yōu)選例中，所述體外轉(zhuǎn)錄的VP RNA通過(guò)以下述方法制備:
(1)用化學(xué)合成法合成VP5’端的iwR基因片段(VP陽(yáng)性片斷，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 8所示)；
(2)將VP5’端的iozR基因片段插入到pGEM?-T載體中，構(gòu)建VP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；
(3)VP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，命名為pGEM?_T_VP菌株，貯存于-70。。；
(4)從pGEM?-T-VP菌株中提取pGEM?-T-VP質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
[0056]在另一優(yōu)選例中，所述VP內(nèi)標(biāo)中的體外轉(zhuǎn)錄的VP IC RNA以下述方法制備:
(I)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同VP靶標(biāo)序列區(qū)域(VP內(nèi)標(biāo)片斷，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 9所示)；
(2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建VP內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；
(3)EV內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?_T_ VP IC菌株，貯存于_70°C;
(4)從pGEM?-T-VP IC菌株中提取pGEM?_T_VP IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。[0057]檢測(cè)方法
本發(fā)明還提供了副溶血弧菌VP的檢測(cè)方法，包括用本發(fā)明所述的特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增；和
在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中或之后，檢測(cè)副溶血弧菌VP的擴(kuò)增產(chǎn)物，例如通過(guò)檢測(cè)特異性探針發(fā)出的突光信號(hào)。
[0058]所述方法還可以任選地包括設(shè)置一個(gè)或多個(gè)對(duì)照組，如VP陽(yáng)性對(duì)照組、VP陰性對(duì)照組、VP內(nèi)標(biāo)組等。
[0059]在本發(fā)明中，檢測(cè)方法可以用常規(guī)的PCR方法，也可用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法等不同的方法。一種特別優(yōu)選的方法是實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增法。
[0060]實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SAT)
核酸恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)，其原理是將RNA恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。首先通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA多聚酶和優(yōu)化探針(optimalprobe, patent pending)技術(shù)來(lái)同時(shí)實(shí)現(xiàn)。反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生祀標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)DNA拷貝，T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由檢測(cè)儀器捕獲。檢驗(yàn)結(jié)果根據(jù)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的出現(xiàn)時(shí)間和強(qiáng)度，結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)信號(hào)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。
[0061]在本發(fā)明中，副溶血弧菌VP檢測(cè)技術(shù)通過(guò)使用高特異性和高靈敏度的專(zhuān)用引物對(duì)，并配合使用專(zhuān)用的捕獲探針，可高效、特異性捕獲VP的RNA。核酸擴(kuò)增使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶來(lái)同時(shí)實(shí)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生5靶標(biāo)核酸RNA的一個(gè)DNA拷貝，T7RNA聚合酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化檢測(cè)探針和擴(kuò)增后產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由檢測(cè)儀器捕獲。
[0062]試劑盒
本發(fā)明提供了一種副溶血弧菌VP的檢測(cè)試劑盒，包括:
(a)擴(kuò)增副溶血弧菌的特異性引物對(duì)，所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有副溶血弧菌VP的互補(bǔ)鏈序列；
(b)捕獲探針；和 (b)檢測(cè)探針。
[0063]所述的引物對(duì)是一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VP靶標(biāo)核酸(VP RNA)的DNA拷貝的VP擴(kuò)增引物，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的VP擴(kuò)增引物包括:T7引物:SEQID NO: 3;和 nT7 引物:SEQ ID NO: 4。
[0064]所述的捕獲探針是與副溶血弧菌的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針；所述的檢測(cè)探針是與根據(jù)所述VP靶標(biāo)核酸(VP RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VP檢測(cè)探針。在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針和/或所述的檢測(cè)探針還可與副溶血弧菌VP的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合。
[0065]所述的副溶血弧菌VP還可以被設(shè)計(jì)為含有VP內(nèi)標(biāo)(VP IC RNA)，較佳地，當(dāng)副溶血弧菌含有VP內(nèi)標(biāo)時(shí)，所述捕獲探針和檢測(cè)探針被設(shè)計(jì)為還可以與所述VP內(nèi)標(biāo)序列特異結(jié)合，形成VP內(nèi)標(biāo)對(duì)照組。在另一優(yōu)選例中，所述VP內(nèi)標(biāo)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，并與VP靶標(biāo)核苷酸(VP RNA)使用同一對(duì)引物(T7和nT7)。
[0066]所述試劑盒中還可以包括一種或多種酶。如M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶。在另一優(yōu)選例中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和VP檢測(cè)探針存在于一檢測(cè)液中。
[0067]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包含以下組分:裂解液、核酸提取液、洗滌液、VP反應(yīng)液、VP檢測(cè)液、SAT酶液、VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照和VP內(nèi)標(biāo)；其中，所述裂解液包括硫酸銨((NH4)2SO4)和 HEPES ；
所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
所述洗滌液包括NaCl和SDS ；
所述VP反應(yīng)液包括dNTP和NTP ；
5所述VP檢測(cè)液包括T7引物、nT7引物、VP檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；
所述SAT酶液包括M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Τ7 RNA聚合酶；
所述VP陽(yáng)性對(duì)照包括副溶血弧菌5’端的iwR基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
所述的VP陰性對(duì)照是不含有副溶血弧菌靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，較佳地，所述的陰性對(duì)照是生理鹽水；
VP內(nèi)標(biāo):含VP內(nèi)標(biāo)RNA (VP IC RNA，序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。
[0068]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒的一個(gè)反應(yīng)單位中各種試劑組成如下:
(1)裂解液:HEPES25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液:HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 μ M (優(yōu)選為 5-25 μ Μ),磁珠 50_500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；
(3)洗滌液:HEPES5-50mM, NaCl 50-500 mM, lwt% SDS, EDTA 1-1OmM ；
(4)VP 反應(yīng)液:Tris 10-50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.1-1OmM(優(yōu)選為 0.5_5mM)，NTP
l-20mM (優(yōu)選為 1-1OmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
(5)VP檢測(cè)液:將VP擴(kuò)增引物和VP檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和I mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-lOpmol/反應(yīng)均可；
其中T7引物濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為7.5pmol/反應(yīng)，VP檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；
(6)SAT 酶液=M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應(yīng))、T7 RNA聚合酶 200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1000U/反應(yīng))、2_10mM ΗΕΡΕ、ρΗ7.5、10-100 mMN-acetyl_L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose>40-200 mMTris-HCl pH 8.0、40_200mM KCU0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100 和20-50% (v/v) glycerol ；
(7)VP陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-1O8拷貝/mL副溶血弧菌(VP) toxR基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋
物；
(S)VP陰性對(duì)照:不含有副溶血弧菌(VP)靶標(biāo)核酸(EV RNA)序列或不含有副溶血弧菌(VP)的溶液；
(9)EV內(nèi)標(biāo):含IO5-1O8拷貝/mL VP IC RNA(序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)。
[0069]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括一個(gè)或多個(gè)容器，且上述的各個(gè)組分可分別位于一個(gè)或多個(gè)容器中，在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
A盒為標(biāo)本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；B盒為核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元，包括所述VP反應(yīng)液、VP檢測(cè)液、SAT酶液、VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照及VP內(nèi)標(biāo)。
[0070]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)探針包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列,和/或所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0071]利用以上試劑盒對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下步驟:
1)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的副溶血弧菌，得到含有副溶血弧菌核酸的裂解液；
2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液和和VPIC RNA，使捕獲探針與靶標(biāo)或內(nèi)標(biāo)核酸特異結(jié)合后再 與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到副溶血弧菌的核酸(RNA)和 VP IC RNA ；
3)將步驟2)提取的副溶血弧菌的核酸(RNA)和VPIC RNA加入由VP反應(yīng)液和VP檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開(kāi)始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3:1 ；
4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照和VP內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0072]與現(xiàn)有的VP檢測(cè)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)高特異性、高純度、低污染:針對(duì)VP靶核酸設(shè)計(jì)的優(yōu)選捕獲探針，可高效、特異性捕獲VP的RNA。同時(shí)，由于采取封閉式的恒溫放大檢測(cè)系統(tǒng)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需打開(kāi)反應(yīng)體系，因而避免了擴(kuò)增子的污染。
[0073](2)快速檢測(cè):將核酸的擴(kuò)增與檢測(cè)在同一封閉體系中同步進(jìn)行，而且整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有溫度的升降及循環(huán)，因而所需時(shí)間大大縮短，擴(kuò)增檢測(cè)只需要50分鐘。
[0074](3)污染易控:與實(shí)時(shí)熒光PCR相比，本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制較容易。
[0075](4)能有效區(qū)別檢測(cè)物中的死菌和活菌，檢測(cè)更準(zhǔn)確，更科學(xué)，避免假陽(yáng)性。
[0076](5)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低:與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，本發(fā)明所用的儀器無(wú)需升降溫循環(huán)，因而設(shè)計(jì)和生產(chǎn)成本大幅降低。
[0077]綜上所述，本發(fā)明試劑盒能夠檢測(cè)鮮凍水產(chǎn)品及腌制食品中的VP RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達(dá)1000CFU/mL)、污染低(擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)、避免假陽(yáng)性及快速檢測(cè)(50分鐘完成擴(kuò)增檢測(cè))的特點(diǎn)，將在副溶血弧菌快速檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0078]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0079]實(shí)施例中所用主要原料SAT酶液、陽(yáng)性對(duì)照及內(nèi)標(biāo)的體外轉(zhuǎn)錄RNA由美國(guó)RDBiosciences公司提供，7500型PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，NTPs, dNTPs等試劑和其他儀器均為常規(guī)可商購(gòu)產(chǎn)品。
[0080]實(shí)施例1、用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)副溶血弧菌(VP)的專(zhuān)用引物和探針的設(shè)計(jì)
本發(fā)明選擇VP toxR基因中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根據(jù)引物探針設(shè)計(jì)原理，使用DNA ATAR、DNAman軟件和人工設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)副溶血弧菌(VP)的專(zhuān)用引物和探針序列，得到如下具體序列:
(1)一條可與如序列表中序列I所示的副溶血弧菌(VP)的靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO, Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列為5’_aucyuccagucucugcgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(Y 為簡(jiǎn)并喊基，代表 C/T,序列表中序列2)； (2)—對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VP靶標(biāo)核酸(VPRNA)的DNA拷貝的VP檢測(cè)引物，所述VP檢測(cè)引物由T7引物和nT7引物組成，Τ7引物序列為5，- aatttaatacgactcactatagggagacagtacgcaaatcggtagta-3，(序列表中序列 3), nT7 引物序列為5’ -gtagtagtacctgaaaaagca _3’(序列表中序列 4)；
(3)—條用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VP靶標(biāo)核酸(VP RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VP檢測(cè)探針，所述VP檢測(cè)探針的核苷酸序列為5’-cguccugcugugaauccuuggacg_3’(序列表中序列 5), 5’端用 FAM 突光標(biāo)記，3’端用 DABCYL突光標(biāo)記。
[0081](4)為便于進(jìn)行結(jié)果分析，還配合試劑盒中增加的競(jìng)爭(zhēng)性VP內(nèi)標(biāo)(序列7)，設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，VP內(nèi)標(biāo)與VP靶標(biāo)核苷酸(VP RNA)擁有相同的引物結(jié)合區(qū)，兩引物之間的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測(cè)探針結(jié)合，但能與內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合，所述VP內(nèi)標(biāo)可通過(guò)VP靶標(biāo)模板定點(diǎn)突變構(gòu)建獲得，可與捕獲探針特異性結(jié)合，所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為與VP檢測(cè)探針序列、突光標(biāo)記不同，但堿基數(shù)一致的探針，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列為5’ -ccagGUAAUUCGGCACGUGGccugg-3’(序列表中序列6), 5’端標(biāo)記HEX突光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0082]實(shí)施例2制備副溶血弧菌VP的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒
利用實(shí)施例1所提供的專(zhuān)用引物和探針，得到本發(fā)明副溶血弧菌VP的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包含有捕獲探針(TC0，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、VP檢測(cè)探針、內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針、內(nèi)標(biāo)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶等組分。
[0083]其中，捕獲探針序列如SEQ ID NO: 2 ；
Τ7引物序列如SEQ ID NO: 3 ；
ηΤ7引物序列如SEQ ID NO: 4 ；
EV檢測(cè)探針序列如SEQ ID NO: 5 ；
內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針序列如SEQ ID NO: 6 ；
內(nèi)標(biāo)序列如SEQ ID NO: 7 ；
所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和VP檢測(cè)探針、內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于VP檢測(cè)液中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具體來(lái)講，所述試劑盒分為2-30°C儲(chǔ)存的A盒(標(biāo)本處理單元)和-15- _35°C儲(chǔ)存的B盒(核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗滌液，B盒包括VP反應(yīng)液、VP檢測(cè)液、SAT酶液、VP陽(yáng)性對(duì)照、VP陰性對(duì)照和VP內(nèi)標(biāo)，主要成分如下:A盒(標(biāo)本處理單元)組成為:
裂解液；含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ；
核酸提取液:含捕獲探針1-50 μ M (優(yōu)選為5-25 μ Μ)和磁珠50_500mg/L (優(yōu)選為50-250mg/L)；
洗滌液:主要含lwt% SDS0
[0084]B盒(核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元)組成為:
VP 反應(yīng)液:含 dNTP 0.1-1OmM (優(yōu)選為 0.5_5mM)，NTP l-20mM (優(yōu)選為 1-lOmM)；
VP檢測(cè)液:含引物和探針，各引物和探針的濃度在5-lOpmol/反應(yīng)均可，其中T7引物濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為7.5pmol/反應(yīng)，VP檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；
SAT酶液:含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))，T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng))；
VP陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-1O8拷貝/mL副溶血弧菌(VP) toxR基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；VP陰性對(duì)照:不含有副溶血弧菌(VP)靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液,如生理鹽水；
VP 內(nèi)標(biāo):含 IO5-1O8 拷貝 /mL VP IC RNA 稀釋物(SEQ ID NO: 7)。
[0085]試劑盒中所包含的所有試劑均可按提示以常規(guī)方法制備取得或商業(yè)購(gòu)買(mǎi)得到。
·[0086]具體來(lái)講，每一反應(yīng)單位中，所述試劑盒各種試劑的具體組配如下:
(1)裂解液:為裂解和保存食品樣本中的副溶血弧菌(VP)，含有硫酸銨和HEPES緩沖液的溶液，具體包含 HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液:為提取副溶血弧菌(VP)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特異結(jié)合靶標(biāo)核酸(VP RNA)的一段RNA序列的溶液，具體包含HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM,LiCl 400-2000mM，捕獲探針 1-50 μ M (優(yōu)選為 5-25 μ M )，磁珠 50_500mg/L (優(yōu)選為50-250mg/L)；
(3)洗滌液:為含SDS、NaCl 的溶液，具體包含 HEPES 5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDSImM, EDTA 1-1OmM ；
(4)VP反應(yīng)液:為含dNTPs和NTPs擴(kuò)增所需組份，具體包含Tris 10-50mM, MgCl210-40mM, dNTP 0.1-1OmM (優(yōu)選為 0.5_5mM)，NTP l-20mM (優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP40 1-10%,KCl 5-40mM ；
(5)VP檢測(cè)液:將恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的VP檢測(cè)引物和VP檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmMTris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探針濃度在5-10pmol/反應(yīng)均可，其中T7引物濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為7.5pmol/反應(yīng)，VP檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；
(6)SAT酶液:為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的多酶組分體系，含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng))、
2-10mM HEPES ρΗ7.5、10_100 mM N-acetyl-L_cysteine、0.04_0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40_200mM KC1、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
(7)VP陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-1O8拷貝/mL副溶血弧菌(VP) idR基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
(8)VP陰性對(duì)照:不含有副溶血弧菌(VP)靶標(biāo)核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液；
(9)VP 內(nèi)標(biāo):含 IO5-1O8 拷貝 /mL VP 內(nèi)標(biāo) RNA。
[0087]VP陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的VP RNA，可以通過(guò)多種方法制備所得，其中一種制備方法如下:
(I)用化學(xué)合成法合成VP toxR基因中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示)；
(2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建VP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；
(3)VP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為PGEM?_T_VP菌株，貯存于-70。。；
4)從pGEM?-T-VP菌株中提取pGEM?-T-VP質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
[0088]VP內(nèi)標(biāo)中的體外轉(zhuǎn)錄的VP IC RNA，可以通過(guò)多種方法制備所得，其中一種制備方法如下:
(1)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同VP靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示)；
(2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建VP內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；
(3)VP內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?_T_VP IC菌株，貯存于_70°C;
(4)從pGEM?-T-VPIC菌株中提取pGEM?_T_VP IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。
[0089]實(shí)施例3純菌靈敏度檢測(cè)
用本發(fā)明試劑盒(組成見(jiàn)實(shí)施例2)檢測(cè)濃度為IO2 CFU/mL、103 CFU/mL、104CFU/mL、IO5 CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL的食品樣品中的副溶血弧菌(VP)，另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照。具體方法包括以下步驟:
(I)菌液培養(yǎng)，計(jì)數(shù)和稀釋
取副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線堿性蛋白胨水(APW)平板，37°C培養(yǎng)12h后，比濁法計(jì)數(shù)，生理鹽水稀釋定量到107CFU/mL，并用生理鹽水10倍倍比稀釋到102CFU/mL。
[0090](2)核酸提取
2.1在樣品處理管(1.5mL離心管)中加入200 μ I裂解液(含HEPES 35mM, (NH4) 2S0420mM),200yl樣品溶液，用裂解液裂解待測(cè)樣品中的副溶血弧菌(VP)，得到含有副溶血弧菌(VP)核酸的裂解液。
[0091]2.2在樣品處理管(1.5mL離心管)中加入100 μ I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM，捕獲探針20μΜ，磁珠250mg/L)，加入10 μ I內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。
[0092]2.3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES 50mM,NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復(fù)2次。
[0093]2.4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復(fù)合物，備用(此步應(yīng)清晰可見(jiàn)磁珠)。
[0094](3) SAT核酸擴(kuò)增檢測(cè)
3.1向樣品處理管中加入40μ I反應(yīng)檢測(cè)液(40μ I VP反應(yīng)液+2.5μ1 VP檢測(cè)液)洗滌磁珠。VP 反應(yīng)液具體包含 Tris 30mM, MgCl2 IOmM, dNTP 4mM, NTP 8mM, PVP40 5%,KCl 25mM ；VP檢測(cè)液中T7引物濃度為5pmol，nT7引物濃度為7.5pmol,VP檢測(cè)探針濃度為5pmolο
[0095]3.2取振蕩混勻的上述反應(yīng)檢測(cè)液30 μ I加至潔凈微量反應(yīng)管，用7500型PCR儀(美國(guó)ABI公司產(chǎn)品)60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應(yīng)管中加入10 μ I已預(yù)熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻。SAT酶液中含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1200U，T7RNA 聚合酶 1200U/ 反應(yīng)，IOmM HEPES ρΗ7.5,20 mM N-acetyl-L-cysteine (N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.4 mM zinc acetate (乙酸鋒)、30 mM trehalose (海藻糖)、100 mM Tris-HClpH 8.0, 200mM KC1,0.1mM EDTA,0.8% (v/v)Triton X-100 和 40% (v/v) glycerol (丙二醇)；
3.3將微量反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器(FAM通道)，42°C反應(yīng)50分鐘，設(shè)定每I分鐘檢測(cè)一次熒光，共檢測(cè)50次。
[0096](4)結(jié)果判定
根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果得到的曲線，設(shè)定閥值線，讀取dt值，判定結(jié)果。
[0097]閾值設(shè)定:以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù) (與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的Ct值類(lèi)似)。
[0098]陽(yáng)性結(jié)果判定:
Fl通道(FAX通道):dt ( 45的樣本為陽(yáng)性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果Fl通道:dt < 50的樣本為陽(yáng)性。
[0099]陰性結(jié)果判定:
Fl通道dt無(wú)數(shù)值或?yàn)?0，同時(shí)F2通道(VIC通道，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長(zhǎng)相近):dt≤45，則為陰性。
[0100]質(zhì)量控制:每次檢測(cè)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，且結(jié)果應(yīng)同時(shí)滿足陽(yáng)性對(duì)照Fl通道:dt < 45 ;陰性對(duì)照Fl通道:dt無(wú)數(shù)值或?yàn)?0，同時(shí)F2通道:dt < 45，否則此次檢測(cè)結(jié)果視為無(wú)效。
[0101](5)結(jié)果
從圖1(F1熒光通道)、圖2(F2熒光通道)可看到，本發(fā)明試劑盒最低檢出限為IO3 CFU/mL，各濃度均可檢出內(nèi)標(biāo)，表示反應(yīng)體系沒(méi)有受抑制影響。
[0102]實(shí)施例4 SAT與PCR對(duì)活菌死菌的檢測(cè)比對(duì)
本次檢測(cè)為本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用:試劑盒組成，檢測(cè)方法及試劑用量同實(shí)施例3，具體方法包括如下步驟:
(I)樣本處理
取25 g (mL)食品樣本，加入225mL堿性蛋白胨水(APW)中進(jìn)行勻漿；37°C培養(yǎng)12h，取上清分為A、B管(B管為活菌對(duì)照組)；將A管置于75度水浴鍋中10分鐘，并通過(guò)顯微鏡觀察顯示A管菌體已破裂；然后將加熱(A管)與不加熱處理的菌液(B管)分別進(jìn)行10倍梯度稀釋10、ΙΟ2、ΙΟ3、104、IO5UO6倍，分別取50ul稀釋菌液涂平板(LB)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，A管的菌液對(duì)應(yīng)的LB平板無(wú)菌落，B管的菌液對(duì)應(yīng)的LB平板有菌落，說(shuō)明加熱后的菌(A管)全被滅活，A管為死菌，B管為活菌。
[0103](2)提取、擴(kuò)增與檢測(cè)
SAT檢測(cè)方法同實(shí)施例3 ；PCR檢測(cè)市面上常規(guī)檢測(cè)副溶血弧菌的PCR試劑盒進(jìn)行提取和擴(kuò)增檢測(cè)。
[0104](3)檢測(cè)結(jié)果:
對(duì)B管副溶血弧菌各梯度濃度進(jìn)行檢測(cè)，SAT方法均可檢出KT1到10_6 (圖3)濃度，PCR可檢出10-1到10-5 (圖4)，可見(jiàn)本發(fā)明所形成的試劑盒具有較高的靈敏度。
[0105]對(duì)A管各梯度濃度進(jìn)行檢測(cè)，SAT的Fl通道檢測(cè)除陽(yáng)性對(duì)照外均為陰性(圖5)，同時(shí)F2通道(圖6)顯示各梯度有內(nèi)標(biāo)信號(hào)，說(shuō)明SAT反應(yīng)體系未受抑制，結(jié)果可靠；同時(shí)A管的PCR檢測(cè)結(jié)果(圖7)同B管PCR結(jié)果，IO-1到10_5顯示均為陽(yáng)性，表明其不能區(qū)分死菌和活菌，這是因?yàn)楦比苎【腄NA在環(huán)境中穩(wěn)定所致。通過(guò)對(duì)RNA的檢測(cè)，可有效區(qū)分食品中的副溶血弧菌活菌死菌情況，避免假陽(yáng)性。
【權(quán)利要求】
1.一種副溶血弧菌VP的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增方法包括步驟:在反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增副溶血弧菌VP的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包括副溶血弧菌VP的捕獲探針。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包括副溶血弧菌VP的檢測(cè)探針。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟:在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)副溶血弧菌VP的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
5.一種副溶血弧菌VP的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括: 用如權(quán)利要求1中所述的擴(kuò)增方法擴(kuò)增待測(cè)樣品；和 在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)副溶血弧菌VP的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
6.一種副溶血弧菌VP的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的擴(kuò)增副溶血弧菌的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示; 以及使用說(shuō)明書(shū)。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還含有選自下組的一種或多種組分: (b)捕獲探針； (C)檢測(cè)探針； (d)EV內(nèi)標(biāo)序列；和/或 (e)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: 所述檢測(cè)探針包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP內(nèi)標(biāo)序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針包括如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
9.一種擴(kuò)增副溶血弧菌的特異性引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
10.如權(quán)利要求6所述的試劑盒或權(quán)利要求9所述的引物對(duì)的用途，其特征在于，對(duì)鮮凍水產(chǎn)品及腌制食品樣品中是否存在副溶血弧菌VP進(jìn)行定性檢測(cè)，和/或 對(duì)是否存在副溶血弧菌VP活菌進(jìn)行判定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103571942SQ201310342094
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】張長(zhǎng)明, 于明輝, 尹華立, 朱鳳, 居金良 申請(qǐng)人:上海仁度生物科技有限公司