專利名稱：用生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于擴增重組腺病毒時所用到的用生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的一套優(yōu)化的工藝方法。
背景技術(shù)：
人胚腎(HEK293)細胞是腺病毒載體的包裝細胞，腺病毒是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒后用于基因治療研究的熱門載體.直接將腺病毒載體導(dǎo)入人體內(nèi)表達目的基因，治療惡性腫瘤，心血管疾病或一些遺傳疾病已取得可喜進展；利用腺病毒載體在包裝細胞HEK293中表達分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸激酶IC等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的一條途徑。2004年全球首例基因治療產(chǎn)品“今又生”在中國上市，使腺病毒載體實現(xiàn)了在臨床上的真正應(yīng)用。因此完善HEK293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及重組腺病毒大規(guī)模擴增技術(shù)具有越來越重要的市場意義。目前，國內(nèi)病毒疫苗制備技術(shù)主要還是依靠轉(zhuǎn)瓶(Rollingbottle)和細胞工廠(Cell factory),但是這些工藝方法存在大量局限，首先是勞動密集，所需空間大，產(chǎn)量較低，其次是無法對細胞生長的各種參數(shù)進行優(yōu)化調(diào)節(jié)，例如酸堿度(PH)、溫度和溶氧等。近些年，關(guān)于生物反應(yīng)器用于病毒疫苗制備已有大量研究開發(fā)，比如中國專利(申請?zhí)?200710073190.X)，但其所用方法并未根據(jù)HEK293細胞生理特性和腺病毒的復(fù)制機制進行優(yōu)化，另外在病毒培養(yǎng)階段仍舊使用血清，這對于疫苗制備來說不夠完善。要完善腺病毒載體擴增工藝首先必須建立在對HEK293細胞生理和生長特性的全面認識，以及對腺病毒感染細胞后的復(fù)制機理有全面把握。首先，細胞感染病毒前后會發(fā)生各種變化，如細胞干重、蛋白和核酸(DNA)含量、細胞大小都有不同程度的增加，293細胞在不含血清的培養(yǎng)基中，細胞感染病毒后直徑從15um增至17um。在感染24小時，48小時后，細胞對葡萄糖的消耗以及氨 和乳酸的生成量均增加了 30%- 100%，氧氣(O2)的消耗和三磷酸腺苷(ATP)的生成也有類似的趨勢，這可能是因為除了細胞正常生長外，感染的過程需要更多的能量。因此，在培養(yǎng)病毒階段更要注意營養(yǎng)物質(zhì)的適度補給，一方面及時補充葡萄糖，因為在病毒擴增過程中，一旦葡萄糖耗竭會導(dǎo)致病毒擴增的停止。另一方面，根據(jù)氨基酸代謝的變化測定，適當(dāng)補充最易消耗的幾種氨基酸。根據(jù)“細胞密度效應(yīng)”，病毒的產(chǎn)量未必跟細胞密度成正比，當(dāng)細胞密度大于某個數(shù)量級，病毒產(chǎn)量不再增加，其原理尚未完全明確，可能與單位體積內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的爭奪和代理產(chǎn)物毒性有關(guān)。在腺病毒擴增的過程中，也同樣存在最佳細胞密度，對于整個培養(yǎng)階段而言，這個細胞密度的確定可以使得整個工藝流程變得簡便、經(jīng)濟，從而更適用于工業(yè)開發(fā)相關(guān)廣品。腺病毒的復(fù)制的最短周期大概在20小時左右，從與細胞表面受體結(jié)合，經(jīng)過內(nèi)吞作用進入細胞，然后是DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達以及病毒的組裝，這個過程最快一批病毒的產(chǎn)生在20小時左右。此外，盡管病毒開始吸附時候，病毒細胞數(shù)比值即感染復(fù)數(shù)(MOI)大于20，實際情況下仍有大量正常細胞未被感染，因此在20-22小時之間如果能再次在無血清培養(yǎng)基下讓病毒繼續(xù)吸附感染正常細胞將最終有利于病毒總體滴度的提高。由于在病毒培養(yǎng)階段最好用不帶有任何血清的培養(yǎng)基，因此探索一種較為廉價的無血清培養(yǎng)基非常關(guān)鍵。水解乳蛋白是一種安全有效的培養(yǎng)基添加劑，已有廣泛的使用，在擴增腺病毒中目前尚無報導(dǎo)，如何確定其添加的濃度比例是一個值得摸索的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用聚纖維紙片(Fibra disk)為載體的生物反應(yīng)器上最大程度優(yōu)化重組腺病毒的生物反應(yīng)器擴增工藝，已期獲得更高滴度的重組腺病毒，并且穩(wěn)定該工藝，達到重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的特點，最終能用于重組腺病毒產(chǎn)品的生產(chǎn)。本發(fā)明用聚纖維紙片(Fibra disk)載體利用生物反應(yīng)器擴增人胚腎細胞(HEK293)，從而建立腺病毒復(fù)制擴增的全套工藝流程。對5型腺病毒復(fù)制擴增體系全面適應(yīng)的條件下，在細胞培養(yǎng)階段用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞6-7天后換液成無血清培養(yǎng)基，吸附腺病毒2.5-3.5小時，加入3%-5%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)20小時，棄去全部培養(yǎng)液，并用磷酸緩沖液(PBS)沖洗去除血清，全部換成無血清培養(yǎng)基加0.25%水解乳蛋白，靜止再吸附1.5-2.5小時以利于病毒再感染正常細胞，同時每20小時補充2g/L的葡萄糖，采用批式收獲換液的方式，使優(yōu)化工藝達到較高的病毒滴度。該方法在減輕后期純化難度并適應(yīng)生物制品的要求的基礎(chǔ)上，盡量優(yōu)化工藝達到較高的病毒滴度。因此本發(fā)明所建立的優(yōu)化工藝是具有良好重復(fù)性、高效重組腺病毒擴增工藝，可適用于任何以Fibradisk為載體的生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒。用生物反應(yīng)器大規(guī)模擴增重組腺病毒的一套優(yōu)化工藝方法，具有如下步驟:1)在生物反應(yīng)器內(nèi)加入生長液，接種HEK293細胞，批次換液培養(yǎng)6-7天，密度達到5 X IO6個/ml以上，接種重組腺病毒，34°C靜止吸附3小時，連續(xù)培養(yǎng)擴增病毒，每20小時左右批次換液收獲；(2)100小時后，細胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低滲緩沖液破細胞，反復(fù)沖洗三次，收獲細胞內(nèi)病毒。(3)用300k中空纖維柱濃縮20-50倍，用于進一步純化。本發(fā)明的技術(shù)方案為:應(yīng)用生物反應(yīng)器全面優(yōu)化腺病毒大規(guī)模擴增工藝，具體步驟如下:
(1)準備材料:
1.微載體:Fibradisk紙片載體150克；
2.細胞:本發(fā)明所選細胞為可以包裝重組腺病毒的細胞，可以人胚腎細胞(HEK293)，A549，PER.C6，優(yōu)選 HEK293，購自美國 ATCC ；
病毒:本發(fā)明所用病毒為重組5型腺病毒載體攜帶人乳頭瘤病毒癌基因E6和E7(AdE6E7)融合蛋白基因，自行構(gòu)建，亦可以是攜帶任何其他目的基因5型腺病毒，或其他型別腺病毒如Ad2，Ad6，Ad26，Ad35等；接種MOI在20-50之間；
細胞生長液:含體積濃度10%血清的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；
細胞維持液:含濃度0.25%水解乳蛋白(美國Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；
(2)細胞培養(yǎng): 1.細胞工廠培養(yǎng)種子細胞和病毒:細胞復(fù)蘇后，在flask細胞培養(yǎng)瓶子(美國Corning公司，)進行傳代，每3天按1:3傳，直至40瓶150mlflask培養(yǎng)瓶消化共得到5X IO8個細胞，接種到10層細胞工廠，(美國Corning公司)，底面積為640cm2，三天后消化得到1.5±0.3X IO9個細胞左右。從最初構(gòu)建后在25cm2方瓶培養(yǎng)得到約為105IU/ml感染滴度的病毒，每次接種量即感染復(fù)數(shù)MOI在20-50之間，然后從75cm2擴增至150cm2，最后到細胞工廠(底面積640cm2)，得到種子病毒滴度大于109IU/ml ；
(3)在生物反應(yīng)器內(nèi)加入生長液，接種HEK293細胞，批次換液培養(yǎng)6-7天，密度達到5-7 X IO6個/ml以上，換液成無血清DMEM培養(yǎng)基，接種重組腺病毒，34°C靜止吸附3小時，然后加入5%的胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)20小時，換液成無血清培養(yǎng)基加0.25%水解乳蛋白，再靜止吸附2小時。接毒后收獲方式采用批式收獲，同時補充相同體積的維持液，收獲時間點為40、60、80和100小時，每20小時補充葡萄糖2g/L。生物反應(yīng)器物理參數(shù)設(shè)定:(I)細胞培養(yǎng)階段ρΗ7.1-7.5、溫度37。。、溶氧50-80%。(2)接毒后，ρΗ7.15-7.25、溫度35。。、溶氧50-70% ；
(4)80-100小時后，細胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低滲緩沖液破細胞，反復(fù)沖洗三次，收獲細胞內(nèi)病毒；
(5)收獲液用低滲緩沖液(20mMTris, 2mM氯化鎂(MgCl2), pH 8.0)破細胞釋放胞內(nèi)病毒。用300k中空纖維柱(GE Healthcare)濃縮20-50倍，用于進一步純化。本發(fā)明與其他生物反應(yīng)器工藝比較，具有根據(jù)原理全面優(yōu)化的特點，本工藝通過應(yīng)用5L工作體積生物反應(yīng)器和150g/5L Fibra disk紙片載體高密度連續(xù)培養(yǎng)宿主細胞，收獲20L原液病毒的滴度高達2X101QIU/ml (4X 10nVP/ml)以上。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果:本發(fā)明集合了目前研究所發(fā)現(xiàn)的幾乎所有最優(yōu)化條件和參數(shù)，盡可能達到了最大收獲滴度，該方法同時具有很高的重復(fù)性和穩(wěn)定性，在生產(chǎn)腺病毒產(chǎn)品中具有很好性價比和應(yīng)用前景，為節(jié)約人力物力成本、提高產(chǎn)能打下基礎(chǔ)。


圖1是安普AP20sc反應(yīng)器葡萄`糖消耗和腺病毒TCID50曲線。圖2是NBS Bioflo310反應(yīng)器葡萄糖消耗和腺病毒TCID50曲線。
具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，以下用具體實施例來解釋說明本發(fā)明。應(yīng)理解，該實施例僅用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明進行限制，下面實施例中未提及的具體實驗方法，按照常規(guī)實驗方法進行。
實施例1
生物反應(yīng)器:中國杭州安普生物工程有限公司IOL激流式生物反應(yīng)器，工作體積為8L，其中細胞灌注袋體積為4L，細胞密度以4L計算，儀器型號:AP20SC ；
微載體=Fibra disk紙片載體150g (杭州安普生物工程有限公司)；
細胞:HEK293，購自美國ATCC ；
病毒:重組5型腺病毒載體攜帶人乳頭瘤病毒癌基因E6和E7 (AdE6E7)融合蛋白基因，自行構(gòu)建；接種MOI在20-50之間；
細胞生長液:含體積濃度10%血清的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；
細胞維持液:含體積濃度0.25%水解乳蛋白(美國Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)；生長液葡萄糖含量測定方法:
葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法)，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；將標明Rl和R2的試劑等量混合各1ml，加入20ul樣品，37°C水浴13min，顯色后，在波長505nm處讀取吸光值；
葡萄糖(mmol/L)=樣本吸光度(A) /校準吸光度(A) X校準液濃度；
葡萄糖(g/L) = mmol/LX 18 ；
糖耗(g/L)=原培養(yǎng)基葡萄糖含量(g/L)-培養(yǎng)24小時后葡萄糖含量(g/L)；
腺病毒載體滴度測定方法
1.快速腺病毒感染性滴度IU (TCID50)檢測試劑盒(細胞免疫化學(xué)法)，北京本元正陽基因技術(shù)公司，用96孔板鋪HEK293細胞，當(dāng)密度達80%以上，按10倍稀釋至Κ^-ΙΟ—12共8個稀釋度接種樣品，68小時培養(yǎng)后 用丙酮固定，用細胞免疫法觀察細胞感染情況，一抗為表面抗原(Hexon)，具體操作步驟和計算方法見試劑盒說明書。2.腺病毒顆粒VP檢測方法:高效液相色譜(HPLC)法，安捷倫Agilent型號:1260，首先用IO9-1O12空病毒標準樣品(北京本元正陽基因技術(shù)公司)建立標準曲線，計算峰值下面積，用260nm色譜提取數(shù)據(jù)，并計算260/280比值，樣品滴度可以通過標準曲線獲得。(詳細步驟見已發(fā)表的文獻:Hum Gene Ther 1997，8:453-465。)
種子細胞培養(yǎng):細胞工廠培養(yǎng)種子細胞和病毒:細胞復(fù)蘇后，在flask細胞培養(yǎng)瓶子(美國Corning公司，)進行傳代，每3天按1:3傳,直至40瓶150mlflask培養(yǎng)瓶消化共得到5X IO8個細胞，接種到10層細胞工廠，(美國Corning公司)，底面積為640cm2，三天后消化得到1.5 X IO9個細胞左右。病毒種子培養(yǎng):從最初構(gòu)建后在25平方厘米(cm2)方瓶培養(yǎng)得到約為105IU/ml感染滴度的病毒，每次接種量即感染復(fù)數(shù)MOI在20-50之間，然后從75平方厘米(cm2)擴增至150cm2，最后到細胞工廠(底面積640cm2)，得到種子病毒滴度大于109IU/ml。生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞:生物反應(yīng)器灌注袋內(nèi)已加入滅菌后的150克Fibradisk載體，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡過夜，棄去后加入細胞生長液8L (其中激流袋和灌注袋各4L)作為循環(huán)總體積，接種HEK293細胞至灌注袋，接種量為(1.5±0.3)X109個細胞，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為:ρΗ7.1-7.5、溫度37°C (80-140小時為35°C )、溶氧50-80%、攪拌速度40-60rpm。每天定時取樣測定葡萄糖消耗情況,從而估計細胞生長情況，在穩(wěn)定條件下，葡萄糖消耗與細胞密度線性相關(guān)。換液模式采用批式換液，分別在48小時換液4L，96小時換液5L，144小時換液6L，168小時細胞計數(shù)在(2.0±0.3) X 101°個細胞，密度達到5X IO6個/ml。具體工藝流程參數(shù)見表I，葡萄糖消耗情況見圖1。病毒培養(yǎng):細胞培養(yǎng)6天后全部換液成無血清培養(yǎng)基，接種病毒。病毒收獲:144小時換液8L,在無血清條件下吸附病毒3小時,然后加入5%的胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)20小時，換液成無血清培養(yǎng)基加0.25%水解乳蛋白。接毒后收獲方式采用批式收獲，同時補充相同體積的維持液，收獲時間點為40、60、80和100小時各收獲5L。共收獲上清15L，用低滲緩沖液破細胞，反復(fù)沖洗三次，收獲細胞內(nèi)病毒2L。病毒滴度測定結(jié)果見表2和圖1。收獲液用低滲緩沖液(20 mM Tris, 2 mM MgCl2, pH 8.0)破細胞釋放胞內(nèi)病毒。濃縮、純化:用300k中空纖維柱濃縮20-50倍，用于進一步純化。
表1.安普AP20SC生物反應(yīng)器工藝流程表
權(quán)利要求
1.一種用生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于用聚纖維紙片載體利用生物反應(yīng)器擴增人胚腎細胞HEK293，建立腺病毒復(fù)制擴增的工藝流程，對5型腺病毒復(fù)制擴增體系全面適應(yīng)的條件下，在細胞培養(yǎng)階段用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞6-7天后換液成無血清培養(yǎng)基，吸附腺病毒2.5-3.5小時，加入3-5%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)20小時，棄去全部培養(yǎng)液，并用磷酸緩沖液PBS沖洗去除血清，全部換成無血清培養(yǎng)基加0.25%水解乳蛋白，靜止再吸附1.5-2.5小時以利于病毒再感染正常細胞，同時每20小時補充2g/L的葡萄糖，采用批式收獲換液的方式，使優(yōu)化工藝達到較高的病毒滴度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于:具有如下步驟:1)在生物反應(yīng)器內(nèi)加入生長液，接種HEK293細胞，批次換液培養(yǎng)6-7天，密度達到5 X IO6個/ml以上，接種重組腺病毒，34°C靜止吸附2.5-3.5小時，連續(xù)培養(yǎng)擴增病毒，每20小時左右批次換液收獲；(2) 100小時后，細胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低滲緩沖液破細胞，反復(fù)沖洗三次，收獲細胞內(nèi)病毒；(3)用300k中空纖維柱濃縮20-50倍，用于進一步純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于:生物反應(yīng)器所用聚纖維紙片載體為1 50克。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于:重組腺病毒接種量即感染復(fù)數(shù)MOI為20-50。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于:接毒后收獲方式采用批式收獲，同時補充相同體積的維持液，收獲時間點為40、60、80和100小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于:生物反應(yīng)器物理參數(shù)設(shè)定:(I)細胞培養(yǎng)階段PH7.1-7.5、溫度37°C、溶氧50-80% ；(2)接毒后，ρΗ7.15-7.25、溫度 35。。、溶氧 50-70%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法，其特征在于:收獲液用低滲緩沖液破細胞釋放胞內(nèi)病毒，用300k中空纖維柱濃縮20-50倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于擴增重組腺病毒時所用到的一套全面優(yōu)化的工藝方法。該方法用聚纖維紙片載體利用生物反應(yīng)器擴增人胚腎細胞(HEK293)從而建立腺病毒復(fù)制擴增的全套工藝流程。本發(fā)明建立在對5型腺病毒復(fù)制擴增體系全面適應(yīng)的條件下，在細胞培養(yǎng)階段用含10%的血清的DMEM培養(yǎng)基，在病毒接種吸附后至20小時使用帶5%的血清DMEM培養(yǎng)基，在收獲病毒階段采用無血清培養(yǎng)基添加0.25%的水解乳蛋白，同時每20小時補充2g/L的葡萄糖，采用批式收獲換液的方式，該方法在減輕后期純化難度并適應(yīng)生物制品的要求的基礎(chǔ)上，使優(yōu)化工藝達到較高的病毒滴度。因此本發(fā)明所建立的優(yōu)化工藝是具有良好重復(fù)性、高效重組腺病毒擴增工藝，可適用于任何以聚纖維紙片為載體的生物反應(yīng)器擴增重組腺病毒。
文檔編號C12N7/00GK103160478SQ20131011475
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者陳科達, 吳潔, 王一虎, 姜云水, 莊昉成, 金素鳳, 高孟, 張鋒, 李劍波, 陳剛, 毛子安, 毛江森 申請人:浙江普康生物技術(shù)股份有限公司