專利名稱：釀酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及和釀酒酵母乙醇耐受性有關的6-磷酸海藻糖合成酶基因及其酵母表達載體，以及運用該表達載體增加釀酒酵母細胞內(nèi)海藻糖的積累和細胞的乙醇耐受性。
背景技術：
釀酒酵母是工業(yè)發(fā)酵的常用菌株，在生產(chǎn)中釀酒酵母經(jīng)常面臨非常多的壓力，例如高溫、高滲透壓、高乙醇脅迫、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等。在這些脅迫下可以生存并高產(chǎn)乙醇的酵母對于工業(yè)生產(chǎn)是非常重要的。海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過a-a-1-l鍵連接而成的非還原性二糖。海藻糖與微生物細胞一系列耐受性機制有關，并且在酵母細胞中扮演著儲存碳源的角色。研究表明海藻糖具有穩(wěn)定蛋白、抑制變性蛋白的聚集、保護細胞膜的功倉泛Jain, N.K.and 1.Roy (2009).Effect of trehalose on protein struc-ture.Protein Sc1.18: 24-36.，同時編碼海藻糖合成酶的基因在多種脅迫條件下其表達量增力口Li, L., Y.Ye, L.Pan, Y.Zhu, S.Zheng, and Y.Lin (2009).The inductionof trehalose and glycerol in Saccharomyces cerevisiae in response to variousstresses.Biochem.Biophysic.Res.Com-munic.387: 778-783.。釀酒酵母的海藻糖合成由兩步完成戴秀玉，程萍，周堅，江慧修(1995).海藻糖的生理功能、分子生物學研究及應用前景.微生物學通報.22 (2)，首先UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖合成酶的作用下生成6-磷酸海藻糖，在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶的作用下形成海藻糖。在釀酒酵母中，上述海藻糖合成相關酶可以形成多酶復合體，包括4種蛋白TPS1，TPS2，TSLl 和 TPS3。Xianglin Tao 等人發(fā)現(xiàn)在用 10% 乙醇刺激 5: cerevisiae Z5 和
S.cerevisiaeSZ3-1時,與海藻糖合成有關`的基因tpsl，tps2, i/75.J和tsll表達水平都有所提高。研究表明乙醇壓力可以同時誘導編碼海藻糖合成酶和降解酶基因的表達，來幫助酵母菌調(diào)節(jié)細胞內(nèi)海藻糖含量抵御外界乙醇壓力Tao X，Zheng D, Liu T, Wang P, Zhaoff, et al.(2012) A Novel Strategy to Construct Yeast Saccharomyces cerevisiaeStrains for Very High Gravity Fermentation.PLoS ONE 7(2): e31235.do1:10.1371/
journal, pone.0031235。在乙醇脅迫條件下海藻糖的功能可能是通過化學分子伴侶的形式，來防止蛋白質(zhì)的錯誤折疊。和其他的糖相比，海藻糖可以更有效的防止蛋白質(zhì)的變性和聚集，因為它具有改變蛋白質(zhì)周圍水環(huán)境的特殊能力。高濃度海藻糖的積累可以替代水分子，在海藻糖的羥基集團和細胞膜脂類極性集團之間形成氫鍵使細胞膜蛋白更加穩(wěn)定。本發(fā)明選擇克隆SaccAaro焊Ce1S cererisiae s288c的基因，構建表達載體轉(zhuǎn)化Saccharomyces cererisiaeINVSc進行表達并證明其對酵母細胞內(nèi)海藻糖含量和乙醇耐受性的影響，有望在工業(yè)生產(chǎn)中應用提高酵母的乙醇產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種釀酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不,本發(fā)明的基因來源于SaccAan謂Fees cererisiae s288c。本發(fā)明的另一目的是提供6-磷酸海藻糖合成酶基因tpsl的酵母表達載體ρΥΕ53- /Λ57，該表達載體含有tpsl基因，tpsl基因上游含有半乳糖啟動子。本發(fā)明的另一目的是將釀酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因的表達載體應用在提高釀酒酵母的乙醇耐受性中，將表達載體ρΥΕ53-φ.57導入釀酒酵母細胞內(nèi)，通過測量酵母細胞內(nèi)海藻糖積累的變化來研究海藻糖-6-磷酸合成酶活性是否提高，以及對酵母乙醇耐受性的影響。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)現(xiàn)提供了下述技術方案:
1、釀酒酵母cererisiae s288c (購買于上海北諾生物科技有限公司)的tpsl基因及其序列的獲得
(1)根據(jù)焊Ce1Scererisiae s288c的tpsl基因已知兩端序列和釀酒酵母表達載體PYES3/CT的多克隆酶切位點，設計I對特異引物如下:
tpsl-￥: 5，-OTAAGCTTGATGACTACGGATAACGCTAAG-3，tpsl-R:3^ -07gCTCGAGTCAGTTTTTGGTGGCAGAGGA-3，
在上下游引物的5’端和3’分別加入內(nèi)切酶歷和通oJ酶切位點及保護堿基(下劃線部分為酶切位點，斜體部分為保護堿基)，提取焊cm cererisiae s288c的基因組DNA，并以基因組DNA為模板利用上述引物PCR擴增目的基因；
(2)膠回收目的基因2、tpsl基因的TA克隆及構建酵母表達載體ρΥΕ53- /Λ57
使用PMD19-T載體進行TA克隆，與16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5a，用內(nèi)切酶歷和XhoI酶進行雙酶切驗證和PCR驗證后，送去測序公司進行測序；
使用內(nèi)切酶歷和沿oJ酶對pYES3和測序正確ρΜ019- /Λ57載體進行雙酶切，分別獲得5’和3’末端分別帶有內(nèi)切酶和通oJ酶切位點的tpsl基因和pYES3載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收，然后在16°C連接16h，獲得酵母表達載體pYES3-φ.57，進行測序比對分析。3、tpsl基因的表達
制備釀酒酵母菌株的感受態(tài)細胞，使用電轉(zhuǎn)化法將表達載體轉(zhuǎn)化進釀酒酵母中，使用酵母缺陷型培養(yǎng)基SC/Trp選擇性培養(yǎng)基篩選酵母轉(zhuǎn)化子,在以半乳糖為碳源的培養(yǎng)基中誘導基因表達。4、海藻糖標準曲線的制備及提取酵母中海藻糖的方法
利用蒽酮-硫酸法測定不同濃度梯度海藻糖下OD59tl的吸光度來制備標準曲線，用三氯乙酸多次浸提法來提取酵母中的海藻糖。5、測定酵母細胞中海藻糖的含量來證明tpsl基因酶活提高
利用蒽酮-硫酸法測定酵母細胞中海藻糖的含量，來證明tpsl基因酶活提高。6、研究tpsl基因的過表達對釀酒酵母乙醇耐受性的影響
本發(fā)明中克隆的基因是首次從焊cererisiae s288c中克隆得到的，并在釀酒酵母菌中(如cererisiae INVSc)表達,使突變株比野生型菌株可以耐受更高的乙醇濃度，為增加釀酒酵母菌株的乙醇耐受性及提高工業(yè)生產(chǎn)時的乙醇產(chǎn)量奠定了分子基礎。


圖1為本發(fā)明釀酒酵母cererisiae s288c總基因組DNA電泳不意圖，其中:泳道I是IKb plus DNA ladder MarkerI,泳道2、3、4是基因組DNA ； 圖2為本發(fā)明tpsl基因擴增產(chǎn)物電泳示意圖，其中:1是DL2，OOODNA MarkerMarkerll，泳道2是水對照，泳道3、4、5是tpsl基因擴增產(chǎn)物； 圖3為本發(fā)明tpsl基因PCR產(chǎn)物膠回收示意圖，其中:1是DL2，OOODNA MarkerMarkerll，泳道2、3是tpsl基因擴增產(chǎn)物的回收； 圖4為本發(fā)明tpsl基因的TA克隆的內(nèi)切酶歷和通oJ雙酶切驗證示意圖，其中:1 是 IOObp plus DNA ladder MarkerIII,泳道 2、3、4 是 ρΜ019- /75.7 雙酶切圖； 圖5為本發(fā)明的TA克隆的PCR驗證示意圖，其中:1是DL2，000DNA MarkerMarkerll，泳道2是水對照，泳道3、4是tpsl基因擴增產(chǎn)物； 圖6為本發(fā)明酵母表達載體pYES3用和ZAoJ進行雙酶切的電泳示意圖，其中:I 是 IOObp plus DNA ladder Markerlll，泳道 2、3、4、5、6、7 是 pYES3 載體雙酶切，8 泳道是pYES3對照； 圖7為本發(fā)明酵母表達載體ρΥΕ53- /Λ57酶切驗證檢測示意圖，其中:1是IOObp plusDNA ladder Markerlll,泳道2是空白對照，泳道3、4、5、6、7是tpsl基因擴增產(chǎn)物； 圖8為圖8為本發(fā)明表達酵母載體pYES3_ tpsl電轉(zhuǎn)化cererisiaeINVSc后PCR驗證示意圖，其中:I是DL2, 000DNA Marker Markerll，泳道2是水對照，泳道3、4、5、6、是雙酶切示意圖； 圖9為本發(fā)明酵母表達載體ρΥΕ53- /Λ57構建策略示意圖； 圖10為本發(fā)明海藻糖標準曲線示意圖； 圖11為本發(fā)明野生菌與突變株海藻糖含量比較示意圖； 圖12為本發(fā)明野生菌與突變株乙醇耐受性示意圖； 圖13為本發(fā)明野生菌與突變株在不同乙醇濃度下細胞內(nèi)海藻糖含量示意圖。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
本實施例中采用的試劑主要為分子生物學實驗試劑，各種限制性內(nèi)切酶、pfuDNA聚合酶、dNTP等為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，大腸桿菌DH5a為TakaRa有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自于上海生物生物工程技術公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，儀器均為分子生物學及基因工程實驗室常用儀器設備。
所有引物序列合成和基因測序均在上海生物生物工程技術公司。
實施例1: Saccharomyces cererisiae s288c的tpsl基因及其基因序列的獲得 (I)引物設計 根據(jù)焊Ce1S cererisiae s288c的tpsl基因已知兩端序列和釀酒酵母表達載體PYES3/CT的多克隆酶切位點，設計I對特異引物如下:tpsl-V: 5 ’ -076MGCTTGATGACTACGGATAACGCTAAG-3，tpsl-R■. ,, -07gCTCGAGTCAGTTTTTGGTGGCAGAGGA-3，
在上下游引物的5’端和3’端分別加入和通οJ酶切位點及保護堿基(下劃線部分為酶切位點，斜體部分為保護堿基)。(2) Saccharomyces cererisiae s288c 總基因組 DNA 的提取
A、收集過夜培養(yǎng)的菌體1.5ml，加入500ul磷酸緩沖液PBS懸浮菌體，12000rpm/min離心3min收集菌體，用磷酸緩沖液PBS重洗一次；
B、將沉淀溶于35μ1的蝸牛酶溶液中，加入65μ1的磷酸緩沖液PBS，45°C作用2h，力口IOOul裂解液于-20°C冷凍，然后室溫震蕩溶解反復三次；
C、向懸浮液中加入150μ1醋酸鉀(ph8.9),輕輕混勻,然后1000r/min離心5min ；
D、取上清液,加入2倍體積的無水乙醇,輕輕混勻，室溫放置5min；
E、12000r/min離心lOmin，將沉淀溶解于ΙΟΟμΙΤΕ緩沖液中，加等體積的酚-氯仿-異戍醇(體積比25:24:1),輕柔顛倒混勻，12000r/min離心5min,重復抽提一次；
F、加1/10體積的30mol/l的醋酸鈉(PH5.2)，2.5倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ；
G、1000r/min離心5min，用70%乙醇洗滌沉淀兩次，室溫干燥后用20μ1ΤΕ緩沖液溶解；
H、加入2Pll0mg/ml的RNaseA37°C溫浴30min，自然冷卻后保存，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，結(jié)果見圖1。

(3) tpsl基因的擴增
利用上述引物以SscchaxomycGS cererisiae s288c總基因組DNA為模板PCR擴增目的基因tpsl,結(jié)果見圖2。(4) 基因的膠回收
對擴增產(chǎn)物目的基因tpsl進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，利用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進行回收，結(jié)果見圖3。實施例2 'tpsl基因的TA克隆及構建酵母表達載體ρΥΕ33- /Λ57
使用PMD19-T載體進行TA克隆，連接體系為0.5μ1載體，3ul目的DNA，2.5μ1的T4DNA連接液于16°C過夜連接，熱刺激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5 α，用內(nèi)切酶和XhoI酶進行雙酶切驗證和PCR驗證后，送去測序公司進行測序，結(jié)果分別見圖4和圖5。使用內(nèi)切酶和通oJ酶對pYES3載體進行雙酶切，結(jié)果見圖6，和測序正確PMD19- 載體進行雙酶切，分別獲得5’和3’末端分別帶有歷/^///和通0/酶切位點的tpsl基因和pYES3載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收，按照目的基因:載體=5:1(摩爾比)加樣，然后加入T4DNA連接液在16°C連接16h ;將感受態(tài)細胞大腸桿菌疋coliDH5a 50μ1加入6μ1連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激75s后冰浴2min，力口入500μ1的LB培養(yǎng)基；37°C搖床150rpm培養(yǎng)50min使菌體復蘇；培養(yǎng)結(jié)束后吸取200μ1培養(yǎng)液涂布在含有氨芐Amp抗性的LB平板上；37 °C過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落，接種到氨芐Amp+LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h ;提取質(zhì)粒，進行酶切驗證，結(jié)果見圖7 ;再送去上海上海生物生物工程技術公司進行測序驗證插入基因的正確性，獲得酵母表達載體ρΥΕ53- /Λ57 (見圖9)，該表達載體含有tpsl基因，tpsl基因上游含有半乳糖啟動子，下游帶有色氨酸Trp選擇標記。
實施例3: tpsl基因的表達
用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pYES3_tpsI 轉(zhuǎn)化Saccharomyces cererisiae INVScCJanpanCollection of Microorganisms, 1 Saccharomyces cererisiae INVSc 的特點是色氨酸Trp-缺陷型菌株)感受態(tài)細胞。制備Saccharomyces cererisiae INVSc感受態(tài)細胞,具體操作如下:
a、挑取一個酵母單菌落到4ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C生長過夜；
b、接種:吸取50μ1的菌液到50ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)至OD600=L 3-1.5，大約需要 16h ；
c、4°C,5000rpm離心5min,棄上清,用50ml冰預冷無菌水將菌體懸浮；
d、4°C,5000rpm離心IOmin,棄上清,用30ml冰預冷無菌水將菌體重懸；
e、4°C,5000rpm離心IOmin,棄上清,用20ml IM冰預冷的山梨醇將菌體洗漆I次；
f、4°C，5000rpm離心lOmin，棄上清，溶于200μ1IM的冰預冷的山梨醇，以備轉(zhuǎn)化，始終保持細胞在冰上；
轉(zhuǎn)化:在80μ1的酵母感受態(tài)細胞中加入適量的質(zhì)粒(l_5Pg)冰上放置15min，迅速加入
2.0cm電擊杯中(冰預冷15min)，電擊(電擊參數(shù)為1500v，25Uf，200 Ω )，迅速加入600μ1山梨醇，于37°C放置I小時；涂布在酵母缺陷型培養(yǎng)基SC/Trp-選擇性培養(yǎng)基平板上(培養(yǎng)基成分:YNB, 1.7g ；(NH4) 2S04，5g ；dH20, 850ml ;40% 葡萄糖，50ml ; 10* 氨基酸母液，100ml )。過夜培養(yǎng)；挑取單克隆接 種到酵母缺陷型培養(yǎng)基SC/Trp-選擇性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；通過菌液PCR驗證，結(jié)果見圖8 ;轉(zhuǎn)化成功的菌體接種到以半乳糖為碳源的誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，誘導tpsl基因的表達，半乳糖誘導型培養(yǎng)基包括20g/l的半乳糖，20g/l蛋白胨，10g/l酵母膏。實施例4:海藻糖標準曲線的制備
標準曲線的制備:分別準確量取lg/Ι的標準海藻糖溶液O μ 1，25 μ 1，50 μ 1，150 μ 1，200 μ I并加水至2.00ml，搖勻。根據(jù)蒽酮-硫酸試劑法制備海藻糖標準曲線:各管分別加
0.2%的蒽酮-硫酸試劑8.00ml，于沸水浴中加熱2min (從水浴重新沸騰算起)，取出用自來水冷卻，在590nm處以首管作為空白，測定其吸光度，結(jié)果見圖10，根據(jù)圖10可得出海藻糖含量與吸光度 OD59tlnm 之間的方程:y=4.2509x+0.0094，R2=0.9992。實施例5:測定酵母細胞中海藻糖的含量來證明tpsl基因酶活提高
野生菌與突變株分別接種到Y(jié)PD和半乳糖誘導型試管液體培養(yǎng)基內(nèi)(10ml)，30°C，150rpm搖床培養(yǎng)24h，4000rpm離心IOmin收集細胞，用預冷的生理鹽水快速浸泡洗去表面雜質(zhì)，離心回收菌體，在冰浴中用15ml 0.5mol/l三氯乙酸浸提三次,每次30min來提取海藻糖。通過上述蒽酮-硫酸試劑法測定海藻糖含量，結(jié)果見圖11，突變株的海藻糖含量為0.201mg，野生菌的海藻糖含量為0.146mg，海藻糖含量的提高說明轉(zhuǎn)化表達載體pYES3-1/752 熱 Saccharomyces cererisiae INVSc 的突變株基因過表達,其編碼的6-磷酸海藻糖合成酶酶活提高。實施例6 -.tpsl基因的過表達對Saccharomyces cererisiae INVSc乙醇耐受性的影響
將野生菌株cererisiae INVSc,和轉(zhuǎn)化表達載體ρΥΕ33- /75.7的突變株分別在YPD和酵母誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)到0D_為2.0時，接種到含有0%，5%，8%，10%, 12%乙醇的YPD培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm條件下培養(yǎng)24h ;在0D_處測定其吸光度，結(jié)果見圖12，從圖上可看出突變株的乙醇耐受性高于野生菌。同時測定這些不同乙醇濃度下野生菌與突變菌株細胞中海藻糖含量的變化，結(jié)果見圖13，結(jié)果顯示突變株內(nèi)海藻糖有更高積累，表明通過在cererisiae INVSc內(nèi)過表達基因，使突變株細胞內(nèi)可以積累更多的海藻糖，而海藻糖的積累有利于提高釀酒酵母的乙醇耐受性。
本發(fā)明中克隆的基因是首次從SaccAaro焊cererisiae s288c中克隆并在Saccharomyces cererisiae INVSc表達，為增加釀酒酵母菌株的乙醇耐受性及提高工業(yè)生產(chǎn)時的乙醇產(chǎn)量奠定 了分子基礎。
權利要求
1.釀酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.權利要求1所述釀酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因的表達載體，其特征在于:該載體含有tpsl基因，tpsl基因上游含有半乳糖啟動子。
3.權利要求2所述的釀酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因的表達載體在提高釀酒酵母的乙醇耐受性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種釀酒酵母的6-磷酸海藻糖合成酶tps1基因及其酵母表達載體，將6-磷酸海藻糖合成酶tps1基因酵母表達載體應用在釀酒酵母內(nèi)，來增加細胞內(nèi)海藻糖的積累從而提高其乙醇耐受性，通過蒽酮-硫酸法測定細胞內(nèi)海藻糖的含量，實驗證明本發(fā)明提供的6-磷酸海藻糖合成酶基因表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中后酵母細胞中6-磷酸海藻糖合成酶酶活性提高，6-磷酸海藻糖合成酶酶活性的提高增加了酵母細胞的乙醇耐受性。
文檔編號C12R1/865GK103146721SQ20131010246
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權日2013年3月28日
發(fā)明者伊日布斯, 劉石雪, 尚淑梅 申請人:昆明理工大學