專利名稱：人rtn4b蛋白和編碼序列,及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人RTN4B的cDNA序列，該蛋白是人RTN家族的成員RTN4的一個(gè)異構(gòu)體。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，尤其在檢測(cè)肝癌的方法和試劑盒。
RTN家族是一個(gè)近年來所發(fā)現(xiàn)的新的基因家族。其中神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白NSP(neuroendocrine-specific protein)后被統(tǒng)一命名為RTN1，是該家族的第一個(gè)成員。RTN1具有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別長3.4Kb,2.3Kb和1.8Kb。其相應(yīng)的cDNA NSPA、NSPB、NSPC(分別編碼長度為776、356、208個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))已相繼被分離出。同樣的，RTN1基因的基因組結(jié)構(gòu)也被闡明。三個(gè)RTN1/NSP蛋白質(zhì)異構(gòu)體擁有各自獨(dú)有的氨基末端，但有相同的羧基末端。實(shí)驗(yàn)已證明這三種轉(zhuǎn)錄本的存在可能不是由于外顯子的變異剪接所造成的，而是因?yàn)榇嬖谥鄠€(gè)啟動(dòng)子。RTN1/NSP的共同羧基末端帶有2個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)域，實(shí)驗(yàn)表明它們?cè)诼?lián)系蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中扮演著重要的角色。
根據(jù)NSP基因組序列、cDNA序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫比較，發(fā)現(xiàn)了另外三個(gè)人RTN家族成員(NSP類基因Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。其中兩個(gè)(NSP-like基因Ⅰ,Ⅱ)相繼被克隆，并被命名為RTN2和RTN3。RTN2同樣有三個(gè)C-末端相同的異構(gòu)體。但RTN3至今沒有發(fā)現(xiàn)變異剪接本。值得注意的是，RTN2和RTN3的C-末端也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)立的穿膜區(qū)域，這被認(rèn)為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聯(lián)系相關(guān)。
至今，RTN家族的功能仍不十分清晰。但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)RTN1/NSP異構(gòu)體可作為區(qū)別小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-SCLC)的獨(dú)立標(biāo)志物。NSPA在SCLC腫瘤細(xì)胞中存在，而non-SCLC腫瘤中不存在。通過以NSP異構(gòu)體為標(biāo)志物，還可區(qū)別一般non-SCLC腫瘤和有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的non-SCLC。
RTN4是人RTN家族中新近發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)成員。它類似于RTN1和RTN2，同樣有C-末端相同的三個(gè)異構(gòu)體(即RTN4A,4B,4C)。RTN4異構(gòu)體與RTN1/NSP,RTN2,RTN3異構(gòu)體一樣有著共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。這預(yù)示著它如RTN1一樣，在聯(lián)系蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中扮演了重要的角色。RTN4與人其他RTN的N-端無明顯的同源性(＜40％)，但是這些區(qū)域具有與RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)富含堿性氨基酸殘基，脯氨酸和絲氨酸。此外，在這些區(qū)域中還發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白磷酸化位點(diǎn)。并且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)體內(nèi)RTN1A和RTN1B確實(shí)是被磷酸化的。RTN4A,4B,4C的理論等電點(diǎn)分別是4.43，4.71和9.32，這與RTN1,RTN2預(yù)計(jì)的等電點(diǎn)基本相似。RH定位實(shí)驗(yàn)揭示RTN4位于標(biāo)記物D2S1786和D2S2002之間，距離D2S1786有72.9cR值。
肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康和壽命的疾病。然而，目前還缺乏有效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)肝癌的方法和試劑盒本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼人RTN家族的成員RTN4的一個(gè)異構(gòu)體，本發(fā)明的RTN4的異構(gòu)體被命名為人RTN4B。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人的RTN家族成員，該蛋白被命名為人RTN4B蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的RTN4B多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的RTN4核酸序列和多肽的應(yīng)用，尤其在肝癌檢測(cè)方面的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肝癌的試劑盒。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO:4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人RTN4B蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人RTN4B蛋白活性的多肽的方法，該方法包括
(a)將編碼具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人RTN4B蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人RTN4B蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人RTN4B蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人RTN4B蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測(cè)肝細(xì)胞是否發(fā)生癌變的方法，該方法包括檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白，存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白就表明該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法是通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B蛋白，它包括步驟將肝癌細(xì)胞樣品與抗RTN4B的特異性抗體接觸；檢測(cè)是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
在另一實(shí)施例中，該方法是通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本，它包括步驟用RTN4B特異性引物，用RT-PCR法擴(kuò)增該肝細(xì)胞的mRNA；檢測(cè)是否有預(yù)計(jì)RTN4B擴(kuò)增產(chǎn)物，存在擴(kuò)增產(chǎn)物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
在另一實(shí)施例中，該方法是通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本，它包括步驟用RTN4B特異性探針，與該肝細(xì)胞的cDNA樣品雜交；檢測(cè)是否有雜交產(chǎn)物，存在雜交產(chǎn)物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，它含有(1)特異性擴(kuò)增人RTN4B的引物對(duì)，(2)任選的逆轉(zhuǎn)錄mRNA所需的試劑。另一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，含有針對(duì)人RTN4B的特異性的抗體。另一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，含有可特異性地與人RTN4B的mRNA雜交的探針。
在本發(fā)明的分離出的人RTN4B多核苷酸全長為781個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO:3，其中開放讀框位于5-1126位核苷酸。編碼的人RTN4B蛋白全長為373個(gè)氨基酸，序列見SEQ ID NO:4。通過研究，本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，RTN4B蛋白在正常的肝細(xì)胞中是不表達(dá)的，但是在癌變的肝細(xì)胞中RTN4B卻表達(dá)。在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人RTN4B蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3中5-1126位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO:3序列的編碼框5-1126位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO:3中5-1126位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO:4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人RTN4B相同功能的蛋白的、SEQ ID NO:4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5＇和/或3＇端添加數(shù)個(gè)核苷酸。本發(fā)明的編碼序列可以是DNA或RNA，可以是單鏈或雙鏈。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人RTN4B蛋白多肽”指具有人RTN4B蛋白活性的SEQ IDNO:4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人RTN4B相同功能的、SEQ ID NO:4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人RTN4B DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人RTN4B多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人RTN4B蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人RTN4B多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人RTN4B保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人RTN4B多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人RTN4B的表達(dá)。例如用于抑制肝癌細(xì)胞中RTN4B的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人RTN4B多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人RTN4B的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人RTN4B核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人RTN4B多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
由于在肝細(xì)胞中，RTN4B的表達(dá)是肝細(xì)胞發(fā)生癌變的標(biāo)志，因此可以通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否有RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白來確定肝細(xì)胞是否發(fā)生了癌變。
在知曉了某基因與某疾病的相關(guān)性，本領(lǐng)域有許多現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)可供使用，不同點(diǎn)僅在于所用的引物和/或探針具有衍生自RTN4B的核苷酸序列，或者所用的抗體是對(duì)RTN4B蛋白特異性的抗體。
作為例舉，一種檢測(cè)肝細(xì)胞是否發(fā)生癌變的方法，包括檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白，存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白就表明該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。具體地，(1)當(dāng)通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B蛋白，通常包括步驟將肝癌細(xì)胞樣品與抗RTN4B的特異性抗體接觸；檢測(cè)是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。(2)當(dāng)通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本時(shí)，它通常包括步驟用RTN4B特異性引物，用RT-PCR法擴(kuò)增該肝細(xì)胞的mRNA；檢測(cè)是否有預(yù)計(jì)RTN4B擴(kuò)增產(chǎn)物，存在擴(kuò)增產(chǎn)物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變(PCR擴(kuò)增法)?；蛘撸ú襟E用RTN4B特異性探針，與該肝細(xì)胞的cDNA樣品雜交，檢測(cè)是否有雜交產(chǎn)物，存在雜交產(chǎn)物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變(雜交法)。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人RTN4B DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人RTN4B基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人RTN4B基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人RTN4B蛋白的分子，也包括那些并不影響人RTN4B蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人RTN4B基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人RTN4B基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人RTN4B或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immuno1.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人RTN4B功能的抗體以及不影響人RTN4B功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人RTN4B基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人RTN4B基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人RTN4B核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WHFreeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City,CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對(duì)于該技術(shù)，可參見Verma等人,Human Chromosomes:A Manual ofBasic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與RTN4B發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人RTN4B蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人RTN4B蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人RTN4B蛋白多肽被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
在本發(fā)明中，人RTN4B的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人體肝組織的cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物—A:5＇-AGCCATGGAAGACCTGGACCAG-3＇為正向引物，寡核苷酸B:5＇-GTCAAGGTTCGTTCTTCCCTGAC-3′為反向引物，進(jìn)行PCR，順利有效擴(kuò)增約1400bp片段。再設(shè)計(jì)雙向引物，擴(kuò)增測(cè)序，我們獲得了一個(gè)1216bp長度的cDNA順序，見SEQID NO:3的全長cDNA序列。
實(shí)驗(yàn)證明，RTN4B基因的轉(zhuǎn)錄本只在肝癌組織中被檢測(cè)到，而在癌旁組織中無表達(dá)。這說明了RTN4B是一種肝癌組織中特異表達(dá)的基因，從而為檢測(cè)人肝是否發(fā)生癌變提供了一種可行而有效的標(biāo)志物。
此外，由于本發(fā)明的人RTN4B具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人RTN4與RTN2、RTN3、NSP蛋白的C末端的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸用黑色陰影標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人RTN4B的cDNA序列的克隆和測(cè)定1．引物擴(kuò)增以人體肝組織的cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物—A:5′-AGCCATGGAAGACCTGGACCAG-3′(SEQ ID NO:1)為正向引物，寡核苷酸B:5′-GTCAAGGTTCGTTCTTCCCTGAC-3′(SEQ ID NO:2)為反向引物，進(jìn)行PCR，順利有效擴(kuò)增約1400bp片段。
2．PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物AB與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1216bp，詳細(xì)序列見SEQID NO:3，其中開放讀框位于5-1126位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人RTN4B的氨基酸序列，共373個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)。
MEDLDQSPLV SSSDSPPRPQ PAFKYQFVRE PEDEEEEEEE EEEDEDEDLE 50ELEVLERKPA AGLSAAPVPT APAAGAPLMD FGNDFVPPAP RGPLPAAPPV 100APERQPSQDP SPVSSTVPAP SPLSAAAVSP SKLPEDDEPP ARPPPPPPAS 150VSPQAEPVWT PPAPAPAAPP STPAAPKRRG SSGSVVVDLL YWRDIKKTGV 200VFGASLFLLL SLTVFSIVSV TAYIALALLS VTISFRIYKG VIQAIQKSDE 250GHPFRAYLES EVAISEELVQ KYSNSALGHV NCTIKELRRL FLVDDLVDSL 300KFAVLMWVFT YVGALFNGLT LLILALISLF SVPVIYERHQ AQIDHYLGLA 350NKNVKDAMAK IQAKIPGLKR KAE 373373個(gè)氨基酸(不包括終止密碼子)實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人RTN4B的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同源蛋白比較支持序列比較的正確，在氨基酸水平上RTN4B推導(dǎo)蛋白的C-末端與NSPC,RTN2,RTN3均有較高的同源性，其186-373氨基酸與NSPC,RTN2,RTN3等同一率分別達(dá)到66％,50％和60％，相似率分別達(dá)82％,70％和80％(圖1)。同時(shí)在PRODOM軟件分析后，在RTN4B的C-末端還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)獨(dú)立的穿膜區(qū)域，分別是119-235位氨基酸GVVFGASLFLLLSLTVFSIVSVTAYIALALLSVTISF，和302-336位氨基酸FAVLMWVFTYVGALFNGLTLLILALISLFSVPVIY，表明該蛋白在聯(lián)系蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中扮演著重要的角色。這種特性在RTN家族其他成員中也存在。但RTN4B與人其他RTN的N-端無明顯的同源性(＜40％)。但是這些區(qū)域具有與RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)富含堿性氨基酸殘基，脯氨酸和絲氨酸。此外，在這些區(qū)域中還發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白磷酸化位點(diǎn)。
本發(fā)明的人RTN4B除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人RTN4B還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人RTN4B的N端與鼠的RTN4B的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
本發(fā)明的人RTN4B還可用于篩選抑制本發(fā)明蛋白活性的拮抗劑、或增強(qiáng)本發(fā)明蛋白活性的激動(dòng)劑等。
針對(duì)本發(fā)明人RTN4B的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人RTN4B核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人RTN4B的表達(dá)水平或者抑制人RTN4B的過度表達(dá)。本發(fā)明的人RTN4B蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人RTN4B缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人RTN4在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人RTN4B的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人RTN4B cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5＇寡核苷酸引物序列為5＇-GACTGGATCCATGGAAGACCTGGACCAGT-3′(SEQ ID NO:5)，該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人RTN4B編碼序列的19個(gè)核苷酸；3＇端引物序列為5＇-TTGGAAGCTT TCATTCAGCTTTGCGCTTC-3＇(SEQ ID NO:6)，該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人RTN4B的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4,其表達(dá)lacⅠ阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人RTN4B的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g,20分鐘)。超聲裂解培養(yǎng)物，收集細(xì)胞裂解液并將其稀釋于6M鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人RTN4B。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人RTN4B。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小(Mr)約為40318。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO:4的序列一致。
實(shí)施例4人RTN4B在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人RTN4B的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人RTN4B cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5＇寡核苷酸引物序列為5＇-TCAGAAGCTT ATGGAAGACCTGGACCAGT-3＇(SEQ ID NO:7)該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人RTN4B編碼序列的19個(gè)核苷酸；3＇端引物序列為5＇-TTGGGGATCC TCATTCAGCTTTGCGCTTC-3＇(SEQ ID NO:8)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人RTN4B的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人RTN4B的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris.HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris.HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris.HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小(Mr)約為40318。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO:4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人RTN4B基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
實(shí)施例6RTN4B在正常人組織中的表達(dá)譜分析多種組織Northern(MTNTM)印跡膜(16種組織)購自Clontech公司，以引物A1(5＇-CGAACCTTGACGTTGCAGTGCAG-3′)和A2(5＇-GAAAACAGATGGTAGTGCTCCTAG-3＇)從人骨骼肌cDNA文庫(Clontech)中擴(kuò)增得到618bp的片段，以此片段為探針，用α-32p-dATP(DuPont公司)對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記，條件為37℃1小時(shí)，具體操作見MegaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)說明書(Amersham)。Northern雜交按用戶手冊(cè)操作。主要步驟如下(1)配制MTN雜交液(終濃度如下5XSSPE,10Xdenhardt′s,100μg/mlCTDNA,50％甲酰胺，2％SDS),68℃預(yù)熱雜交液，徹底溶解沉淀物。(2)燙膜，倒入少許燒開的0.05％SDS溶液于膜上，震蕩、冷卻后測(cè)信號(hào)(3)將尼龍膜放在雜交管中，加入預(yù)雜交液，42℃預(yù)雜交12小時(shí)(4)變性后探針加入雜交管中，42℃雜交24小時(shí)(5)洗膜，42℃，用2XSSC,0.05％SDS溶液洗兩次，每次20分鐘(6)用X光片進(jìn)行放射自顯影。
結(jié)果16種組織的Northern雜交結(jié)果顯示出三條雜交帶，長分別為5.0kb,2.5kb和1.8kb，對(duì)應(yīng)與分別是RTN4A,RTN4B和RTN4C。RTN4B基因?yàn)閺V譜表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，在胸腺、前列腺、胎盤、卵巢、小腸、大腸、外周血白細(xì)胞、胎盤、肺、骨骼肌、腎及等15種組織中均有表達(dá)，表達(dá)量稍有差異。值得注意的是，RTN4B在肝組織中未見有表達(dá)。
RTN4A的表達(dá)非常有限，只在腦中被檢測(cè)到，在睪丸中表達(dá)極低。
RTN4C在16種組織中的4種中有表達(dá)，分別是腦、肝、骨骼肌和腎，表達(dá)量在骨骼肌中最高，肝中最少。
實(shí)施例7RTN4B在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況分析(1)．選取13種人腫瘤細(xì)胞株，分別是
A375(細(xì)胞色素瘤細(xì)胞)，BEL7402(肝癌細(xì)胞)，CNE(鼻咽癌細(xì)胞)，DAMI(單核細(xì)胞)，HEPB3(肝癌細(xì)胞)，K562(紅白血病細(xì)胞)，L-02(變異肝細(xì)胞)，SH-77(小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，LTEPA2(肺腺癌細(xì)胞)，NCIH446(小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，NCIH460(大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，RAJI(淋巴癌細(xì)胞)，T24(膀胱癌細(xì)胞)培養(yǎng)細(xì)胞在含10％小牛血清和5％CO2的培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)(培養(yǎng)液RPMI1640(LifeTechnologies)配方如下25mM HEPES,2mM L-glutamine,16mM NaHCO3),培養(yǎng)至匯片80％時(shí)傳代。
(2)抽提RNA方法如下(采用LIFE TECHNOLOGIES公司的TRIZOL試劑)細(xì)胞株勻化加1mlTRIZOL試劑(每10cm2培養(yǎng)皿面積加1mlTRIZOL)在培養(yǎng)皿中直接溶解細(xì)胞株。
分相20℃培養(yǎng)勻化好的樣品5分鐘。每1ml的TRIZOL試劑加入0.2ml的氯仿，震蕩且溫浴2至3分鐘，后在2-8℃，少于10,000xg離心15分鐘。RNA此時(shí)位于水相。
RNA沉淀轉(zhuǎn)移水相至一新管，通過混合異丙醇(每1ml的TRIZOl用0.5ml)使RNA從水相中沉淀下來，再在15-30℃溫浴10分鐘，后在2-8℃，少于10,000xg離心10分鐘。RNA沉淀于管底。
洗滌RNA用75％的乙醇(每1mlTROZOL至少加1ml的乙醇)洗滌一次，混合后在2-8℃，少于7,500xg離心5分鐘。
重新溶解RNA空氣干燥RNA，用0.5％SDS溶液溶解RNA，然后在55-60℃溫浴10分鐘。
(3)Northern雜交方法與探針與實(shí)施例6一樣。
13種腫瘤細(xì)胞株的Northern雜交結(jié)果顯示RTN4B基因?yàn)樵诟鞣N癌細(xì)胞株中的廣譜表達(dá)基因，在細(xì)胞色素瘤、肝癌、鼻咽癌、單核細(xì)胞、紅白血病、變異肝、小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、淋巴癌、膀胱癌等13種細(xì)胞株中均有表達(dá)，表達(dá)量稍有差異。但比較在人正常組織和腫瘤細(xì)胞株中RTN4B的表達(dá)情況，可見明顯的差異。在正常人的肝中只檢測(cè)到1.8kb的轉(zhuǎn)錄本，而在BEL7402和L-02細(xì)胞株中同時(shí)檢測(cè)到1.8和2.5kb的轉(zhuǎn)錄本，在HepG2中只檢測(cè)到2.5kb的片段。
實(shí)施例8RTN4B在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分析組織總RNA的抽提勻化組織每50-100mg組織加1ml TRIZOL試劑，用玻璃勻漿器勻化組織。
以下方法和步驟與實(shí)施例7中抽提RNA相同。
Northern雜交方法與探針與實(shí)施例6一樣。不同點(diǎn)僅在于其組織的種類及其RNA的抽提過程與實(shí)施例6不同。
結(jié)果肝癌組織和癌旁組織的Northern雜交結(jié)果顯示RTN4B基因的轉(zhuǎn)錄本只在肝癌組織中被檢測(cè)到，而在癌旁組織中無表達(dá)。這說明了RTN4B是一種肝癌組織中特異表達(dá)的基因，從而為檢測(cè)人肝是否發(fā)生癌變提供了一種可行而有效的標(biāo)志物。
實(shí)施例9試劑盒的制備試劑盒1它含有(1)特異性擴(kuò)增人RTN4B的引物對(duì)，和使用說明。該試劑盒還可含有或不含有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自SEQ ID NO:3的序列，長度為15-35。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測(cè)樣品中是否含有RTN4B的核酸序列。該試劑盒還可含有進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的其他試劑，例如緩沖液等。
此外，較佳地，至少一個(gè)所用的引物跨越了兩個(gè)外顯子，因?yàn)榇藭r(shí)對(duì)應(yīng)于RTN4B的基因組序列將不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
試劑盒2該試劑盒含有針對(duì)人RTN4B的特異性的抗體(例如實(shí)施例5中制備的多克隆抗體，或者用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗RTN4B的單克隆抗體)，和使用說明。該試劑盒用于直接檢測(cè)樣品中是否存在RTN4B蛋白。先通過特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用常規(guī)技術(shù)檢測(cè)免疫復(fù)合物。
試劑盒3該試劑盒含有可特異性地與人RTN4B的mRNA雜交的探針。它還可含有或不含有雜交緩沖液。該試劑盒通過核酸分子與RTN4B特異性探針之間的雜交反應(yīng)來檢測(cè)樣品中是否存在RTN4B的核酸分子。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱人RTN4B蛋白和編碼序列，及其制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AGCCATGGAA GACCTGGACC AG 22(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅱ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2GTCAAGGTTC GTTCTTCCCT GAC 23(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1216bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3AGCCATGGAA GACCTGGACC AGTCTCCTCT GGTCTCGTCC TCGGACAGCC CACCCCGGCC 60GCAGCCCGCG TTCAAGTACC AGTTCGTGAG GGAGCCCGAG GACGAGGAGG AAGAAGAGGA 120GGAGGAAGAG GAGGACGAGG ACGAAGACCT GGAGGAGCTG GAGGTGCTGG AGAGGAAGCC 180CGCCGCCGGG CTGTCCGCGG CCCCAGTGCC CACCGCCCCT GCCGCCGGCG CGCCCCTGAT 240GGACTTCGGA AATGACTTCG TGCCGCCGGC GCCCCGGGGA CCCCTGCCGG CCGCTCCCCC 300CGTCGCCCCG GAGCGGCAGC CGTCTTGGGA CCCGAGCCCG GTGTCGTCGA CCGTGCCCGC 360GCCATCCCCG CTGTCTGCTG CCGCAGTCTC GCCCTCCAAG CTCCCTGAGG ACGACGAGCC 420TCCGGCCCGG CCTCCCCCTC CTCCCCCGGC CAGCGTGAGC CCCCAGGCAG AGCCCGTGTG 480GACCCCGCCA GCCCCGGCTC CCGCCGCGCC CCCCTCCACC CCGGCCGCGC CCAAGCGCAG 540GGGCTCCTCG GGCTCAGTGG TTGTTGACCT CCTGTACTGG AGAGACATTA AGAAGACTGG 600AGTGGTGTTT GGTGCCAGCC TATTCCTGCT GCTTTCATTG ACAGTATTCA GCATTGTGAG 660CGTAACAGCC TACATTGCCT TGGCCCTGCT CTCTGTGACC ATCAGCTTTA GGATATACAA 720GGGTGTGATC CAAGCTATCC AGAAATCAGA TGAAGGCCAC CCATTCAGGG CATATCTGGA 780ATCTGAAGTT GCTATATCTG AGGAGTTGGT TCAGAAGTAC AGTAATTCTG CTCTTGGTCA 840TGTGAACTGC ACGATAAAGG AACTCAGGCG CCTCTTCTTA GTTGATGATT TAGTTGATTC 900TCTGAAGTTT GCAGTGTTGA TGTGGGTATT TACCTATGTT GGTGCCTTGT TTAATGGTCT 960GACACTACTG ATTTTGGCTC TCATTTCACT CTTCAGTGTT CCTGTTATTT ATGAACGGCA 1020TCAGGCACAG ATAGATCATT ATCTAGGACT TGCAAATAAG AATGTTAAAG ATGCTATGGC 1080TAAAATCCAA GCAAAAATCC CTGGATTGAA GCGCAAAGCT GAATGAAAAC GCCCAAAATA 1140ATTAGTAGGA GTTCATCTTT AAAGGGGATA TTCATTTGAT TATACGGGGG AGGGTCAGGG 1200AAGAACGAAC CTTGAC 1216(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度373個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser 15Pro Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu 30Pro Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 45Asp Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala 60Ala Gly Leu Ser Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly 75Ala Pro Leu Met Asp Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro 90Arg Gly Pro Leu Pro Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln 105Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro 120Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu 135Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser 150Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr Pro Pro Ala Pro Ala 165Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly 180Ser Ser Gly Ser Val Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile 195Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu 210Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala 225Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly 240Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg 255Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln 270Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys 285Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu 300Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu 315Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe 330Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His 345Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys 360Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu 373(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GACTGGATCC ATGGAAGACC TGGACCAGT 29(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTGGAAGCTT TCATTCAGCT TTGCGCTTC 29(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7TCAGAAGCTT ATGGAAGACC TGGACCAGT 29(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8TTGGGGATCC TCATTCAGCT TTGCGCTTC 29
權(quán)利要求
1．一種檢測(cè)肝細(xì)胞是否發(fā)生癌變的方法，其特征在于，該方法包括檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白，存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本或RTN4B蛋白就表明該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法是通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B蛋白，它包括步驟將肝癌細(xì)胞樣品與抗RTN4B的特異性抗體接觸；檢測(cè)是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法是通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本，它包括步驟用RTN4B特異性引物，用RT-PCR法擴(kuò)增該肝細(xì)胞的mRNA，檢測(cè)是否有預(yù)計(jì)RTN4B擴(kuò)增產(chǎn)物，存在擴(kuò)增產(chǎn)物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法是通過檢測(cè)肝細(xì)胞中是否存在RTN4B的轉(zhuǎn)錄本，它包括步驟用RTN4B特異性探針，與該肝細(xì)胞的cDNA樣品雜交，檢測(cè)是否有雜交產(chǎn)物，存在雜交產(chǎn)物就表示該肝細(xì)胞發(fā)生了癌變。
5．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ IDNO:4所示的序列。
6．一種分離的人RTN4B蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
7．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
8．一種用權(quán)利要求7所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9．一種產(chǎn)生具有人RTN4B蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人RTN4B蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO:3中從核苷酸5-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人RTN4B蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人RTN4B蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人RTN4B蛋白活性的多肽。
10．一種能與權(quán)利要求2所述的人RTN4B蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
11．一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
12．一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
13．一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有(1)特異性擴(kuò)增人RTN4B的引物對(duì)，(2)任選的逆轉(zhuǎn)錄mRNA的試劑。
14．一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有針對(duì)人RTN4B的特異性的抗體。
15．一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有可特異性地與人RTN4B的mRNA雜交的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了人RTN4B的cDNA序列,該蛋白是人RTN家族的成員RTN4的一個(gè)異構(gòu)體。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法,以及這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,尤其在檢測(cè)肝癌的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1311439SQ0011179
公開日2001年9月5日 申請(qǐng)日期2000年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)