專利名稱：一種豬無機(jī)磷吸收關(guān)鍵的通道蛋白基因全長cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在仔豬小腸中表達(dá)的磷轉(zhuǎn)運通道蛋白基因及其核苷酸序列，即豬鈉依賴型憐轉(zhuǎn)運蛋白(sodium dependent phosphate cotransporter lib, NaP1-1Ib)的基因及其核苷酸序列，發(fā)明屬于動物營養(yǎng)生理學(xué)領(lǐng)域。其成果來源于國家自然基金面上項目“豬小腸NPT-1Ib調(diào)控蛋白的篩選與鑒定”(編號31172218)及“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(編號2011BAD26B03-2)”。
背景技術(shù)：
磷是動植物體內(nèi)的必需礦物元素，它不但是動物骨骼組織的有效成分，而且是其它軟組織和能量代謝過程中必不可少的成分，對代謝功能的正常發(fā)揮起著重要的作用。因此，動物必須從飼料中獲取足夠的磷，才能維持正常的生命和生產(chǎn)活動。特別是現(xiàn)代高產(chǎn)品種對磷營養(yǎng)十分敏感，若磷缺乏，即可導(dǎo)致動物生長緩慢甚至停滯，飼料轉(zhuǎn)化率降低。與此同時，作為一種非再生資源，磷在飼料工業(yè)中具有舉足輕重的地位，是繼蛋白質(zhì)和能量以外的第三種最昂貴的飼料原料。據(jù)統(tǒng)計，2012年全年我國配合飼料生產(chǎn)量達(dá)11790.2萬噸，按磷酸氫鈣添加量1.2%計，則年消耗量近218萬噸，所占原料費用達(dá)32.7億元，但與其形成鮮明對比的是，在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)，磷污染環(huán)境是非常嚴(yán)重的問題，已成為一個全球性的難題。例如，在歐洲一些地區(qū)(比利時、荷蘭和法國)動物排泄物所導(dǎo)致的P2O5量達(dá)500kg/ha/年；在我國，以養(yǎng)豬業(yè)為例，2012年生豬出欄量達(dá)7.14億頭，年豬糞尿排放量達(dá)3.14億噸，按排泄物中含磷1.0%計，僅養(yǎng)豬業(yè)一項，年向環(huán)境排放的磷量就達(dá)314萬噸之多，占整個養(yǎng)殖業(yè)磷排放量40%以上。而養(yǎng)殖業(yè)磷向外環(huán)境的過量排放所導(dǎo)致的水體富化、漁業(yè)受損、生態(tài)破壞及危害人類健康等系列問題日趨嚴(yán)重。因此，磷資源的合理、有效利用對解決因過量磷的排泄所導(dǎo)致的環(huán)境污染具有重要意義。畜禽從飼料中攝取磷(Pi)是通過專一的磷轉(zhuǎn)運通道來完成的，這也是畜禽對磷吸收及利用的關(guān)鍵步驟。對Pi轉(zhuǎn) 運通道蛋白的研究最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)在細(xì)菌、真菌、植物及哺乳動物中發(fā)現(xiàn)類似通道蛋白。目前研究表明，人及動物中，轉(zhuǎn)運通道蛋白對Pi的轉(zhuǎn)運過程存在與鈉離子協(xié)同的作用，即必需在鈉離子存在情況下，才能激活通道蛋白對Pi轉(zhuǎn)運的活性，故稱為鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運。大量的研究表明，小腸是磷吸收的一個重要位點，豬有超過70%的磷在小腸部位吸收。磷在動物腸道中的吸收分為兩種方式:受化學(xué)梯度控制的自由擴(kuò)散方式和鈉依賴性磷轉(zhuǎn)運的主動運輸方式，且后者為主要形式。目前已明確，主動運輸方式是由一類統(tǒng)稱為鈉依賴II型轉(zhuǎn)運蛋白所介導(dǎo)完成的，其中NaP1-1Ib轉(zhuǎn)運載體蛋白是發(fā)現(xiàn)的位于小腸刷狀緣膜頂膜，唯一參與腸道調(diào)節(jié)跨膜轉(zhuǎn)運的鈉依賴型載體蛋白?；蚯贸芯勘砻鳎c野生型小鼠比較，NaP1-1Ib基因敲除小鼠(nptZb+)鈉依賴型磷吸收活性降低90%以上。圍繞NaP1-1Ib載體轉(zhuǎn)運蛋白對磷的轉(zhuǎn)運、吸收和動態(tài)平衡的作用，開展了大量的研究，如不同磷水平對大鼠小腸中NaP1-1Ib載體轉(zhuǎn)運蛋白mRNA表達(dá)量和磷的吸收的影響，NaP1-1Ib基因缺失小鼠小腸各腸段(十二指腸、空腸、回腸)磷吸收率與野生型比較及人低磷血癥、遺傳性低血磷性佝僂病、小腸NaP1-1Ib基因的突變的檢測等，這些研究充分說明NaP1-1Ib載體蛋白作為一種關(guān)鍵的功能性蛋白調(diào)控著腸道中磷的轉(zhuǎn)運和吸收。目前，人類及鼠齒類動物研究進(jìn)展迅速，雖然在多種物種包括人類、小鼠、大鼠、雞、山羊中已分離得到鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)，但是豬NaP1-1Ib基因的克隆因為傳統(tǒng)實驗技術(shù)(比如cDNA文庫篩選技術(shù))實驗周期長、操作步驟繁瑣、費用較高及假陽性率高等原因，研究進(jìn)展相對較為緩慢。本發(fā)明所采用的豬NaP1-1Ib基因全長cDNA克隆方法具有周期短、操作步驟簡潔有效及費用低廉等優(yōu)勢，并且本發(fā)明所涉及到的豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)全長cDNA克隆分離國內(nèi)外尚屬首次。而豬NaP1-1Ib全長cDNA序列是蛋白功能學(xué)研究及單克隆抗體制備的必需步驟，也是探明Na-Pi轉(zhuǎn)運分子機(jī)制從而進(jìn)行豬低磷飼料品牌開發(fā)利用的基礎(chǔ)，因此，本發(fā)明具有重大的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種豬無機(jī)磷吸收關(guān)鍵的通道蛋白基因全長cDNA序列。在本發(fā)明中，“分離的” cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市場出售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等，在產(chǎn)生本發(fā)明的豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)基因時，可以將NaP1-1Ib基因編碼序列可操作的連接于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成NaP1-1Ib基因的表達(dá)載體。如本文所用，“可操作的連接于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA 就是可操作的連接于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作的連接于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作的連接于編碼序列。一般，“可操作的連接于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的豬NaP1-1Ib基因全長cDNA序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出來的片段按正確次序拼接在一起。獲得有關(guān)序列后，用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從擴(kuò)增后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明豬NaP1-1Ib基因的核苷酸序列。然后，可將該核苷酸序列引入本領(lǐng)域中現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。本發(fā)明涉及到的豬無機(jī)磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)核心區(qū)域cDNA片段的克隆、5’端cDNA片段的克隆(5’RACE)、3’端cDNA片段的克隆(3’RACE)、全長cDNA片段的克隆方法以及基本的DNA重組技術(shù)等具體實驗方法可參見《分子克隆》(Sambrook等，1989^P《5’RACESystm for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0)) (Gibcobrl InstructionManual),所涉及到的豬小腸中編碼NaP1-1Ib的核苷酸片段的序列及相關(guān)的多肽已在序列表中列出，其中:SEQ ID N01:編碼豬NaP1-1Ib cDNA的全長核苷酸序列。SEQ ID N02:編碼豬NaP1-1Ib cDNA開放閱讀框架的一段核苷酸序列。SEQ ID N03:對應(yīng)于SEQ ID N02中核苷酸序列的氨基酸序列。SEQ ID N04:對應(yīng)于RT-PCR中編碼豬NaP1-1Ib核心區(qū)域的上游特異性引物Pl核苷酸序列。SEQ ID N05:對應(yīng)于RT-PCR中編碼豬NaP1-1Ib核心區(qū)域的上游特異性引物P2核苷酸序列。SEQ ID N06:對應(yīng)于3 ’ RACE特異弓I物GSP-2核苷酸序列。SEQ ID N07:對應(yīng)于5’ RACE特異引物GSP-1核苷酸序列。
具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述。實施例1、豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)基因的克隆1、組織分離(isolation)試驗用仔豬為I 3 日齡三元雜交“DurocXLandraceXYorkshire”購自湖南省百宜飼料有限公司種豬場。隨機(jī)選取6頭，頸部放血致死后立即采集豬小腸不同腸段組織樣品，液氮冷凍后，置于_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、總 RNA 的分離(total RNA isolation)和檢測總RNA提取參照Invitrogen公司試劑盒介紹的方法進(jìn)行。步驟如下:取50 IOOmg組織轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的碾缽中，碾磨組織。加入適量Trizol試劑,4° C離心(12000gX IOmin),棄去細(xì)胞碎片,保留上清液。向上清液中加入0.2mI氯仿,強(qiáng)烈振蕩離心管15s,冰浴5min。4。C離心(12000gX IOmin),轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中。力口入0.5ml異丙醇，將離心管中液體輕輕混勻，冰上靜置IOmin以沉淀RNA。4° C離心(12000gX IOmin)。棄上清，RNA沉管底。加入ImL預(yù)冷的75%乙醇以洗滌RNA，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4° C離心(12000g5min，盡量棄上清)。室溫晾干或真空干燥5 lOmin。加入25 μ L的無核酸酶DEPC水溶解。測定RNA濃度，并用無核酸酶的水調(diào)至0.25 μ g.μ Γ1分裝，-80° C儲存。檢測1^純度，0026(|/0028(|值應(yīng)在1.8 2.2之間。所提RNA 1%的瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察條帶數(shù)目和亮度檢測RNA完整性。3、基因的全長克隆(Cloning of full-length cDNA)進(jìn)行cDNA全長克隆，分五個階段進(jìn)行:( I) RT-PCRRT-PCR參照TakaRa RNA PCR kit試劑盒介紹的方法進(jìn)行。流程為:先進(jìn)行RT反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組分為:RNA0.5 μ L、MgS042 μ L、2 X Bca Buffer5 μ L、Rnase Free ddH200.75 μ L> dNTP Mixture0.5 μ L> Rnase Inhibitor0.25 μ L> BcaBST Polymerase0.5 μ L>Random 9 mers0.5μ L。RT 條件為:65。C lmin, 30° C 5min,隨之在 15 30min 內(nèi)勻速升溫至65° C，65° C條件下15 30min，98° C 5min, 5° C 5min ;隨之進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)液組分為:25mM MgS043 μ L、5XBca 2nd Buffer8 μ L、Bca_Optimized Taq0.25 μ L、上游特異性引物Pl 0.5yL、下游特異性引物P2 0.5 μ LdH2027.75 μ L0 PCR擴(kuò)增條件為:94° C 預(yù)變性 30s，60° C 退火 30s, 68° C 30s, 72° C 延伸 45s，循環(huán) 25 次，72° C 延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳回收，以凝膠回收試劑盒純化目的片段，純化后產(chǎn)物經(jīng)大連寶生物公司測序。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA按照Clontech公司提供的RACE試劑盒的操作流程，首先制備5 ' -RACE-ReadycDNA 及 3 ' -RACE-Ready cDNA。5 ' -RACE 模板 cDNA 過程為:取 0.5mLEppendorf 管，加入 1.5yL 豬小腸總 RNA、lyL 5' -CDS 引物、I μ L SMART II oligo 引物(IOmM)，加入Tricine-EDTA緩沖液使終體積到5 μ L,混勻，于70° C加熱2min,冰浴2min,離心后加入2 μ L5 倍 First-Strand bufferU μ L DTT (20mM)、I μ L dNTP (IOmM)和 IyL PowerScriptReverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/L),隨后用小槍頭輕輕吹打混勻，短暫離心使成份聚集管底， 反轉(zhuǎn)錄于42° C 1.5h，加入100 μ LTricine-EDTA緩沖液，于72° C加熱7min終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，凍存于-20保存。5' -RACE模板cDNA與之相似，不同點在于3' -RACE-Ready cDNA 中加入 1.5 μ L RNA 及 I μ L3' -CDS primer 混合滅菌水至 5 μ L。(3)3' RACE采用3 ' RACE特異引物GSP-2和試劑盒自帶的UPM (Universal Primer AMix，Long序列擴(kuò)增3'端，以步驟(2)合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:3' RACE-ReadycDNA 2.5 μ L, 10XUMP5 μ L, 3，GSP_2 (10 μ M) I μ L, Master Mix41.5μ L,總體積50 μ L。將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍，然后用引物GSP-2和試劑盒自帶的NUP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對目的條帶進(jìn)行凝膠回收純化。純化后的產(chǎn)物與PMD18T連接，測序。3' RACE首次RCR反應(yīng)條件為:94° C預(yù)變性30s，94° C退火30s，68° C30s，72° C延伸3min，循環(huán)25次。第二次PCR循環(huán)為20次，其它條件不變。(4)5' RACE使用特異引物GSP-1和通用引物UPM，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)±曾，反應(yīng)體系如下:5 ' RACE-Ready cDNA 2.5 μ L，dNTP 混合物(IOmM) I μ L, 10XPCR 緩沖液
5μ L, UPM5μ L, GSP-1I μ L, PowerScript Reverse Transcriptase(5U/μ L)I μ L, PCR-GradeH2O 34.5 μ L,混勻。PCR 反應(yīng)條件為:94° C 變性 3min，94C 退火 lmin, 62° C lmin, 72。C延伸5min，循環(huán)30次；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。第二輪5' RACE過程如下:將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍作模板，使用GSP-1和通用引物NUP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:5' RACE-Ready cDNA 2.5μ L，反應(yīng)條件為:94。C變性30s，72° C退火30s, 72° C延伸3min，循環(huán)15次；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(5)目的片段的回收與克隆測序按10:1的摩爾比(PCR產(chǎn)物:載體)采用TaKaRa公司快速連接試劑盒進(jìn)行連接。取連接液10 μ L加入200 μ L DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42° C水浴放置90s，取出后立即冰浴2min，加入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基800 μ L置37° C搖床振搖2h，取200° C菌液用滅菌的彎頭玻棒均勻涂布于LB平板固體培養(yǎng)基表面(含氨芐青霉素IOOmg/L)，37° C倒置平板孵育過夜。
RACE產(chǎn)物與pMD18_T載體連接反應(yīng)體系為:2 X連接緩沖液5 μ L，載體(50ng)lμL，RACE產(chǎn)物2μL，T4DNA連接酶lyL，滅菌水I μ L。將培養(yǎng)液涂布于加入氨芐/IPTG/X-gal的LB培養(yǎng)基平板，藍(lán)白斑篩選，挑取單菌落過夜后PCR檢測。反應(yīng)體系為:菌液 I P L, PCRbuffer2.5 μ L, dNTP(2.5mM)2 μ L, T7primer0.5 μ L, SP6primer0.5μ L,滅菌水 18μ L。反應(yīng)條件為:94° C 變性 5min，94C 退火 30s, 62° C lmin, 68° C30s, 72° Clmin, 72° C 延伸 lOmin，循環(huán) 30 次。根據(jù)已獲得保守區(qū)片段的序列及3' RACE和5' RACE所得序列，利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列拼接得到全長cDNA。實施例2、豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)基因的序列信息與同源性分析:本發(fā)明新的豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)基因全長cDNA的長度為2571bp，詳細(xì)序列見表1，其中豬NaP1-1Ib基因全長cDNA序列由2571bp核苷酸組成，有一個完整的2016bp開放閱 讀框，編碼相對應(yīng)的671個氨基酸，包含157bp5’ -UTR區(qū)和398bp的3，-UTR 區(qū)。應(yīng)用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundantGenbank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)基因(GenBank AccessionN0.NM_001177999.1)在核苷酸水平上有81%的相同性，可以認(rèn)為兩者在功能上有很高相似性。
權(quán)利要求
1.一種獲得編碼豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib)全長CDNA的核苷酸片段的方法，包括:(a)NaP1-1Ib核心區(qū)段cDNA、5’端cDNA、3’端cDNA以及全長cDNA的克隆方法； (b)NaP1-1Ib核心區(qū)段cDNA、5’端cDNA、3’端cDNA以及全長cDNA的克隆的序列測定方法； (c)NaP1-1Ib核心區(qū)段cDNA、5’端cDNA以及3’端cDNA BLAST同源性分析以確定NaP1-1Ib的方法。
2.一種分離純化的編碼豬鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白(NaP1-1Ib) cDNA的核苷酸片段，包括: (a)編碼氨基酸序列的核苷酸片段，其特征是具有SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示的序列； (b)與(a)互 補(bǔ)的核苷酸片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬無機(jī)磷吸收關(guān)鍵的通道蛋白基因全長cDNA序列克隆方法。該基因從仔豬小腸中分離得到，全長cDNA長度為2571bp，其中開放閱讀框位于158-2173位核苷酸，詳細(xì)序列如表1。鈉依賴型磷轉(zhuǎn)運蛋白NaPi-IIb被認(rèn)為是動物小腸中調(diào)控?zé)o機(jī)磷吸收最關(guān)鍵的通道蛋白，因此該基因全長序列的克隆在提高豬對無機(jī)磷吸收利用效率及低磷飼料開發(fā)應(yīng)用方面具有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/10GK103233000SQ20131020152
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月27日
發(fā)明者方熱軍, 項智鋒 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)