工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵產(chǎn)黃孢原毛平革菌厚垣孢子及其制劑的方法及其制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種制備黃孢原毛平革菌厚垣孢子的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：（1）將黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；所述發(fā)酵種子為黃孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌絲體；（2）將接種了所述黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體深層發(fā)酵，以產(chǎn)生黃孢原毛平革菌的厚垣孢子。另外還提供了一種制備黃孢原毛平革菌厚垣孢子制劑的方法及其制劑。通過上述技術(shù)方案，可簡(jiǎn)單的、大規(guī)模生產(chǎn)黃孢原毛平革菌的厚垣孢子。
【專利說明】工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵產(chǎn)黃孢原毛平革菌厚垣孢子及其制劑的方法及其制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子和制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法，以及利用該方法制備的黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)具有很強(qiáng)且廣譜的降解異生物質(zhì)的能力。自20世紀(jì)80年代初《Science》首次報(bào)道了 P.chrysosporium的降解作用，便引起了環(huán)境界的廣泛關(guān)注，開展了對(duì)白腐真菌生物學(xué)特性、理化特性、應(yīng)用等方面的大量研究，成為污水處理、廢氣污染處理和土壤生物修復(fù)的有用工具。
[0003]P.chrysosporium在其生長(zhǎng)周期內(nèi)可以產(chǎn)生三種繁殖體,包括菌絲體、厚垣孢子和分生孢子。目前P.chrysosporium的發(fā)酵生產(chǎn)主要采用液體發(fā)酵菌絲生產(chǎn)漆酶、過氧化物酶等代謝產(chǎn)物，或者采用固體培養(yǎng)生產(chǎn)分生孢子制備分生孢子制劑。由于其菌絲或分生孢子不易保存，在保存和運(yùn)輸過程中，菌劑中有效微生物大量死亡或活性降低，導(dǎo)致產(chǎn)品的效力減小或功能下降，限制了 P.chrysosporium菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。厚垣孢子是真菌產(chǎn)生的一種細(xì)胞壁加厚的具有抵抗能力的孢子，能抗御不良外界環(huán)境，如高溫、低溫、紫外線、pH值和其他化學(xué)物質(zhì),產(chǎn)品的貨架期長(zhǎng),易于保存。因此開發(fā)P.chrysosporium的厚垣孢子制劑，對(duì)于P.chrysosporium的商品化開發(fā)利用具有重要意義。
[0004]CN102140425A公開了一種黃孢原毛平革菌厚垣孢子的培養(yǎng)方法，但該方法采用搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵P.chrysosporium,菌絲團(tuán)需要冷凍后研磨處理制備菌劑,該方法的發(fā)酵培養(yǎng)僅為搖瓶水平，從搖瓶到大罐的不斷放大生產(chǎn)過程中還有許多技術(shù)難題，且該方法操作步驟復(fù)雜，與大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)要求有一定的距離。
[0005]因此，亟需開發(fā)一種操作簡(jiǎn)單且適用于發(fā)酵罐大規(guī)模生產(chǎn)黃孢原毛平革菌厚垣`孢子的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子操作步驟復(fù)雜、不適于大規(guī)模生產(chǎn)的缺陷，提供一種操作方法簡(jiǎn)單且可大規(guī)模生產(chǎn)黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法，一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法，以及利用該方法得到的黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法，其中，該方法包括如下步驟:
[0008](I)將黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；所述發(fā)酵種子為黃孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌絲體；
[0009](2)將接種了所述黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子的培養(yǎng)基進(jìn)行液體深層發(fā)酵，以產(chǎn)生黃孢原毛平革菌的厚垣孢子；[0010]其中，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有0.5-3.5重量％的碳水化合物、0.1-2重量％的酵母粉、2-8重量％的玉米漿、0.05-1重量％的CaC03、0.005-0.05重量％的ZnS04、
0.005-0.05重量%的MgS04、0.01-0.05重量%的MnSO4和余量的水；
[0011]步驟(2)中，所述液體深層發(fā)酵的條件包括:發(fā)酵的溫度為25_31°C，通氣量為1:0.5-1體積:(體積.分鐘)，攪拌速度為150-200rpm，發(fā)酵的時(shí)間為100-120小時(shí)。
[0012]第二方面，本發(fā)明提供了一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法，其中，該方法包括:
[0013](I)按照本發(fā)明提供的方法制備含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液；
[0014](2)將所述含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液與助濾劑混合，得到混合后的物料；
[0015](3)將步驟(2)中所述的混合后的物料進(jìn)行固液分離，得到含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
[0016]第三方面，本發(fā)明提供了如上所述的方法制備的黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
[0017]通過上述技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)了操作方法簡(jiǎn)單且可大規(guī)模生產(chǎn)黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的目的。
[0018]本發(fā)明的其他特 征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020]第一方面，本發(fā)明提供了一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法，其中，該方法包括如下步驟:
[0021](I)將黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；所述發(fā)酵種子為黃孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌絲體；
[0022](2)將接種了所述黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子的培養(yǎng)基進(jìn)行液體深層發(fā)酵，以產(chǎn)生黃孢原毛平革菌的厚垣孢子；
[0023]其中，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有0.5-3.5重量％的碳水化合物、0.1-2重量％的酵母粉、2-8重量％的玉米漿、0.05-1重量％的CaC03、0.005-0.05重量％的ZnS04、
0.005-0.05重量%的MgS04、0.01-0.05重量%的MnSO4和余量的水；
[0024]步驟(2)中，所述液體深層發(fā)酵的條件包括:發(fā)酵的溫度為25_31°C，通氣量為1:0.5-1體積:(體積.分鐘)，攪拌速度為150-200rpm，發(fā)酵的時(shí)間為100-120小時(shí)。
[0025]優(yōu)選的，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有1-1.5重量％的碳水化合物、0.5-1重量%的酵母粉、3-5重量%的玉米漿、0.1-0.5重量%的CaC03、0.01-0.02重量%的ZnSO4'
0.01-0.03 重量 ％ 的 MgSO4 和 0.02-0.04 重量 ％ 的 MnS04。
[0026]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的碳水化合物為本領(lǐng)域常規(guī)的各種可以為培養(yǎng)基提供碳源的碳水化合物，優(yōu)選的，所述碳水化合物為淀粉、葡萄糖和蔗糖中的一種或多種；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為培養(yǎng)基的自然pH值，優(yōu)選為6.5-6.8。
[0027]本發(fā)明中，所述黃孢原毛平革菌的來源沒有特別的限制，例如，可以在工業(yè)微生物菌種保藏管理中心通過商購獲得，例如，編號(hào)可以為CICC40299，也可以為CICC40719。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，所述黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子的接種量可以為常規(guī)的接種量，優(yōu)選以每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述發(fā)酵種子的接種量為5-10體積％。
[0029]其中，步驟(2)中，所述液體深層發(fā)酵的操作可以按照常規(guī)的液體深層發(fā)酵方法進(jìn)行，優(yōu)選情況下，所述液體深層發(fā)酵的操作包括如下步驟:(I)接種步驟，在所述接種步驟中，將如上所述的黃孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌絲體接種到液體培養(yǎng)基中；(2)發(fā)酵步驟，在所述發(fā)酵步驟中，將接種了黃孢原毛平革菌分生孢子和/或菌絲體的液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。
[0030]其中，所述黃孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌絲體可以使用常規(guī)的斜面培養(yǎng)法獲得，例如，可以將如上所述的黃孢原毛平革菌的菌絲體接種在PDA培養(yǎng)基(含有馬鈴薯180-220g/L,葡萄糖 18-22g/L，瓊脂 10_25g/L，pH 值 6.8-7.0 )上，在 29-31V 下培養(yǎng) 5-7 天，即可得到大量附著在培養(yǎng)基上的分生孢子和/或菌絲體，可以將斜面培養(yǎng)結(jié)束的培養(yǎng)基挖塊以得到用于接種的分生孢子和/或菌絲體。其中，也可以將斜面培養(yǎng)結(jié)束的培養(yǎng)基挖塊并接種于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)的菌絲體，將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌絲體作為用于發(fā)酵生產(chǎn)的接種體。
[0031]所述擴(kuò)大培養(yǎng)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以將斜面培養(yǎng)結(jié)束的培養(yǎng)基挖塊并接種于搖瓶培養(yǎng)基(含有淀粉5-15g/L、葡萄糖5-15g/L、酵母粉3-7g/L、CaC033-5g/L，pH值 6.5-6.8)中，在溫度為 29_35°C、轉(zhuǎn)速為 150_250rpm 的條件下培養(yǎng) 20-30小時(shí)，得到大量的菌絲體；并將所述得到的菌絲體接種于種子罐培養(yǎng)基(含有淀粉5-15g/L、葡萄糖5-15g/L、酵母粉3-7g/L、CaC033_5g/L，pH值自然)中，在溫度為29_31°C、轉(zhuǎn)速為150-200rpm的條件下培養(yǎng)20-30小時(shí)，得到用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種的大量的菌絲體。
`[0032]其中，所述發(fā)酵的條件可以為常規(guī)的液體深層發(fā)酵條件，例如，發(fā)酵的溫度可以為25-31 °C，通氣量可以為1:0.5-1體積:(體積?分鐘)，攪拌速度可以為150-200rpm。盡管在這樣的發(fā)酵條件下，即可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的目的，但為了進(jìn)一步提高黃孢原毛平革菌厚垣孢子的產(chǎn)量，優(yōu)選情況下，發(fā)酵第0-40小時(shí)的溫度為29-31°C，發(fā)酵第40小時(shí)以后的溫度為27-29°C ;發(fā)酵第0-10小時(shí)的通氣量為1:0.5-0.8體積:(體積.分鐘)，發(fā)酵第10-40小時(shí)的通氣量為1:0.8-1體積:(體積.分鐘)，發(fā)酵第40小時(shí)以后的通氣量為1:0.5-0.8體積:(體積.分鐘)；攪拌速度為175-185rpm。發(fā)酵周期為100-120小時(shí)，此時(shí)，80%以上的菌絲體都形成了厚垣孢子。
[0033]術(shù)語“通氣量”一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(V / V ^mirT1),例如通氣比為1:0.1_1，簡(jiǎn)稱通氣量為0.1_1體積:(體積?分鐘)。
[0034]第二方面，本發(fā)明提供了一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法，其中，該方法包括:
[0035](I)按照本發(fā)明提供的方法制備含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液；
[0036](2)將所述含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液與助濾劑混合，得到混合后的物料；
[0037](3)將步驟(2)中所述的混合后的物料進(jìn)行固液分離，得到含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。[0038]所述助濾劑的種類和加入量沒有特別的限制，只要可促進(jìn)厚垣孢子的分散和發(fā)酵液的固液分離，并且對(duì)厚垣孢子沒有毒害作用即可。優(yōu)選地，所述助濾劑為硅藻土和/或輕質(zhì)碳酸鈣，以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，所述助濾劑的加入量為3-5重量％。其中，所述“助濾劑”是一種為防止濾渣堆積過于密實(shí)，使過濾順利進(jìn)行，而使用的細(xì)碎程度不同的不溶性惰性材料。
[0039]其中，所述固液分離的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用板框壓濾過濾或離心的方法得到含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，為了便于含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的保存，優(yōu)選情況下，該方法還包括將固液分離得到的固體濾餅或離心沉淀物進(jìn)行干燥并粉碎得到含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的干制劑。
[0041]其中，所述干燥的條件包括:干燥的溫度可以為60-80°C ;干燥的時(shí)間為可以為16-20小時(shí)。
[0042]第三方面，本發(fā)明提供了如上所述的方法制備的黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
[0043] 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0044]以下實(shí)施例和對(duì)比例中，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的方法計(jì)算產(chǎn)孢量。
[0045]黃孢原毛平革菌購自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CICC40299。
[0046]制備例I
[0047]取削皮后的馬鈴薯20g煮沸20分鐘取汁，將汁與2g葡萄糖、1.5g瓊脂和水配成100ml，裝瓶滅菌后冷卻得到PDA培養(yǎng)基。
[0048]將5g淀粉、5g葡萄糖、2.5g酵母粉、0.15g CaCO3和水配制成500mL，裝瓶(每瓶IOOmL)滅菌后冷卻得到搖瓶培養(yǎng)基。
[0049]將5kg淀粉、5kg葡萄糖、2.5kg酵母粉、1.5kg CaCO3和水配制成500L,裝入種子罐中滅菌后得到種子罐培養(yǎng)基。
[0050]制備例2
[0051]將黃孢原毛平革菌接種于制備例I中的PDA培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)5天；將接種并培養(yǎng)后的PDA培養(yǎng)基挖塊接種于制備例I中的搖瓶液體培養(yǎng)基中(100ml液體培養(yǎng)基接種PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌苔1cm2)，在30°C和轉(zhuǎn)速200rpm的條件下，培養(yǎng)24小時(shí)，作為發(fā)酵種子罐接種體；將培養(yǎng)好的搖瓶接種體接入滅菌后的種子罐培養(yǎng)基中(接種量0.5% (v/v))，在30°C和轉(zhuǎn)速180rmp的條件下，培養(yǎng)24小時(shí)，成為發(fā)酵種子。
[0052]實(shí)施例1
[0053]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法。
[0054](I)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:將以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，淀粉含量為1.5重量％、酵母粉含量為0.5重量％、玉米漿含量為4重量％、CaCO3含量為0.3重量％、ZnSO4的含量為0.02重量％、MgSO4的含量為0.025重量％和MnSO4的含量為0.03重量％的6500升培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基，自然PH值。
[0055](2)將制備例2中得到的發(fā)酵種子，按5% (體積/體積)的接種量接種于本實(shí)施例步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件為:發(fā)酵第0-40小時(shí)的發(fā)酵溫度為30°C;發(fā)酵第40小時(shí)以后的發(fā)酵溫度為28°C;發(fā)酵第0-10小時(shí)的通氣量為1:0.6體積:(體積.分鐘)；發(fā)酵第10-40小時(shí)的通氣量為1:1體積:(體積.分鐘)，發(fā)酵第40小時(shí)以后的通氣量為1:0.6體積:(體積.分鐘)；攪拌速度為180rpm。
[0056](3)發(fā)酵第110小時(shí)時(shí)，90%以上菌絲都形成厚垣孢子，發(fā)酵液變稀，加入325kg硅藻土，攪拌混勻，將此時(shí)的發(fā)酵液通過板框壓濾，收集濾餅，將得到濾餅干燥及粉碎得到黃孢原毛平革菌厚垣孢子制劑。其中，所述干燥的溫度為60°C，干燥的時(shí)間為20小時(shí)。產(chǎn)孢量為5.6 X IO7個(gè)厚垣孢子/mL。
[0057]實(shí)施例2
[0058]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法。
[0059](I)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:將以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，葡萄糖含量為I重量％、酵母粉含量為I重量％、玉米漿含量為5重量％、CaCO3含量為0.1重量％、ZnSO4的含量為0.01重量％、MgS04的含量為0.03重量％和MnSO4的含量為0.04重量％的6500升培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0060](2)將制備例2中得到的發(fā)酵種子，按7% (體積/體積)的接種量接種于本實(shí)施例步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件為:發(fā)酵第0-40小時(shí)的發(fā)酵溫度為31°C;發(fā)酵第40小時(shí)以后的發(fā)酵溫度為29°C;發(fā)酵第0-10小時(shí)的通氣量為1: 0.8體積:(體積.分鐘)；發(fā)酵第10-40小時(shí)的通氣量為1:0.9體積:(體積.分鐘)，發(fā)酵第40小時(shí)以后的通氣量為1:0.5體積:(體積.分鐘)；攪拌速度為185rpm。
[0061](3)發(fā)酵第110小時(shí)時(shí)，90%以上菌絲都形成厚垣孢子，發(fā)酵液變稀，加入325kg輕質(zhì)碳酸鈣，攪拌混勻，將此時(shí)的發(fā)酵液通過板框壓濾收集厚垣孢子，收集濾餅，并干燥及粉碎即為黃孢原毛平革菌厚垣孢子制劑。其中，所述干燥的溫度為65°C，干燥的時(shí)間為19小時(shí)。產(chǎn)孢量為3.2X IO7個(gè)厚垣孢子/mL。
[0062]實(shí)施例3
[0063] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法。
[0064](I)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:將以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，蔗糖含量為1.3重量％、酵母粉含量為0.8重量％、玉米漿含量為3重量％、CaCO3含量為0.5重量％、ZnSO4的含量為0.015重量％、MgS04的含量為0.01重量％和MnSO4的含量為0.02重量％的6500升培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0065](2)將制備例2中得到的發(fā)酵種子，按10% (體積/體積)的接種量接種于本實(shí)施例步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件為:發(fā)酵第0-40小時(shí)的發(fā)酵溫度為29°C;發(fā)酵第40小時(shí)以后的發(fā)酵溫度為27°C;發(fā)酵第0-10小時(shí)的通氣量為1: 0.5體積:(體積.分鐘)；發(fā)酵第10-40小時(shí)的通氣量為1:0.8體積:(體積.分鐘)，發(fā)酵第40小時(shí)以后的通氣量為1:0.8體積:(體積.分鐘)；攪拌速度為175rpm。
[0066](3)發(fā)酵第110小時(shí)時(shí)，90%以上菌絲都形成厚垣孢子，發(fā)酵液變稀，加入325kg輕質(zhì)碳酸鈣，攪拌混勻，將此時(shí)的發(fā)酵液通過板框壓濾收集厚垣孢子，收集濾餅，并干燥及粉碎即為黃孢原毛平革菌厚垣孢子制劑。其中，所述干燥的溫度為80°C，干燥的時(shí)間為16小時(shí)。產(chǎn)孢量為2.1 X IO7個(gè)厚垣孢子/mL。[0067]實(shí)施例4
[0068]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法。
[0069]按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的制備以及黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的制備，不同的是，進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制備的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，淀粉含量為3.5重量％、酵母粉含量為0.1重量％、玉米漿含量為8重量％、CaCO3含量為0.05重量％、ZnSO4的含量為0.05重量％、MgS04的含量為0.005重量％和MnSO4的含量為0.05重量％。產(chǎn)孢量為7.1 X IO6個(gè)厚垣孢子/mL。
[0070]實(shí)施例5
[0071]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法。
[0072]按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的制備以及黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的制備，不同的是，進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制備的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為，以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，淀粉含量為0.5重量％、酵母粉含量為2重量％、玉米漿含量為2重量％、CaCO3含量為I重量％、ZnSO4的含量為0.005重量％、MgS04的含量為0.05重量％和MnSO4的含量為0.01重量％。產(chǎn)孢量為6.6 X IO6個(gè)厚垣孢子/mL。
[0073]實(shí)施例6
[0074]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基、制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌 的厚垣孢子制劑的方法。
[0075]按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的制備以及黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的制備，不同的是，發(fā)酵的過程中發(fā)酵第0-40小時(shí)的發(fā)酵溫度為31°C ；發(fā)酵第40小時(shí)以后的發(fā)酵溫度為25°C。產(chǎn)孢量為9.2X IO6個(gè)厚垣孢子/mL。
[0076]實(shí)施例7
[0077]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法。
[0078]按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的制備以及黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的制備，不同的是，發(fā)酵的整個(gè)過程中發(fā)酵的溫度為30°C。產(chǎn)孢量為
1.2 X IO7個(gè)厚垣孢子/mL。
[0079]對(duì)比例I
[0080]本實(shí)施例用于說明現(xiàn)有技術(shù)提供的制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的方法以及制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法
[0081]按照實(shí)施例7的方法進(jìn)行黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的制備以及黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的制備，不同的是，發(fā)酵的整個(gè)過程中發(fā)酵的溫度為33°C。產(chǎn)孢量為
2.3 X IO6個(gè)厚垣孢子/mL。
[0082]通過上述采用本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施例1-7與采用現(xiàn)有技術(shù)提供的技術(shù)方案的對(duì)比例I相比，采用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵工藝，產(chǎn)孢量可大大提高。將實(shí)施例1-3與實(shí)施例4和5進(jìn)行比較可以看出，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的含量在本發(fā)明優(yōu)選的范圍內(nèi)時(shí)，其產(chǎn)孢量較高。將實(shí)施例1-3與實(shí)施例6和7進(jìn)行比較可以看出，當(dāng)發(fā)酵條件在本發(fā)明優(yōu)選的范圍內(nèi)時(shí)，其產(chǎn)孢量較高。因此，采用本發(fā)明的方法可大規(guī)模的生產(chǎn)黃孢原平革菌的厚垣孢子；且發(fā)酵結(jié)束后，制備黃孢原平革菌的厚垣孢子制劑的操作方案簡(jiǎn)單。
[0083]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0084]另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。 [0085]此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種制備黃孢原毛平革菌厚垣孢子的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)將黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；所述發(fā)酵種子為黃孢原毛平革菌的分生孢子和/或菌絲體； (2)將接種了所述黃孢原毛平革菌的發(fā)酵種子的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體深層發(fā)酵，以產(chǎn)生黃孢原毛平革菌的厚垣孢子； 其中， 步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有0.5-3.5重量％的碳水化合物、0.1-2重量％的酵母粉、2-8重量％的玉米漿、0.05-1重量％的CaC03、0.005-0.05重量％的ZnS04、0.005-0.05重量%的MgS04、0.01-0.05重量%的MnSO4和余量的水； 步驟(2)中，所述液體深層發(fā)酵的條件包括:發(fā)酵的溫度為25-31°C，通氣量為1:0.5-1體積:(體積.分鐘)，攪拌速度為150-200rpm，發(fā)酵的時(shí)間為100-120小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有1-1.5重量％的碳水化合物、0.5-1重量％的酵母粉、3-5重量％的玉米漿、0.1-0.5重量％的CaC03、0.01-0.02 重量 ％ 的 ZnS04、0.01-0.03 重量 ％ 的 MgSO4 和 0.02-0.04 重量 ％ 的 MnSO4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟(1)中，所述碳水化合物為淀粉、葡萄糖和蔗糖中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，所述液體深層發(fā)酵的條件包括:發(fā)酵第0-40小時(shí)的溫度為29-31°C，發(fā)酵第40小時(shí)以后的溫度為27-29°C ;發(fā)酵第0_10小時(shí)的通氣量為1:0.5-0.8體積:(體積.分鐘)，發(fā)酵第10-40小時(shí)的通氣量為1:0.8-1體積:(體積?分鐘)，發(fā)酵第40小時(shí)以后的通氣量為1:0.5-0.8體積:(體積?分鐘)；攪拌速度為 175-185rpm。
5.一種制備黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑的方法，其特征在于，該方法包括: (1)按照權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法制備含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液； (2)將所述含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液與助濾劑混合，得到混合后的物料； (3)將步驟(2)中所述的混合后的物料進(jìn)行固液分離，得到含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，相對(duì)于每重量份的所述含有黃孢原毛平革菌的厚垣孢子的發(fā)酵液，助濾劑的加入量為3-5重量％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，所述助濾劑為硅藻土和/或輕質(zhì)碳酸鈣。
8.由權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)所述的方法制備的黃孢原毛平革菌的厚垣孢子制劑。
【文檔編號(hào)】C12N3/00GK103667169SQ201310228809
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月8日
【發(fā)明者】李梅, 蔣細(xì)良 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所