輔助鑒定歐洲類禽h1n1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的引物組，包括引物對乙；所述引物對乙由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子組成。所述引物組還可包括引物對甲；所述引物對甲由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成。本發(fā)明對及時診斷、撲滅疫情以及開展大規(guī)模歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的流行病學(xué)監(jiān)測有著積極的意義。
【專利說明】輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流感一種急性、傳染性呼吸道疾病，影響豬的發(fā)育，延緩豬的生長及出欄時間， 給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。豬流感病毒主要包括H1與H3兩種亞型。其中歐洲類禽H1N1 亞型豬流感病毒是H1亞型豬流感病毒的一大優(yōu)勢譜系。2006年以后，歐洲類禽H1N1亞型 豬流感病毒成為豬流感病毒的優(yōu)勢流行毒株。
[0003] 傳統(tǒng)的流感病毒檢測方法為采用雞胚進行病毒的分離培養(yǎng)(需時2-3天)，然后采 用血凝抑制試驗進行流感病毒亞型及分支的鑒定(需時1天)。這種傳統(tǒng)的檢測方法費時、 費力，不能做出快速而及時的診斷。由于流感病毒抗原特性的變異，常常導(dǎo)致常規(guī)血清學(xué)方 法無法檢出流行毒株，出現(xiàn)漏檢的情況。此外，用于豬流感檢測的鼻腔拭子樣品通常病毒含 量較低，由于普通RT-PCR方法的靈敏度限制，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。臨床上，迫切需要一種能 快速有效的檢測歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，有助于實現(xiàn)對該疾病的實時監(jiān)測， 對于疫情的防控意義重大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的引物組及其 應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的引物組，包括引物對乙；所述引物對乙由序列表的序列3所示單鏈 DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子組成。所述引物組還可可包括引物對甲；所述 引物對甲由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成。 所述引物組可由所述引物對乙和所述引物對甲組成。
[0006] 本發(fā)明還保護所述引物組在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下（a) 或(b): (a)輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒；（b)輔助鑒定待測樣本中是否含有歐 洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。所述待測樣本可為豬的肝、腦、肺等組織，也可為豬的口腔拭 子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、 肺等）或豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0007] 本發(fā)明還保護一種試劑盒，包括所述引物組；所述試劑盒的用途為如下（a)或（b): (a)輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒；（b)輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽 H1N1亞型豬流感病毒。所述待測樣本可為豬的肝、腦、肺等組織，也可為豬的口腔拭子、泄殖 腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）或 豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0008] 本發(fā)明還保護所述引物組在輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒中的應(yīng)用。 所述應(yīng)用中不包括疾病治療和診斷方法。
[0009] 本發(fā)明還保護第一種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，包括如下 步驟：以待測病毒的cDNA為模板，用所述引物對乙進行PCR擴增，如果得到PCR擴增產(chǎn)物、 待測病毒為候選的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到所述PCR擴增產(chǎn)物、待測 病毒為候選的非歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。所述PCR擴增產(chǎn)物的大小可為400-500bp， 具體可為462bp。所述待測病毒可為歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒、H9N2亞型豬流感病毒、 H3N2亞型豬流感病毒、H1N2亞型豬流感病毒和經(jīng)典H1N1亞型豬流感病毒。所述方法為非 疾病治療和診斷方法。
[0010] 本發(fā)明還保護第二種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，依次包括 如下步驟：（1)以待測病毒的cDNA為模板，用所述引物對甲進行PCR擴增；（2)將完成步驟 (1)的體系作為模板，用所述引物對乙進行PCR擴增，如果得到PCR擴增產(chǎn)物、待測病毒為 候選的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到所述PCR擴增產(chǎn)物、待測病毒為候選 的非歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。所述PCR擴增產(chǎn)物的大小可為400-500bp，具體可為 4 62bp。所述待測病毒可為歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒、H9N2亞型豬流感病毒、H3N2亞 型豬流感病毒、H1N2亞型豬流感病毒和經(jīng)典H1N1亞型豬流感病毒。所述方法為非疾病治 療和診斷方法。
[0011] 本發(fā)明還保護所述引物組在輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽H1N1亞型豬 流感病毒中的應(yīng)用。所述待測樣本可為死亡的豬的肝、腦、肺等組織，也可為死亡的豬的口 腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為豬的內(nèi)臟組織(肝、 腦、肺等）或豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。所述應(yīng)用中不包括 疾病治療和診斷方法。
[0012] 本發(fā)明還保護第一種輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病 毒的方法，包括如下步驟：以待測樣本的cDNA為模板，用所述引物對乙進行PCR擴增，如果 得到PCR擴增產(chǎn)物、待測樣本疑似含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到所述 PCR擴增產(chǎn)物、待測樣本疑似不含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。所述PCR擴增產(chǎn)物的 大小可為400-500bp，具體可為462bp。所述待測樣本可為死亡的豬的肝、腦、肺等組織，也 可為死亡的豬的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為 豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等)或豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等)加工得到的生鮮食品或熟食。所 述方法為非疾病治療和診斷方法。
[0013] 本發(fā)明還保護第二種輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病 毒的方法，依次包括如下步驟：（1)以待測病毒的cDNA為模板，用所述引物對甲進行PCR擴 增；（2)將完成步驟（1)的體系作為模板，用所述引物對乙進行PCR擴增，如果得到PCR擴 增產(chǎn)物、待測樣本疑似含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到所述PCR擴增產(chǎn) 物、待測樣本疑似不含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。所述PCR擴增產(chǎn)物的大小可為 400_ 500bp，具體可為462bp。所述待測樣本可為死亡的豬的肝、腦、肺等組織，也可為死亡 的豬的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為豬的內(nèi)臟 組織(肝、腦、肺等）或豬的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。所述方法 為非疾病治療和診斷方法。
[0014] 本發(fā)明提供的引物組為巢式引物，應(yīng)用時進行2次PCR擴增，可有效提高靈敏度； 第二次PCR擴增引物結(jié)合在第一次PCR擴增產(chǎn)物內(nèi)部，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片段， 則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低，因此，特異性也較強；可以檢出 目前我國流行的歐洲類禽H1N1亞型豬流感毒株，具有很好的覆蓋性和通用性；所需時間短 (4-5小時)、操作簡單、容易推廣，便于基層操作和應(yīng)用。
[0015] 應(yīng)用本發(fā)明提供的引物組輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，不僅適用于 病毒，也可以適用于臨床采集的樣品(如鼻腔拭子、臟器樣品等)，將成為歐洲類禽H1N1亞型 豬流感病毒疫病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有用檢測工具，有助于及時對豬染病情況及區(qū)域、 環(huán)境的病毒污染情況作出及時快捷的檢測和確診，以在最短時間內(nèi)作出正確的處置辦法。 本發(fā)明對及時診斷、撲滅疫情以及開展大規(guī)模歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的流行病學(xué) 監(jiān)測有著積極的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為引物對甲和引物對乙的組合物的特異性結(jié)果。
[0017] 圖2為引物對乙的組合物的特異性結(jié)果。
[0018] 圖3為引物對甲和引物對乙的組合物的靈敏度結(jié)果。
[0019] 圖4為引物對乙的組合物的靈敏度結(jié)果。
[0020] 圖5為引物對甲和引物對乙的組合物的普適性結(jié)果。

【具體實施方式】
[0021] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。以下實施例中，用于提取總RNA的試劑盒為Viral genome RNA rapid extraction Kit (名稱：QIAamp Viral RNA Mini Kit)，廠家QIAGEN，貨號52904。以下實施例中，用于 將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 的試劑盒為 The reverse transcription(RT)reaction (名稱： RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)，廠家 Fermentas，貨號 K1622。
[0022] 歐洲類禽 H1N1 亞型豬流感病毒（European Avian Influenza Virus-Like HINISwine Influenza A Viruses) ：Jinhua Liu, Yuhai Bi,Kun Qin, Guanghua Fu, Jun Yang, Jinshan Peng, Guangpeng Ma, Qinfang Liu, Juan Pu,and Fulin Tian, Emergence of European Avian Influenza Virus-Like HINISwine Influenza A Viruses in China, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, p_ 2643 - 2646。
[0023] 經(jīng)典 H1N1 亞型豬流感病毒（classical swine HINlinfluenza A virus): Jinxiang ffang&Xian Qi&Chengping Lu,Mutations in the C-terminal tail of NSlprotein facilitate the replication of classical swine HINlinfluenza A virus in mice, Folia Microbiol(2012)57:169 - 175
[0024] H9N2亞型豬流感病毒：楊煥良，喬傳玲，陳艷，辛?xí)怨?，陳化蘭，H9N2 亞型豬流感病毒A/Swine/Shandong/1/02分離株的基因序列分析中國獸醫(yī)科學(xué) 2007, 37(06):473-476。
[0025] H3N2亞型豬流感病毒：齊海濤，孔維立，張桂紅，豬流感病毒Η 1、Η 3、N 1、N 2亞 型分型R T _ P C R方法的建立，中國畜牧獸醫(yī)2012年第39卷第3期。
[0026] H1N2亞型豬流感病毒：楊煥良，喬傳玲，陳艷，辛?xí)怨?，李一?jīng)，陳化蘭，豬流 感病毒H1N1、H1N2和H；3N2亞型多重RT-PCR診斷方法的建立，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，第29卷 第9期，2007年9月。
[0027] 實施例1、特異引物對的設(shè)計
[0028] 設(shè)計兩對用于鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的引物對，分別命名為引物對 甲（外引物對）和引物對乙（內(nèi)引物對)。
[0029] 引物對甲如下：
[0030] EA-HA-269F (序列表的序列 1) :5, -TGGCAACCCAAMTGTGACT-3,；
[0031] EA-HA-995R (序列表的序列 2) :5, -GGGGCATTCTCCAATAGTG-3,。
[0032] 引物對乙如下：
[0033] EA-HA-429F (序列表的序列 3) :5, -ATTTTCCCAAAGGCAACC-3,；
[0034] EA-HA-S90R (序列表的序列：4) :5, -ATCCGACATCATAATTCCAGAAC-3，。
[0035] 實施例2、引物對乙和引物組的特異性檢測
[0036] 實驗樣本分別為：歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒、H9N2亞型豬流感病毒、H3N2亞 型豬流感病毒、H1N2亞型豬流感病毒和經(jīng)典H1N1亞型豬流感病毒。
[0037] 一、提取各個待測樣本（即病毒濃度為106PFU/100 μ L的病毒液）的總RNA并反轉(zhuǎn) 錄為cDNA。
[0038] 二、引物組的特異性
[0039] 1、以步驟一得到的cDNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0040] PCR 擴增的反應(yīng)體系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、EA-HA-269F0. 5μ 1、 ΕΑ-HA-995R0. 5 μ 1、cDNA2 μ 1，加雙蒸水至 25 μ 1。 、
[0041] PCR 擴增的反應(yīng)程序：94°C 5min;94t； 45s、5：rc 45s、72°C lmin，2〇 個循環(huán)； 72〇C lOmin ；4°C 10ho '
[0042] 2、將步驟1得到的PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用引物對乙進行pCR擴增，得到 PCR擴 增產(chǎn)物。
[0043] PCR 擴增的反應(yīng)體系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、EA-HA-429F0. 5μ 1、 EA-HA-890R0. 5 μ 1、步驟1得到的PCR擴增產(chǎn)物2 μ 1，加雙蒸水至25 μ 1。
[0044] PCR 擴增的反應(yīng)程序：94 υ 5min ;94 45s、56 °C 45s、72 °C lmin，20 個循環(huán)； 72〇C lOmin ；4°C 10ho '
[0045] 3、將步驟2的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖丨。圖i中，丄為 將雙蒸水作為模板的陰性對照，2為歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，3為H_2亞型豬流感 病毒，4為H3N2亞型豬流感病毒，5為H1N2亞型豬流感病毒，6為經(jīng)典H1N1亞型豬流感^ 毒，Μ為 TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、 lOObp)。結(jié)果表明，歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒樣本在400-500bp之間顯示特異條帶， 其他病毒則無相應(yīng)條帶?；厥账鎏禺悧l帶并進行測序，為462bp。
[0046] 三、引物對乙的特異性
[0047]以步驟一得到的CDNA為模板，用引物對乙進行pCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，將 PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳. ' '
[0048] PCR 擴增的反應(yīng)體系（25 μ 1) :2XMix Bufferl2. 5 μ 1、EA-HA-429F0. 5 μ 1、 EA-HA-890R0. 5 μ 1、cDNA2 μ 1，加雙蒸水至 25 μ 1。
[0049] PCR擴增的反應(yīng)程序同步驟二的2。
[0050] 電泳圖見圖2。圖2中，1為將雙蒸水作為模板的陰性對照，2為歐洲類禽H1N1亞 型豬流感病毒，3為H9N2亞型豬流感病毒，4為H3N2亞型豬流感病毒，5為H1N2亞型豬流感 病毒，6為經(jīng)典H1N1亞型豬流感病毒，，Μ為TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。結(jié)果表明，歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒樣本 在400-500bp之間顯示特異條帶，其他病毒則無相應(yīng)條帶?；厥账鎏禺悧l帶并進行測序， 為 462bp。
[0051] 實施例3、引物組的靈敏度檢測
[0052] -、分別提取病毒濃度為 104PFU/100y L、103PFU/100y L、102PFU/100y L、 10PFU/100 μ L或1PFU/100 μ L的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的病毒液(按照病毒濃度由 高至低依次命名為病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D或病毒液E)的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。
[0053] 二、引物組的靈敏度
[0054] 1、以步驟一得到的cDNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0055] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟二的1。
[0056] PCR擴增的反應(yīng)程序同實施例2的步驟二的1。
[0057] 2、將步驟1得到的PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用引物對乙進行PCR擴增，得到PCR擴 增產(chǎn)物。
[0058] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟二的2。
[0059] PCR擴增的反應(yīng)程序同實施例2的步驟二的2。
[0060] 3、將步驟2的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖3。圖3中，1至5 依次代表病母液A、病母液B、病毒液C、病毒液D和病毒液E，M為TransDNA Marker I (自上 至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。結(jié)果表明，lOPFU/ΙΟΟμ L 及以上的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的病毒液進行以上步驟后均可在電泳圖中觀察到 400-500bp之間的特異條帶?；厥账鎏禺悧l帶并進行測序，為 462bp。
[0061] 三、引物對乙的靈敏度
[0062]以步驟一得到的cDNA為模板，用引物對乙進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，將 PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳.
[0063] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟三。
[0064] PCR擴增的反應(yīng)程序同步驟二的2。
[0065]電泳圖見圖4。圖4中，1至5依次代表病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D和 病毒液 E，M 為 TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、100bp)。結(jié)果表明，102PFU/100uL及以上的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的病毒 液進行以上步驟后均可在電泳圖中觀察到400-500bp之間的特異條帶?；厥账鎏禺悧l帶 并進行測序，為462bp。
[0066]對比步驟二和步驟三，說明引物組(巢式PCR)的靈敏度比引物對乙(普通PCR)高 10倍。
[0067] 實施例4、引物組的普適性
[0068] -、毒株的獲得
[0069] 歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒毒株1 :2008年，從中國山東省具有發(fā)病表型的病 豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒毒株2 :2008年，從中國山東省具有發(fā)病表 型的病豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒毒株3 :2008年，從中國北京具有 發(fā)病表型的病豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒毒株4 :2007年，從中國福 建省具有發(fā)病表型的病豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒毒株5 :2008年， 從中國山東省具有發(fā)病表型的病豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒毒株6 : 2008年，從中國山東省具有發(fā)病表型的病豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒 毒株7 :2〇08年，從中國山東省具有發(fā)病表型的病豬體內(nèi)分離得到。歐洲類禽H1N1亞型豬 流感病毒毒株8 :2008年，從中國福建省具有發(fā)病表型的病豬體內(nèi)分離得到。
[00701 病豬的發(fā)病表型為豬突然發(fā)熱，精神不振，食欲減退或不食，橫臥在一起，不愿活 動，呼吸困難，激烈咳嗽，眼鼻流出粘液。
[0071] 二、引物組的普適性
[0072] 1、提取以上各個毒株的病毒液(病毒濃度為106PFU/100 μ L)的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。
[0073] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0074] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟二的1。
[0075] PCR擴增的反應(yīng)程序同實施例2的步驟二的1。
[0076] 3、將步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用引物對乙進行PCR擴增，得到 PCR擴 增產(chǎn)物。
[0077] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟二的2。
[0078] PCR擴增的反應(yīng)程序同實施例2的步驟二的2。
[0079] 4、將步驟3的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖5。圖 5中，泳 道1至8依次代表毒株1至8，M為TransDNA Marker I (自上至下依次代表7〇〇bp、600bp、 5〇Obp、4〇Obp、3〇Obp、2〇Obp、100bp )。8株毒株經(jīng)上述檢測均可見40〇-5〇〇bp之間的特異條 帶?；厥账鎏禺悧l帶并進行測序，均為4 62bp。結(jié)果表明，特異引物對的普適性很好。 [0080] 實施例5、應(yīng)用引物組檢測臨床樣本的方法 。
[0081] -、樣品的采集
[0082]病死或撲滅的病豬，取肝、腦或肺組織，或采用棉拭子(鼻腔拭子）取樣，2_ 8。〇保 存，待檢病料要保持新鮮。 ^
[0083]也可為病死或撲滅的病豬的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。
[0084] 二、樣品處理
[0085] 1、組織樣品處理：
[0086]稱取待檢病料l〇〇mg置研磨器中，加入0. 8ml裂解液(含硫氰酸胍〇· 8M、硫氰酸銨 0· 4M、甘油5%、^酚38%的0· 1M醋酸鈉緩沖液）研磨，把研磨好的病料移至h 5ml離心管 中，4 C、8000rpm罔心5min，取250 μ 1上清，置于1· 5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液 劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。 '
[0087] 2、棉拭子處理
[0088]將浸液中的棉拭子充分捻動，擰干后棄去拭子，4?、8000rpm離心5min，取 25〇 μ 1 上清液，置于1. 5ml滅菌咼心管中，加入750μ丨裂解液，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。
[0089] 3、陰性對照（RNase free 水）
[0090]、取滅菌雙蒸水25〇 μ 1，置于L Sml滅菌離心管中，加入75〇 μ丨裂解液，劇烈振蕩混 勻，室溫放置5min。
[0091] 三、應(yīng)用引物組檢測
[0092] 1、取步驟二得到的各個樣本，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0093] 2、以步驟1得到的d)NA為模板，用引物對甲進行PCR擴增，得到pCR擴增產(chǎn)物。
[0094] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟二的1。 °
[0095] PCR擴増的反應(yīng)程序同實施例2的步驟二的1。
[0096] 3、將步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用引物對乙進行pCR擴増，得到^^擴 增產(chǎn)物。
[0097] PCR擴增的反應(yīng)體系同實施例2的步驟二的2。
[0098] PCR擴增的反應(yīng)程序同實施例2的步驟二的2。
[0099] 4、將步驟3的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果進行判定，如 出現(xiàn)400-500bp之間的特異條帶(具體為462bp擴增帶)，表明樣品中含有歐洲類禽H1N1亞 型豬流感病毒。
【權(quán)利要求】
1. 弓丨物組，包括引物對乙；所述引物對乙由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列 表的序列4所示單鏈DNA分子組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于：所述引物組還包括引物對甲；所述引物對 甲由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成。
3. 權(quán)利要求1或2所述引物組在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下（a) 或（b): (a)輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒；（b)輔助鑒定待測樣本中是否含有歐 洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。
4. 一種試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述引物組；所述試劑盒的用途為如下（a)或（b): (a)輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒；（b)輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽 H1N1亞型豬流感病毒。
5. 權(quán)利要求1或2所述引物組在輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒中的應(yīng)用。
6. -種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的 cDNA為模板，用所述權(quán)利要求1中的引物對乙進行PCR擴增，如果得到PCR擴增產(chǎn)物、待測 病毒為候選的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到所述PCR擴增產(chǎn)物、待測病毒 為候選的非歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。
7. -種輔助鑒定歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，依次包括如下步驟： (1) 以待測病毒的cDNA為模板，用所述權(quán)利要求1中的引物對甲進行PCR擴增； (2) 將完成步驟（1)的體系作為模板，用所述權(quán)利要求1中的引物對乙進行PCR擴增， 如果得到PCR擴增產(chǎn)物、待測病毒為候選的歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到 所述PCR擴增產(chǎn)物、待測病毒為候選的非歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。
8. 權(quán)利要求1或2所述引物組在輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽H1N1亞型豬 流感病毒中的應(yīng)用。
9. 一種輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，包括如 下步驟：以待測樣本的cDNA為模板，用所述權(quán)利要求1中的引物對乙進行PCR擴增，如果得 至IJPCR擴增產(chǎn)物、待測樣本疑似含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到所述PCR 擴增產(chǎn)物、待測樣本疑似不含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。
10. -種輔助鑒定待測樣本中是否含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒的方法，依次包 括如下步驟： (1) 以待測病毒的cDNA為模板，用所述權(quán)利要求1中的引物對甲進行PCR擴增； (2) 將完成步驟（1)的體系作為模板，用所述權(quán)利要求1中的引物對乙進行PCR擴增， 如果得到PCR擴增產(chǎn)物、待測樣本疑似含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到 所述PCR擴增產(chǎn)物、待測樣本疑似不含有歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒。
【文檔編號】C12N15/11GK104232787SQ201310231244
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】劉金華, 蒲娟, 魏延迪, 裴星瑤, 俞晨芳, 張谞霄, 齊魯 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)