專利名稱：發(fā)酵制備l-谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及氨基酸的制備方法，尤其涉及一種優(yōu)化溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-谷氨酸在食品、醫(yī)藥、工業(yè)方面均有廣泛的用途，尤其是在食品方面，它是制造味精的前體。有關(guān)L-谷氨酸的制備方法較多，以發(fā)酵法為主。經(jīng)過(guò)眾多科研人員的努力，不斷選育出一些活性較高的新菌種供生產(chǎn)使用，并開發(fā)出許多新方法，然而，糖酸轉(zhuǎn)化率較低。另外，受原輔料價(jià)格不斷上漲，谷氨酸生產(chǎn)成本不斷提高的影響，生產(chǎn)谷氨酸的利潤(rùn)下滑。因此，尋求更優(yōu)化的發(fā)酵條件，提高谷氨酸產(chǎn)量，降低成本是需要解決的問(wèn)題。甜菜堿作為一種高效的甲基供體，具有替代蛋氨酸的供甲基功效。另外，甜菜堿還是一種非毒性的、對(duì)生物有效的滲透壓緩沖物質(zhì)，可作為細(xì)胞的滲透壓保護(hù)劑。各種生物和動(dòng)物組織在不同壓力下，甜菜堿與其他酶的功能保持高度一致，對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞的代謝起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)滲透壓激變時(shí)，如外部滲透壓升高時(shí)，細(xì)胞開始產(chǎn)生或吸收甜菜堿以維持正常滲透壓的平衡，同時(shí)防止細(xì)胞水分流出和鹽分的入侵，并能提高鈉鉀泵的功效，確保細(xì)胞的正常功能。因此，甜菜堿作為發(fā)酵助劑廣泛應(yīng)用于溫度敏感型菌株強(qiáng)制發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的生產(chǎn)中，添加方式普遍采用在初始培養(yǎng)基中一次性添加。研究表明，發(fā)酵液中低濃度的甜菜堿明顯有利于產(chǎn)物合成。在菌體生長(zhǎng)階段，初始培養(yǎng)基中的甜菜堿濃度過(guò)高，則容易造成大量的甜菜堿被分解代謝用于菌體的合成，造成甜菜堿消耗量的增加。在產(chǎn)物合成期，高濃度的甜菜堿不利于產(chǎn)物積累，低濃度的甜菜堿有利于胞內(nèi)產(chǎn)物向胞外的釋放從而增加合成，這與甜菜堿分子具有兩性有關(guān)。但是，甜菜堿濃度并非越低越好，甜菜堿的濃度應(yīng)控制在既能滿足甲基供體的需要又有利于產(chǎn)物合成的范圍內(nèi)。在發(fā)酵過(guò)程中，甜菜堿對(duì)細(xì)菌受到的滲透壓呼吸抑制有緩解作用，從而刺激呼吸，提高菌體的氧消耗速率，抑制乳酸菌的積累，提高菌體生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率。由于在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸鹽甜菜堿，制得的L-谷氨酸中必然含有磷的成分， 在安全性要求較高的保健食品和醫(yī)藥行業(yè)，往往不能直接應(yīng)用，限制了它的使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)一種在初始培養(yǎng)基和發(fā)酵變溫過(guò)程中，添加較低濃度甜菜堿的方法來(lái)提高溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵產(chǎn)率的方法。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法。本發(fā)明采用溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌，在L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，分期于培養(yǎng)基中添加不同的低濃度甜菜堿，并調(diào)節(jié)和控制發(fā)酵培養(yǎng)溫度，來(lái)提高谷氨酸的產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明方法包括下列步驟:
(I)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(/L):葡萄糖15g，玉米漿 20g, K2HP043g, MgS04.7H201g, VB1200 μ g/L, DL-蛋氨酸50 μ g/L, FeSO4.7Η20、MnSO4.H2O 各 2mg/L,尿素 0.55 (分消)，ρΗ7.0 7.2，121 °C 滅菌15min ；方法:采用溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌(谷氨酸黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌等)，接種量為12% ;培養(yǎng)溫度32°C，160rpm，振蕩培養(yǎng)14 16h至對(duì)數(shù)期；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):葡萄糖·20g,玉米衆(zhòng) 20g,鹽酸鹽甜菜堿 0.1 0.3g, K2HP047.5g, MgSO4.7H201.5g,VB1200 μ g/L, VH600 μ g/L, FeSO4.7H20、MnSO4.H2O 各 30mg/L，尿素 0.55 (分消)，ρΗ7.0 7.2，121°C 滅菌 15min ；方法:按12%的接種量將種子液接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基全自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制pH值7.0 7.2 ;分階段供氧模式控制溶氧:0 IOh為20%，10 32h為5% ;控制初始培養(yǎng)溫度為32°C ;當(dāng)相對(duì)生長(zhǎng)Λ OD = 0.3左右時(shí)(此為發(fā)酵液稀釋20倍濃度在620nm處的OD值)，轉(zhuǎn)換溫度到37°C，同時(shí)添加0.1 0.3g/L的鹽酸鹽甜菜堿；Λ OD = 0.6時(shí)，再次提高溫度到38°C繼續(xù)發(fā)酵至結(jié)束。通過(guò)流加80%的葡萄糖濃溶液將殘?zhí)强刂圃跒?.1 3g/L。全過(guò)程流加液氨控制pH，發(fā)酵O 14h，pH為7.0 7.1，14 25h為7.2 7.3，25h至發(fā)酵結(jié)束為6.8，產(chǎn)酸值不再變化并有pH值上升時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)；發(fā)酵時(shí)間為30-32h。本發(fā)明方法所述步驟(I)溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌為谷氨酸黃色短桿菌或谷氨酸棒桿菌。所述菌株是公開報(bào)道使用的，如:陳寧，彭飛，張克旭.L-谷氨酸溫度敏感突變株的細(xì)胞融合育種及發(fā)酵條件，發(fā)酵科技通迅，2004，33 (I)，10-14.
張克旭，陳寧.谷氨酸溫度敏感突變株C N1021發(fā)酵條件的研究，發(fā)酵科技通迅，2003，33(2):3-5.
本發(fā)明方法所述步驟(2)添加的甜菜堿為鹽酸鹽甜菜堿、無(wú)水甜菜堿或一水甜菜堿中的一種或多種的混合物。本發(fā)明根據(jù)在溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵過(guò)程中，低濃度的甜菜堿有利用菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成的特性，分別在初始和變溫過(guò)程中，在培養(yǎng)基中添加甜菜堿來(lái)提供甲基，以及刺激細(xì)胞呼吸，提高菌體的氧消耗速率，抑制乳酸菌的積累，提高菌體生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率。由此制得的谷氨酸，不含磷的成分，可直接用在保健食品和醫(yī)藥行業(yè)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍:實(shí)施例1 采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸黃色短桿菌種子培養(yǎng)基(/L):葡萄糖15g，玉米漿 20g, K2HP043g, MgS04.7H201g, VB1200 μ g/L, DL-蛋氨酸50 μ g/L, FeSO4.7Η20、MnSO4.H2O 各 2mg/L,尿素 0.55 (分消)，ρΗ7.0 7.2，121 °C 滅菌15min ；種子培養(yǎng)方法:將斜面菌種用IOml無(wú)菌水洗下，轉(zhuǎn)接于裝有1200mL種子培養(yǎng)基的5000mL種瓶中，培養(yǎng)溫度32°C，160rpm，振蕩培養(yǎng)14 16h ；發(fā)酵培養(yǎng)基(/L ):葡萄糖20g,玉米衆(zhòng) 20g,鹽酸鹽甜菜堿 0.lg, K2HP047.5g, MgSO4.7H201.5g,VB1200 μ g/L, VH600 μ g/L, FeSO4.7H20、MnSO4.H2O 各 30mg/L，尿素 0.55 (分消)，ρΗ7.0
7.2，121°C 滅菌 15min ；發(fā)酵培養(yǎng)方法:按12%的接種量將種子液全部接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的15L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制PH值調(diào)至7.0 7.2 ;分階段供氧模式控制溶氧:0 IOh為20%, 10 32h為5% ;控制初始培養(yǎng)溫度為32°C。當(dāng)相對(duì)生長(zhǎng)光密度值Λ OD = 0.3左右時(shí)(發(fā)酵液稀釋20倍濃度在620nm處的OD值)，轉(zhuǎn)換溫度到37°C，同時(shí)，再添加0.1 g/L的鹽酸鹽甜菜堿；Δ OD = 0.6時(shí)，再次提高溫度到38°C繼續(xù)發(fā)酵至結(jié)束。通過(guò)流加80%的葡萄糖濃溶液將殘?zhí)强刂圃跒閘g/L。全過(guò)程流加液氨控制pH，發(fā)酵O 14h，pH為7.0 7.1，14 25h為
7.2 7.3，25h至發(fā)酵結(jié)束為6.8，產(chǎn)酸值不再變化并有pH值略升時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)(31h)。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為216.7g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為65.3%。對(duì)比例1:對(duì)照例I跟實(shí)施例1的不同點(diǎn)在于:當(dāng)溫度轉(zhuǎn)換至37°C時(shí)不添加甜菜堿，而在溫度轉(zhuǎn)換至38°C時(shí)，添加1.0g/L的一水甜菜堿，其他條件與實(shí)施例1相同。發(fā)酵結(jié)束時(shí)L-谷氨酸的產(chǎn)量為212.9g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為63.3%。對(duì)比結(jié)果表明實(shí)施例1發(fā)酵結(jié)束時(shí)的L-谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率明顯優(yōu)于對(duì)比例I。實(shí)施例2:`采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸棒桿菌；在轉(zhuǎn)換溫度到37°C時(shí)，同時(shí)添加lg/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為213.lg/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為62.8%。實(shí)施例3:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸黃色短桿菌；在轉(zhuǎn)換溫度到37°C時(shí)，同時(shí)添加1.5g/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為211.8g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61.7%。實(shí)施例4:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸黃色短桿菌；發(fā)酵初始培養(yǎng)基為在發(fā)酵培養(yǎng)基中加0.3g/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為219.4g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為68.1%。對(duì)比例2:對(duì)照例2跟實(shí)施例4的不同點(diǎn)在于:通過(guò)流加80%的葡萄糖濃溶液將殘?zhí)强刂圃跒?g/L。其他條件與實(shí)施例4相同。發(fā)酵結(jié)束時(shí)L-谷氨酸的產(chǎn)量為216.8g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為65.5%。對(duì)比結(jié)果表明實(shí)施例4發(fā)酵結(jié)束時(shí)的L-谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率明顯優(yōu)于對(duì)比例2。對(duì)比例3:對(duì)照例3跟實(shí)施例4的不同點(diǎn)在于:通過(guò)流加80%的葡萄糖濃溶液將殘?zhí)强刂圃跒?0g/L。其他條件與實(shí)施例4相同。發(fā)酵結(jié)束時(shí)L-谷氨酸的產(chǎn)量為211.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61.3%。對(duì)比結(jié)果表明實(shí)施例4發(fā)酵結(jié)束時(shí)的L-谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率明顯優(yōu)于對(duì)比例3。實(shí)施例4與對(duì)比例2，3結(jié)果對(duì)比表(表I)
殘?zhí)强亓?g/L)產(chǎn)酸率(％) 糖酸轉(zhuǎn)化率(％)
實(shí)施例 4I219.468.1
對(duì)比例 24216.865.5
對(duì)比例 310211.261.3實(shí)施例5:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸黃色短桿菌；在轉(zhuǎn)換溫度到37°C時(shí)，同時(shí)添加lg/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例4。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為214.3g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為63.4%。實(shí)施例6:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸黃色短桿菌；在轉(zhuǎn)換溫度到37°C時(shí)，同時(shí)添加1.5g/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例4。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為209.7g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61. 2%。實(shí)施例7:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸棒桿菌；發(fā)酵初始培養(yǎng)基為在發(fā)酵培養(yǎng)基中加1.5g/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為216.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為65.1%。實(shí)施例8:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸棒桿菌；在轉(zhuǎn)換溫度到37°C時(shí)，同時(shí)添加lg/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例7。放罐時(shí)，L-谷氨酸的產(chǎn)量為213.8g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為63.1%。實(shí)施例9:采用的菌株為溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌:谷氨酸黃色短桿菌；在轉(zhuǎn)換溫度到37°C時(shí)，同時(shí)添加1.5g/L的鹽酸鹽甜菜堿；其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例7。放罐時(shí),L-谷氨酸的產(chǎn)量為210.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61.4%。實(shí)施例1 9結(jié)果對(duì)比表(表2 )
權(quán)利要求
1.發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟: (1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基/L:葡萄糖 15g,玉米漿 20g, K2HP043g, MgS04.7H201g, VB1200 μ g/L，DL-蛋氨酸 50 μ g/L，F(xiàn)eSO4.7Η20、MnSO4.H2O 各 2mg/L，尿素 0.55 分消，ρΗ7.0 7.2，121°C滅菌 15min ； 方法:采用溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌，接種量為12% ;培養(yǎng)溫度32°C，160rpm，振蕩培養(yǎng)14 16h至對(duì)數(shù)期； (2)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基/L: 葡萄糖 20g,玉米衆(zhòng) 20g,鹽酸鹽甜菜堿 0.1 0.3g, K2HP047.5g, MgSO4.7H201.5g,VB1200 μ g/L, VH600 μ g/L, FeSO4.7H20、MnSO4.H2O 各 30mg/L,尿素 0.55 分消，ρΗ7.0 7.2，121°C 滅菌 15min ； 方法:按12%的接種 量將種子液接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基全自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制pH值7.0 7.2 ;分階段供氧模式控制溶氧:0 IOh為20%，10 32h為5% ;控制初始培養(yǎng)溫度為32°C ;當(dāng)相對(duì)生長(zhǎng)Λ OD = 0.3時(shí)此為發(fā)酵液稀釋20倍濃度在620nm處的OD值，轉(zhuǎn)換溫度到37°C，同時(shí)添加0.1 0.3g/L的鹽酸鹽甜菜堿；Λ OD = 0.6時(shí)，再次提高溫度到38°C繼續(xù)發(fā)酵至結(jié)束；通過(guò)流加80%的葡萄糖濃溶液將殘?zhí)强刂圃跒?.1 3g/L ;全過(guò)程流加液氨控制pH,發(fā)酵O 14h,pH為7.0 7.1，14 25h為7.2 7.3，25h至發(fā)酵結(jié)束為6.8，產(chǎn)酸值不再變化并有pH值上升時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)；發(fā)酵時(shí)間為30-32h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步驟(I)溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌為谷氨酸黃色短桿菌或谷氨酸棒桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步驟(I)溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌為谷氨酸黃色短桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步驟(2)添加的甜菜堿為鹽酸鹽甜菜堿、無(wú)水甜菜堿或一水甜菜堿中的一種或多種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步驟(2)添加的甜菜堿為鹽酸鹽甜菜堿。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備L-谷氨酸的方法。本發(fā)明在L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中采用溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌，并分期于培養(yǎng)基中添加不同的低濃度甜菜堿刺激細(xì)胞呼吸，提高菌體的氧消耗速率，抑制乳酸菌的積累，同時(shí)調(diào)節(jié)和控制發(fā)酵培養(yǎng)溫度，從而提高谷氨酸的產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率。由本發(fā)明方法制得的谷氨酸，不含磷的成分，可直接用于保健食品和醫(yī)藥行業(yè)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P13/14GK103243131SQ20131020430
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者馬興群, 劉雨, 宋琦, 呂麗娟 申請(qǐng)人:山東祥維斯生物科技有限公司