專利名稱：一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番爺叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus, ToBSV),屬番爺叢矮病毒科、番爺叢矮病毒屬病毒。該病是我國對(duì)外重要的檢疫對(duì)象，也是進(jìn)境葡萄種苗等必需施檢的項(xiàng)目。病毒粒體為球狀，正20面多角休，直徑30nm，分散在細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)，有時(shí)呈晶體狀排列。致死溫度80 90°C 10分鐘。體外存活期為幾周。該病毒能侵染番茄、曼陀羅、葡萄、豇豆等20多個(gè)科，120多種植物。苗期染病5天后初顯環(huán)狀壞死斑，葉片褪綠且迅速落葉，該病在莖組織發(fā)展很快，苗期施用氮肥過多，造成莖變軟，在靠近地面處出現(xiàn)壞死斑，引起猝倒。系統(tǒng)癥狀為幼葉卷曲或頂部壞死，由此引致側(cè)芽增生或出現(xiàn)叢生。病株下部葉片褪綠和變紫。果實(shí)除產(chǎn)生褪綠斑以外，還在成熟果實(shí)上產(chǎn)生環(huán)狀或平行斑，使番茄矮縮或產(chǎn)生斑駁。ToBSV經(jīng)汁液傳毒。該病毒進(jìn)入寄主，必須在土壤積水的條件下。侵染方法尚未明確，但似乎可通過損傷的根細(xì)胞侵入。ToBSV不能被消化，即使通過人、畜的消化道也不能改變其傳染性，因此，有推斷認(rèn)為人 和動(dòng)物是該毒原傳播途徑之一。此外，ToBSV在河水中發(fā)現(xiàn)，污水和淤泥作為肥料時(shí)，有可能傳播該病毒。目前，番茄叢矮病毒檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道較少，主要以寄主癥狀、免疫電鏡技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)為主。電鏡技術(shù)設(shè)備昂貴，檢測(cè)靈敏度低；ELISA技術(shù)操作步驟繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性。未見采用半巢式-RT-Realtime PCR檢測(cè)ToBSV的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。所述試劑可由所述特異引物和特異探針組成；所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特異探針可為TaqMan探針。所述試劑可用于制備輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑盒，包括所述試劑。所述試劑可用于輔助鑒定蕃茄叢矮病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異弓I物對(duì)乙進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為78bp且PCR產(chǎn)物乙為99bp，待測(cè)病毒為候選的蕃茄叢矮病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)。本發(fā)明還保護(hù)另一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的蕃茄叢矮病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙均為陽性，待測(cè)病毒為候選的蕃爺叢矮病毒。所述待測(cè)病毒具體可為蕃茄叢矮病毒、藜草花葉病毒、番茄黑環(huán)病毒、草莓潛環(huán)斑病毒或桃叢簇花葉病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有蕃茄叢矮病毒的方法，包括如下步驟:(I)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有蕃茄叢矮病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙均為陽性，待測(cè)樣本含有蕃茄叢矮病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報(bào)告染料FAM，3’末端具體可連接有熒光淬滅染料TAMRA。不同的方法，靈敏度和準(zhǔn)確性差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差100倍以上，PCR凝膠電泳與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，由于引物的擴(kuò)增效率不一樣，靈敏度差異也可達(dá)到1000倍以上。在實(shí)際檢測(cè)鑒定工作中，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)常需要對(duì)一個(gè)結(jié)果進(jìn)行兩個(gè)以上的確認(rèn)試驗(yàn)，不同方法檢測(cè)靈敏度不一樣，很難保證兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果完全一樣，這就為結(jié)果的判斷增加了難度，特別是在檢測(cè)目標(biāo)含量極少的情況下，這種難度就會(huì)進(jìn)一步加大。若兩套方法檢測(cè)靈敏度一樣或非常接近，這個(gè)難題就迎刃而解。
實(shí)時(shí)熒光PCR (Realtime-PCR)檢測(cè)技術(shù)是國際最近十余年發(fā)展起來的高新檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)將PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來。與目前已報(bào)道的其它檢測(cè)技術(shù)相t匕，該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在:(a)能實(shí)時(shí)觀察PCR過程中待檢測(cè)樣品模板DNA(或cDNA)擴(kuò)增情況，無需進(jìn)行電泳、染色和紫外檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了操作程序并縮短檢測(cè)時(shí)間；(b)采用熒光信號(hào)放大功能，大大提高了靈敏度；(C)特異性引物與特異熒光探針雙保險(xiǎn)結(jié)構(gòu)有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；(d)全封閉的操作系統(tǒng)，減少了 PCR產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，是目前生物檢測(cè)領(lǐng)域最準(zhǔn)確、最靈敏的技術(shù)，其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。番茄叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus, ToBSV)是我國重要的檢疫性有害生物。本研究根據(jù)ToBSV中多聚蛋白基因(polyprotein gene)的保守序列，設(shè)計(jì)了三條巢式PCR引物和一條TaqMan探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測(cè)ToBSV的方法。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:⑴上述實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在本發(fā)明得以全部體現(xiàn)，如準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速和能有效減少污染等；(2)設(shè)計(jì)上非常巧妙地將巢式PCR的原理運(yùn)用到實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中，并與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合；(3)在實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上僅增加一條引物，就形成兩套獨(dú)立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)系統(tǒng)；(4)兩套引物探針相互驗(yàn)證，進(jìn)一步有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；(5)兩套引物探針的擴(kuò)增效率一致，因此對(duì)于同一個(gè)樣品的兩次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的能保證基本一致，從而降低了結(jié)果判斷的難度，在實(shí)際檢測(cè)工作、科研和解決重大的國際貿(mào)易爭(zhēng)端中具有極強(qiáng)的可操作性；(6)兩套引物探針的擴(kuò)增效率極高，檢出低限均可達(dá)50fg/y I植物總RNA。


圖1為特異性測(cè)定中試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α為 ToBSV，B 為 SoMV，C 為 TBRV, D 為 SLRSV, E 為 PRMV, F 為 CK1，G 為 CK2。圖2為特異性測(cè)定中試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α為 ToBSV，B 為 SoMV，C 為 TBRV, D 為 SLRSV, E 為 PRMV, F 為 CK1，G 為 CK2。圖3為靈敏度測(cè)定中試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Λ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù);Α、B、C、D、E、F、G、H、1、J 所對(duì)應(yīng)的 RNA 濃度依次為 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、500fg/ μ 1、50fg/ μ 1、5fg/ μ 1、0.5fg/ μ 1、0.05fg/ μ 1、0.005fg/ μ I，K 對(duì)應(yīng) DEPC 水。圖4為靈敏度測(cè)定中試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α、B、C、D、E、F、G、H、1、J 所對(duì)應(yīng)的 RNA 濃度依次為 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、500fg/ μ 1、50fg/ μ 1、5fg/ μ 1、0.5fg/ μ 1、0.05fg/ μ 1、0.0045fg/ μ I，K 對(duì)應(yīng) DEPC 水。圖5為試劑甲和試 劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比圖；縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù)；Α為試劑甲，B為試劑乙。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)時(shí)熒光PCR基因擴(kuò)增儀為ABI PRISM 7000(美國ABI公司);核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國eppendorf公司)；植物總RNA提取試劑盒(商品名E.Z.N.A ,美國Omega公司產(chǎn)品，貨號(hào):R2867_01)購自北京雙羸生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司(TaKaRa)(貨號(hào):DRR037A)、實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(Platinum 定量PCR SuperMix-UDG，貨號(hào):C11730-025)購自美國Invitrogen公司。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為:Ct值< 40，為陽性；Ct值彡40，為陰性。蕃茄叢矮病毒(ToBSV):ATCC 編號(hào) PV-483 ；番茄黑環(huán)病毒(TBRV)=ATCC 編號(hào) PVAS-174 ；草莓潛環(huán)斑病毒(SLRSV) =ATCC編號(hào)PV-1069 ；藜草花葉病毒(SoMV) =ATCC編號(hào)PV-109 ；
桃叢簇花葉病毒(PRMV) =ATCC編號(hào)PV-398。ATCC 即美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection), http: //www.atcc.0rg/0實(shí)施例1、試劑的制備一、引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)美國NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中蕃茄叢矮病毒基因組中多聚蛋白質(zhì)基因(polyprotein gene)序列保守區(qū),分別設(shè)計(jì)了三條引物(一條上游引物ToBSVF和兩條下游引物 ToBSVRl、ToBSVR2)和一條 Taqmam 探針(ToBSVP)。二、試劑的組成1、試劑甲的組成試劑甲由ToBSVF、ToBSVRI和ToBSVP組成(引物和探針由上海生工合成)。ToBSVF (上游引物):5’ -TCCATACCAATCATACCGCTGTT-3’(序列表的序列 I);ToBSVRI (下游引物):5’ -TAGTTCATTGCCAAAAGCCTTGA-3’(序列表的序列 2)；ToBSVP (探針):5’(FAM)-ATGCCACTAGGGTACGCGCAGTCTCA-3’(TAMARA);(核苷酸序列為序列表的序列4 ，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。ToBSVF和ToBSVRl的祀序列大小為78bp (見序列表的序列5)。2、試劑乙的組成試劑乙由ToBSVF、ToBSVR2和ToBSVP組成(引物和探針由上海生工合成)。ToBSVF (上游引物):5’ -TCCATACCAATCATACCGCTGTT-3’(序列表的序列 I);ToBSVR2 (下游引物):5’ -AGGCACCCTGACATTGAACG-3’(序列表的序列 3)；ToBSVP (探針):5’(FAM)-ATGCCACTAGGGTACGCGCAGTCTCA-3’(TAMARA);(核苷酸序列為序列表的序列4，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。ToBSVF和ToBSVR2的靶序列大小為99bp (見序列表的序列6)。實(shí)施例2、試劑的應(yīng)用分別取感染五種病毒(ToBSV、SoMV、TBRV、SLRSV和PRMV)的葡萄葉片，取健康葡萄葉片作為對(duì)照，應(yīng)用實(shí)施例1制備的試劑甲和試劑乙分別進(jìn)行特異性測(cè)定、靈敏度測(cè)定，并進(jìn)行試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比。一、試劑的特異性測(cè)定1、總RNA提取及質(zhì)量控制用植物總RNA提取試劑盒從感染每種病毒的葉片(5種)和健康葉片(CKl)中分別提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度與純度值，并以此控制核酸質(zhì)量。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將步驟I從6種葉片中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對(duì)照(CK2)。反應(yīng)體系(25μ L):5 μ L PrimerScript Buffer (5X), 1.25 μ L PrimerScript Enzyme Mix I, 1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ M), 1.25 μ L Random 6 mers(100 μ M), 2 μ L總 RNA，加 DEPC 水至 25 μ L0反應(yīng)條件:37°C、15min，85t:、5s。
3、試劑的特異性用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。試劑甲的反應(yīng)體系(25μL):PCR buffer (2X ) 12.5 μ 1，ROX 0.5 μ I, ToBSVF(15 μ Μ) I μ 1，ToBSVRI (15 μ Μ) I μ 1，ToBSVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至25 μ 1每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑乙的反應(yīng)體系(25μL):PCR buffer (2X ) 12.5 μ I, ROX 0.5μ I, ToBSVF(15 μ Μ) I μ 1，TOBSVR2 (15 μ Μ) I μ 1，ToBSVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至25 μ 1每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件為:5(TC、2min ；95°C>2min ；95°C > 15s, 60°C >30s, 45 個(gè)循環(huán)。采用試劑甲的實(shí)時(shí)熒光 PCR結(jié)果見圖1。采用試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖2。應(yīng)用試劑甲只有在ToBSV中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(Ct值=25)，判為陽性；應(yīng)用試劑乙只有在ToBSV中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(Ct值=25)。SoMV、TBRV, SLRSV, PRMV, CKl和CK2均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào),判為陰性。結(jié)果表明，試劑甲(或試劑乙)的特異性很好，結(jié)果與預(yù)計(jì)相符。二、試劑的靈敏度測(cè)定1、總RNA提取和各個(gè)稀釋液的制備用植物總RNA提取試劑盒從感染ToBSV的葉片中提取總RNA，用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度和純度值。濃度值為50ι^/μ1，純度值為0D260/280=2.23, 0D260/230=2.30。用DEPC水將提取的總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到各個(gè)稀釋液。各個(gè)稀釋液中，RNA 濃度分別為 5ng/ μ l、500pg/ μ l、50pg/ μ l、5pg/ μ l、500fg/ μ l、50fg/ μ l、5fg/ μ 1、
0.5fg/y 1,0.05fg/y 1,0.005fg/y I。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各個(gè)稀釋液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對(duì)照。反應(yīng)體系(25μ L):5 μ L PrimerScript Buffer (5X), 1.25 μ L PrimerScript Enzyme Mix I,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ M), 1.25 μ L Random 6 mers(100 μ M),2 μ L稀釋液，加DEPC水至25 μ L。反應(yīng)條件:37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的靈敏度用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。試劑甲的反應(yīng)體系(25μL):PCR buffer (2X ) 12.5 μ I, ROX 0.5μ I, ToBSVF(15 μ Μ) I μ 1，ToBSVRI (15 μ Μ) I μ 1，ToBSVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至25 μ 1每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑乙的反應(yīng)體系(25μL):PCR buffer (2X ) 12.5 μ I, ROX 0.5μ I, ToBSVF(15 μ Μ) I μ 1，TOBSVR2 (15 μ Μ) I μ 1，ToBSVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至25 μ 1每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。
試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件為:5(TC、2min ；95°C>2min ；95°C > 15s, 60°C >30s, 45 個(gè)循環(huán)。采用試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖3。采用試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖4。應(yīng)用試劑甲可以判為陽性的最低稀釋度為50fg/l.! I植物總RNA(Ct值=38);應(yīng)用試劑乙可以判為陽性的最低稀釋度為50fg/μ I植物總RNA (Ct值=38)。結(jié)果表明，應(yīng)用試劑甲(或試劑乙)檢測(cè)的靈敏度可達(dá)10_6，即50fg/l.! I植物總RNA。 三、試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比1、總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒從感染ToBSV的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度和純度值。

2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對(duì)照。反應(yīng)體系同步驟一的2。3、試劑的靈敏度用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。方法同步驟一的3。實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖5。采用試劑甲的Ct值=24 ;采用試劑乙的Ct值=24。結(jié)果表明，試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率幾乎完全一樣。
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于:所述試劑由所述特異引物和特異探針組成；所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于:所述特異探針為TaqMan探針。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在制備輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑。
6.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在輔助鑒定蕃茄叢矮病毒中的應(yīng)用。
7.一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙進(jìn)行PCR,得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為78bp且PCR產(chǎn)物乙為99bp，待測(cè)病毒為候選的蕃茄叢矮病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)。
8.一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的蕃茄叢矮病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示 。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述待測(cè)病毒為蕃茄叢矮病毒、藜草花葉病毒、番茄黑環(huán)病毒、草莓潛環(huán)斑病毒或桃叢簇花葉病毒。
10.一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有蕃茄叢矮病毒的方法，包括如下步驟: (1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA； (2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有蕃茄叢矮病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定蕃茄叢矮病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特異探針。蕃茄叢矮病毒是我國重要的檢疫性有害生物，本發(fā)明中利用三條巢式PCR引物和一條TaqMan探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測(cè)ToBSV的方法。該方法有機(jī)地結(jié)合了巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)；三條引物和一條探針形成的兩套PCR體系相互驗(yàn)證，有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有效提高了檢測(cè)的靈敏度。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，檢出低限均可達(dá)50fg/μl植物總RNA。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103160618SQ201310122458
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者粟智平, 張京宣, 孫敏, 劉寧, 鐘響, 陳燕平, 耿金培 申請(qǐng)人:粟智平