專利名稱：黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑ctr1基因及其編碼的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及一種黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因及其編碼的蛋白。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumissativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(cucumis) —年蔓生的草本植物。特別是黃瓜花性型分化多樣，常見(jiàn)的黃瓜品種是雌雄花獨(dú)立著生的異花同株型(monoecious);不過(guò)某些品種也會(huì)出現(xiàn)兩性花(hermaphrodite),在大量的生理學(xué)和遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，黃瓜已逐漸成為研究植物性型分化的模式材料。
乙烯作為一種植物激素對(duì)植物的正常發(fā)育和脅迫反應(yīng)起著很重要的作用。在正常發(fā)育過(guò)程中，乙烯調(diào)控種子萌發(fā)種苗生長(zhǎng)、葉片和花的脫落、果實(shí)成熟、器官衰老、花性別決定等生理過(guò)程。此外，當(dāng)植物受到外界刺激包括傷害、病原侵入、干旱等，乙烯的生物合成增力口，促進(jìn)防衛(wèi)化合物的生成，表明乙烯在應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中起著重要作用。
在乙烯生物合成途徑上，已做了大量的研究。而黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究較為緩慢，途徑中一些重要的組分還未得到分離和鑒定。
CTRl基因是一個(gè)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)控基因，也是第一個(gè)被克隆的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因[Kieber JJ et al.CTRl, a negative regulator of the ethyleneresponse pathway in Arabidopsis， encodes a member of the Raf family of proteinkinases.Cell，1993，72 (3):427-441.]。遺傳和生化研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)跨膜功能域或膜附著結(jié)構(gòu)的CTRl的氨基端可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的乙烯受體羧基端相互作用，從而間接結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成 ETR1/CTR1 復(fù)合體進(jìn)而負(fù)調(diào)控乙烯反應(yīng)[Gao Z et al.Localization of the Raf-1ikekinase CTRlto the endoplasmic reticulum of Arabidopsis through participationin ethylene receptor signaling complexes.The Journal of Biological Chemistry,2003,278:34725-34732.]目前，CTR l基因作為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵組分，已從擬南芥、西葫蘆、甜瓜、番茄、小麥、飛燕草、月季、獼猴桃等物種中分離。因此，分離和鑒定黃瓜CTRl基因?yàn)檠芯緾TRl的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)提供了可能，同時(shí)也為功能性研究CTRl在乙烯調(diào)控黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是為了進(jìn)一步研究黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的功能及應(yīng)用，以及乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因與黃瓜性型之間的相關(guān)性，提供一種黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因及其編碼的蛋白。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:
一種黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，命名為CsCTRl，其DNA序列如SEQID N0.1所示。
黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因編碼的蛋白，其氨基酸殘基序列如SEQID N0.2所示。
上述黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，其中，所述CsCTRl含有一個(gè)2559bp的開(kāi)放閱讀框，該開(kāi)放閱讀框?yàn)榈贗位至第2559位核苷酸。
上述黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，其中，所述的開(kāi)放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA。
上述黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因編碼的蛋白，其中，將SEQID N0.2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)以上氨基酸殘基的取代和/或缺失或添加，得到具有與所述蛋白相同活性的衍生蛋白。
上述黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，其中，該基因的全長(zhǎng)由以下引物對(duì)擴(kuò)增得到:
一條引物的核苷酸序列如SEQID N0.3所示，另一條引物的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。
含有上述基 因的重組載體，是將所述基因插入表達(dá)載體pBI121CaMV35S啟動(dòng)子和終止子nos之間獲得。
含有上述基因的擬南芥轉(zhuǎn)化純株系。
上述黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因CsCTRl及其編碼蛋白的獲得，是利用擬南芥CTRl基因的氨基酸序列(GenBank accession N0.NP_850760)為信息探針，通過(guò)黃瓜基因組網(wǎng)站(http://cucumber, genomics, org.cn)中的BlastP程序,獲得與信息探針一致性為67%的csa011978，其位于6號(hào)染色體。利用csa011978序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF序列的引物，從黃瓜S52品系的成熟葉片提取總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增CsCTRl的0RF，測(cè)序得出CsCTRl基因的0RF2559bp，推導(dǎo)編碼852個(gè)氨基酸，起始密碼子位ATG，終止密碼子為T(mén)GA0蛋白預(yù)測(cè)大小為94.521KDa，等電點(diǎn)為5.77。通過(guò)黃瓜基因組網(wǎng)站(http://cucumber.genomics, org.cn)中的BlastP程序發(fā)現(xiàn)，CsCTRl在黃瓜基因組中為單拷貝。黃瓜基因組序列表明該基因包含15個(gè)外顯子、14個(gè)內(nèi)含子。
用Genscan(http://genes, mit.edu/GENSCAN.html)對(duì) CsCTRl 的 ORF 進(jìn)行分析，通過(guò)BLASTP (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)獲得其他物種的相似序列，進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示CsCTRl與其他植物CTRl基因高度同源，在進(jìn)化過(guò)程中起源于同一祖先，且與南瓜、甜瓜聚類在一簇。蛋白質(zhì)同源建模結(jié)果表明CTRl含有與擬南芥CTRl蛋白激酶結(jié)構(gòu)域高度相似的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明公開(kāi)了黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑當(dāng)中的CTRl基因序列，不僅為研究黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中CTRl的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因與黃瓜性型之間的相關(guān)性提供基礎(chǔ)。此外，也為進(jìn)一步研究黃瓜CTRl在除花性型分化以外的其他相關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用提供條件。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1黃瓜CTRl開(kāi)放閱讀框(ORF)的獲得
1.RNA 的提取(RNAisolation)
黃瓜S52為我們收集的華南品種，雌雄異花同株，取其成熟葉片在液氮中研碎，力口A 1.5ml EP管中，用TRIpure Reagent試劑按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA(Aidlab, China),之后取Iul RNA利用分光光度計(jì)測(cè)定其含量。
2.反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)
以黃瓜總RNA為模板，采用ReverTra Ace qPCR RT Kit擴(kuò)增試劑盒(Τ0Υ0Β0，China)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄步驟參照該試劑盒的用戶手冊(cè)。
3.開(kāi)放閱讀框的獲得
利用擬南芥CTRl基因的氨基酸序列(GenBank accession N0.NP_850760)為信息探針，通過(guò)黃瓜基因組網(wǎng)站(http://cucumber, genomics, org.cn)中的BlastP程序,獲得與信息探針一致性為67%的csaOl 1978，其位于6號(hào)染色體。利用csa011978序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF序列的引物(見(jiàn)序列表序列3和4)。
PCR 反應(yīng)體系:40ng cDNA，0.5 μ M 正反向引物，25 μ 12 XPrimeSTAR Max (TaKaRa,China)，反應(yīng)體系50 μ I。反應(yīng)條件:95°C變性10s，55°C退火15s，72°C延伸30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸20min (加Taq酶0.5ul，dNTP3ul)。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。回收操作按照生工生物有限公司的瓊脂凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施例2CsCTRl基因相關(guān)蛋白在擬南芥突變株CTRl中進(jìn)行真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
1、含目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建
利用限制性內(nèi)切酶XmaI和SacI同時(shí)雙酶切CsCTRlDNA回收片段和植物雙元表達(dá)載體pBI121 JfCsCTRl插入表達(dá)載體pBI121CaMV35S啟動(dòng)子和終止子nos之間。酶切反應(yīng)體系如表I所示:
表I
權(quán)利要求
1.一種黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，命名為CsCTRl，其DNA序列如SEQID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因編碼的蛋白，其氨基酸殘基序列如 SEQID N0.2 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，其特征是，所述CsCTRl含有一個(gè)2559bp的開(kāi)放閱讀框，該開(kāi)放閱讀框?yàn)榈贗位至第2559位核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，其特征是，所述的開(kāi)放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因編碼的蛋白，其特征是，將SEQID N0.2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)以上氨基酸殘基的取代和/或缺失或添加，得到具有與所述蛋白相同活性的衍生蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTRl基因，其特征是，該基因的全長(zhǎng)由以下引物對(duì)擴(kuò)增得到: 一條引物的核苷酸序列如SEQID N0.3所示，另一條引物的核苷酸序列如SEQID N0.4所示。
7.含有權(quán)利要求1所述基因的重組載體，其特征在于:將所述基因插入表達(dá)載體pBI121CaMV35S啟動(dòng)子和終止子nos之間獲得。
8.含有權(quán)利要求1所述基 因的擬南芥轉(zhuǎn)化純株系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTR1基因，命名為CsCTR1，其DNA序列如SEQID NO.1所示。其編碼的蛋白的氨基酸殘基序列如SEQID NO.2所示。CsCTR1開(kāi)放閱讀框2559bp，編碼852個(gè)氨基酸。將其插入表達(dá)載體，得到一個(gè)過(guò)量表達(dá)載體。用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥CTR1突變株進(jìn)行功能互補(bǔ)，得到CsCTR1轉(zhuǎn)基因純株系。本發(fā)明不僅為研究黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑CTR1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為功能性研究CTR1在乙烯調(diào)控黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/84GK103173463SQ20131008692
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者別蓓蓓, 蔡潤(rùn), 潘俊松, 何歡樂(lè) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)