使用結(jié)合元件用于分析的裝置和方法
【專利摘要】一種方法，包括：形成含有下列成分的組合物：一定量的報(bào)告化合物，能夠捕獲報(bào)告化合物的結(jié)合元件，以及一定量的能夠與報(bào)告化合物形成復(fù)合物的靶核酸，與報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制報(bào)告化合物被結(jié)合元件捕獲；將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物；將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上；以及測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。
【專利說明】使用結(jié)合元件用于分析的裝置和方法
[0001]本發(fā)明是中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)?00780041209.0,的分案申請(qǐng)。
[0002]優(yōu)先權(quán)聲明
本申請(qǐng)要求2007年7月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)N0.60/951，364和2006年11月6日提交的美國(guó)申請(qǐng)N0.60/856，782的優(yōu)先權(quán)，上述每個(gè)申請(qǐng)以其全文引為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及分析方法，例如多核苷酸的分析方法。
[0004]相關(guān)申請(qǐng)
本申請(qǐng)涉及2005年5月6日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP2005/004923的美國(guó)繼續(xù)申請(qǐng)，該國(guó)際專利申請(qǐng)指定為美國(guó)并要求了 2004年5月6日提交的德國(guó)專利申請(qǐng)DE 10 2004022 263的優(yōu)先權(quán)，美國(guó)繼續(xù)申請(qǐng)N0.US 11/593，021題為“用于檢測(cè)分子相互作用的方法和裝置”并于2006年11月6日提交，每個(gè)這些申請(qǐng)?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖肌?br> 【背景技術(shù)】
[0005]生物樣品中病原體的存在可以通過分析樣品中與病原體的存在有關(guān)的多核苷酸來確定。細(xì)菌，霉菌和病毒是可以在相關(guān)多核苷酸的分析的基礎(chǔ)上確定的病原體的例子。
[0006]EP O 637 999公開了通過進(jìn)行多核苷酸聚合反應(yīng)在樣品中擴(kuò)增預(yù)先選定的多核苷酸的裝置。該裝置包括顯微制造限定出樣品入口的基體，以及從入口延伸出的中等尺度的流動(dòng)系統(tǒng)。中等尺度的流動(dòng)系統(tǒng)包括多核苷酸聚合反應(yīng)室，它與入口流體連通，入口提供用于預(yù)先選定的多核苷酸的聚合和擴(kuò)增所需的試劑。裝置可用于在反應(yīng)室(PCR室)中執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR室被提供樣品多核苷酸，聚合酶，核苷三磷酸，引物和聚合酶鏈反應(yīng)所需的其它試劑，裝置被提供有用于對(duì)反應(yīng)室內(nèi)含物的溫度進(jìn)行溫度控制的工具，以將溫度控制到使雙鏈多核苷酸去雜交，使引物退火，以及使多核苷酸聚合和擴(kuò)增的溫度。
[0007]但是，使常規(guī)的微流體裝置適合地協(xié)調(diào)各種不同的任務(wù)，可能是困難的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]對(duì)于能夠以簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行樣品分析的裝置和方法存在著需求。
[0009]一方面，裝置包括剛性的基體，至少部分覆蓋著基體的撓性覆蓋元件，在基體中形成的第一結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)適于容納液體并適于釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中包含有靶分子(例如結(jié)構(gòu)或室或孔中干燥的緩沖液)，在基體中形成的第二結(jié)構(gòu)(它可以與第一結(jié)構(gòu)不同)，該結(jié)構(gòu)適于容納液體并含有至少一個(gè)結(jié)合元件，該結(jié)合元件適于捕獲靶分子并用于測(cè)定表明靶分子的存在和/或量的值，微流體網(wǎng)路，將至少第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)相互連通，還包括致動(dòng)器元件，適于通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關(guān)閉一部分微流體網(wǎng)路，來實(shí)現(xiàn)第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)之間的流體流動(dòng)。
[0010]另一方面，裝置包括有適于容納液體的結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)結(jié)合元件，并與微流體網(wǎng)路流體連通，以及控制單元，適于控制流體流過微流體網(wǎng)路，由此使得靶分子被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上，適于控制結(jié)構(gòu)中靶分子的擴(kuò)增，并適于控制表明靶分子的存在和/或量并捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物的檢測(cè)。
[0011]另一方面，方法包括將液體容納在含有至少一個(gè)結(jié)合元件并與微流體網(wǎng)路流體連通的結(jié)構(gòu)中，控制流體流過微流體網(wǎng)路，由此使得靶分子被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上，在結(jié)構(gòu)中擴(kuò)增靶分子，以及檢測(cè)能夠表明靶分子的存在和/或量并捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物。
[0012]另一方面，裝置包括有適于容納液體的結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)包括有適于捕獲第一化合物的第一結(jié)合元件，并包括有適于捕獲表明第一化合物的存在和/或量的第二化合物(可以與第一化合物不同)的第二結(jié)合元件(可以與第一結(jié)合元件不同)。
[0013]另一方面，可以提供裝置，其中樣品在控制單元的控制下被指導(dǎo)通過微流體裝置，由此使得可以執(zhí)行預(yù)定的分析任務(wù)。在裝置中，可以提供能夠執(zhí)行幾個(gè)或所有在分析過程中所需的固相結(jié)合過程的中心孔/中心結(jié)構(gòu)(也可以被稱為第二孔或第二結(jié)構(gòu))。在結(jié)構(gòu)(可以白稱為中心孔)中，捕獲樣品的靶分子(出于純化或分離的目的)，擴(kuò)增靶分子(例如通過聚合酶鏈反應(yīng)PCR)，以及執(zhí)行允許獲得與靶分子的存在/不存在或甚至量有關(guān)的信息的(例如光學(xué))檢測(cè)步驟，是可能的。
[0014]因此，可以提供強(qiáng)有力的，全自動(dòng)的生物化學(xué)分析系統(tǒng)，允許以快速準(zhǔn)確的方式，并且不需要過多的人力，獲得生物化學(xué)或醫(yī)學(xué)結(jié)果。例如，使用這樣的裝置，可以定性或定量的方式在患者的全血樣品中檢測(cè)與HIV感染有關(guān)的核酸。
[0015]接下來，將進(jìn)一步解釋裝置和方法的示例性實(shí)施方案。在中心孔中被檢測(cè)的化合物可以是靶分子。為此，可以在中心孔中提供特定的結(jié)合元件(例如與捕獲靶分子所需的結(jié)合元件不同的結(jié)合元件)。靶分子可以與結(jié)合元件結(jié)合。靶分子可以是例如源自于游離的或與細(xì)胞相關(guān)的病毒例如HIV的核酸，包括源自于游離病毒的RNA，源自于細(xì)胞相關(guān)病毒的RNA，前病毒DNA，反轉(zhuǎn)錄的病毒DNA (即病毒復(fù)制的“中間體”)，以及源自于前病毒DNA的轉(zhuǎn)錄本(即通過宿主DNA基因組的轉(zhuǎn)錄獲得的RNA分子)。
[0016]或者，可以提供特定的化合物例如報(bào)告化合物，它們可以與例如PCR產(chǎn)物，RNA或DNA結(jié)合。在這種方案中，報(bào)告化合物可以是被檢測(cè)的，從而允許間接地獲得與樣品中靶分子的存在和/或量有關(guān)的信息的化合物。
[0017]至少一個(gè)結(jié)合元件可以適于捕獲靶分子。例如，至少一個(gè)結(jié)合元件可以包括能夠捕獲復(fù)合物包括靶分子，例如全病毒核酸的標(biāo)記的珠子。
[0018]至少一個(gè)結(jié)合元件可以適于捕獲表明靶分子的存在和/或量的化合物。因此，不僅可以直接檢測(cè)單獨(dú)的個(gè)體靶分子，而且還可能間接地檢測(cè)靶分子，例如通過檢測(cè)捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物。
[0019]至少一個(gè)捕獲元件可以包括適于捕獲靶分子的第一結(jié)合元件，并可以包括適于捕獲指示靶分子的存在和/或量的報(bào)告化合物的第二結(jié)合元件(可以不同于第一結(jié)合元件)。因此，可以提供兩種不同種類的化合物，一種特異性用于在裂解后捕獲靶分子，例如含有特異性針對(duì)靶多核苷酸的區(qū)域的結(jié)合部分以及錨定基團(tuán)的捕獲分子；另一種用于檢測(cè)目的，例如能夠與靶多核苷酸形成復(fù)合物的報(bào)告化合物，其中復(fù)合物與靶多核苷酸形成的復(fù)合物抑制了報(bào)告化合物被第二結(jié)合元件的捕獲。換句話說，捕獲可以與檢測(cè)在功能上去偶聯(lián)。例如，第一結(jié)合元件可以是被構(gòu)成為與含有捕獲分子和靶分子的復(fù)合物結(jié)合，例如通過與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合的珠子，而第二結(jié)合元件可以是能夠捕獲報(bào)告化合物的中心孔的表面。作為第二結(jié)合元件的中心孔的表面可以包含一種或多種不同的報(bào)告化合物特異性捕獲分子，每種都能夠捕獲表面上的報(bào)告化合物。
[0020]結(jié)構(gòu)，即發(fā)生各種不同固相結(jié)合過程的中心元件，可以是孔?！翱住笨梢允窃诨w上形成并提供可以在其中進(jìn)行各種分析過程的樣品室的缺口或凹陷。這樣的孔可以是圓柱形結(jié)構(gòu)或罐形穴，其體積在微升到毫升的量級(jí)上。
[0021]微流體網(wǎng)路可以包含通道或大量相互連通的通道。“通道”可以是指長(zhǎng)度明顯大于寬度和高度的流體結(jié)構(gòu)(例如基本上一維的結(jié)構(gòu))，從而為液體能夠沿著它運(yùn)輸提供了通路?？梢蕴峁﹩我煌ǖ?，或者幾個(gè)通道可以被相互連通而形成通道系統(tǒng)。這樣的通道系統(tǒng)可以允許液體在該系統(tǒng)的分支處從一個(gè)通道流到另一個(gè)通道?？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)孔整合在這樣的通道系統(tǒng)中。
[0022]除了上述的結(jié)構(gòu)例如“中心”結(jié)構(gòu)之外，微流體網(wǎng)路可以包含至少一個(gè)另外的結(jié)構(gòu)。換句話說，除了通道和中心孔之外，可以提供其它的微流體元件，例如其它的通道和/或其它的孔。因此，可以提供孔和通道的復(fù)雜的系統(tǒng)。
[0023]至少一種其它的結(jié)構(gòu)(例如裂解結(jié)構(gòu)或裂解孔)可以適于釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物包括靶分子。因此，這樣的其它結(jié)構(gòu)可以是指裂解室，生物化合物例如細(xì)胞在其中被迫釋放出它們的內(nèi)含物，用于后續(xù)的分析。裂解室可以包括含有執(zhí)行這樣的釋放內(nèi)含物的任務(wù)的生化試劑的結(jié)構(gòu)，從而提供運(yùn)輸?shù)街行目字械男揎椀臉悠?。就此而言，裂解室可以含有裂解試劑，例如離液序列高的鹽，或含有一種或多種裂解細(xì)胞膜和/或病毒衣殼的去污劑的試劑?？蛇x地或此外，另外的結(jié)構(gòu)例如裂解室可以適于加熱樣品以便破壞細(xì)胞膜和/或病毒衣殼(例如通過使用或包含下面描述的溫度控制單元和/或溫度調(diào)節(jié)單元)。
[0024]至少一個(gè)另外的結(jié)構(gòu)也可以包括能夠與靶分子形成復(fù)合物的捕獲探針。因此，在存在帶有錨定基團(tuán)的捕獲分子的情 況下裂解樣品是可能的。
[0025]至少一個(gè)另外的結(jié)構(gòu)(例如含有PCR試劑的孔)可以包括至少一種促進(jìn)靶分子的擴(kuò)增的基體。換句話說，可以提供另外的孔，其中含有促進(jìn)擴(kuò)增所需的生化試劑。盡管PCR試劑可以包含在另外的結(jié)構(gòu)中，但事實(shí)上PCR擴(kuò)增步驟可以在另一個(gè)位置執(zhí)行，例如在中心孔中。正如將在下面更詳細(xì)解釋的，在某些情況下，將樣品從中心孔通過包含擴(kuò)增物質(zhì)的孔再運(yùn)輸返回到中心孔，同時(shí)避免樣品材料的損失，可能是有利的。促進(jìn)擴(kuò)增的物質(zhì)可以是PCR所需的物質(zhì)(例如酶，引物，緩沖液等)，將在下面詳細(xì)描述。
[0026]至少一個(gè)另外的結(jié)構(gòu)也可以是孔。因此，可以提供通過微流體網(wǎng)路連通的多個(gè)孔。但是，在孔之外其它的結(jié)構(gòu)例如通道中進(jìn)行裂解和/或提供擴(kuò)增材料，也是可能的。
[0027]裝置可以包含基體，可以在其上和/或其中形成結(jié)構(gòu)。因此，裝置的流體容納部件可以整體整合在基體中?？蛇x地，結(jié)構(gòu)可以在基體上形成，例如印刷上或點(diǎn)上?？梢耘c撓性覆蓋元件適合地協(xié)同使用的剛性基體材料的例子是聚碳酸酯，聚丙烯，聚苯乙烯，PET,PMMA，聚乙烯，丙烯酸玻璃，PU，PEEK,，PVC,玻璃，等等。
[0028]具體來說，基體可以是剛性的，使得它可以與至少部分覆蓋著基體的撓性覆蓋元件以非常有效的方式協(xié)同使用。具體來說，撓性覆蓋元件可以覆蓋剛性基體，致動(dòng)器可以將覆蓋元件壓向基體，以選擇性關(guān)閉通道(用于執(zhí)行閥功能等)。[0029]按照示例性實(shí)施方案，基體可以具有第一表面以及與第一表面相對(duì)的第二表面。結(jié)構(gòu)可以提供在基體的第一表面(特別是第一主表面)上和/或中。另外的結(jié)構(gòu)可以提供在基體的第二表面(特別是第二主表面)上和/或中。可以提供流體連通結(jié)構(gòu)，特別是透過基體的貫穿孔和/或基體表面部分中的溝槽，將第一表面與第二表面連通。這樣的流體連通結(jié)構(gòu)可以布置在第一和第二表面之間，并且可以被構(gòu)造為在結(jié)構(gòu)與另外的結(jié)構(gòu)之間提供流體連通。在這樣的實(shí)施方案中，可以對(duì)基體的兩個(gè)相對(duì)的主表面進(jìn)行加工，從而形成微流體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可以通過含有沿著基體的表面形成的通道的連通結(jié)構(gòu)連通，也可以直接穿過基體。因此，可以提供其中基體的兩個(gè)主表面部分都可以以非常有效的方式使用的裝置，因?yàn)樵摶w的兩個(gè)主表面都可以被加工以提供液體運(yùn)輸任務(wù)?？蛇x地，這樣的基體可以在一個(gè)或兩個(gè)側(cè)面上用(特別是撓性的)覆蓋元件覆蓋，以允許有效地控制流體流過兩個(gè)表面上的流體結(jié)構(gòu)，例如通過致動(dòng)器作用于一個(gè)或兩個(gè)主表面上的撓性部分。因此，中心基體可以在兩個(gè)側(cè)面上提供有流體結(jié)構(gòu)。具體來說，這可以允許制造由三個(gè)層形成的盒，這三個(gè)層是基體以及兩個(gè)至少部分撓性的覆蓋元件。這樣的三層結(jié)構(gòu)可以具有(例如撓性的)底部元件和(例如撓性的)覆蓋元件，中間夾心有用于容納微流體結(jié)構(gòu)的中間層(例如是剛性的)。底部元件和/或覆蓋元件可以完全覆蓋中心基體，也可以僅僅是部分覆蓋，例如在需要覆蓋功能作為基礎(chǔ)進(jìn)行基于致動(dòng)器的控制的部位(參見例如圖21)。
[0030]除了基體之外，裝置可以包括至少一個(gè)另外的基體，其中在另外的基體上和/或中可以提供另外的結(jié)構(gòu)?；w和另外的基體可以適于彼此之間可以連接，或可以固定，或可以裝配，或可以可逆地或可拆卸地安裝，使得在基體與另外的基體連接或固定或裝配或安裝的操作狀態(tài)下，結(jié)構(gòu)與另外的結(jié)構(gòu)可以變得流體連通。在這樣的實(shí)施方案中，可以提供模塊式構(gòu)造，其中裝置可以通過將幾個(gè)可以彼此可撓性連接的模塊合并起來而形成。相應(yīng)的盒可以通過模塊式構(gòu)造組形成，其中每個(gè)模塊可以具有下面的性質(zhì)，并可以與其它協(xié)同形成的模塊組合使用:
-它包括具有至少兩個(gè)流體通路的室；
-室包括剛性的部件和有彈性的部件；` -至少一個(gè)流體通路可以通過彈性部件的移動(dòng)而關(guān)閉，并可以實(shí)現(xiàn)室的內(nèi)含物的混
口 ο
[0031]至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程中，多個(gè)固相結(jié)合過程發(fā)生在至少一個(gè)結(jié)合元件上。術(shù)語“固相結(jié)合過程”可以具體包括在功能化/結(jié)合元件上任何種類的錨定和雜交等。在本文中，“結(jié)合元件或支持元件”可以包括任何物質(zhì)，被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合的表面或功能化元件，和/或被構(gòu)造為捕獲多核苷酸的表面。固相結(jié)合過程可以包括任何其中被分析或檢測(cè)的分子與固相表面特異性結(jié)合的步驟，也就是說，被分析或檢測(cè)的分子不在溶液中結(jié)合，而是結(jié)合在固體表面上。
[0032]至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程中，所有固相結(jié)合過程都發(fā)生在至少一個(gè)結(jié)合元件上。換句話說，在這樣的實(shí)施方案中，沒有固相結(jié)合過程發(fā)生在中心孔/結(jié)構(gòu)之外的其它孔上。這可以允許在單個(gè)孔中進(jìn)行所有固相結(jié)合過程，使得微型高效的裝置成為可能。至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程中，恰好兩個(gè)固相結(jié)合過程發(fā)生在至少一個(gè)結(jié)合元件上。這兩個(gè)固相結(jié)合過程可以涉及從多組分樣品中捕獲靶分子，以及檢測(cè)指示靶分子的存在或不存在或量的化合物。在所述實(shí)施方案中，這兩個(gè)步驟在單個(gè)孔中進(jìn)行，允許協(xié)同使用孔的供應(yīng)物執(zhí)行這兩個(gè)任務(wù)。將這兩個(gè)任務(wù)合并在一個(gè)孔中，可以保持液體流動(dòng)路徑短，保持裝置小，并保持分析時(shí)間短。
[0033]在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程中，恰好三個(gè)固相結(jié)合過程發(fā)生在至少一個(gè)結(jié)合元件上。這三個(gè)固相結(jié)合過程可以涉及從多組分樣品中捕獲靶分子，捕獲來自于靶核酸的反轉(zhuǎn)錄的核酸，以及檢測(cè)指示靶分子的存在或不存在或量的化合物。在所述實(shí)施方案中，這三個(gè)步驟在單個(gè)孔中進(jìn)行，允許協(xié)同使用孔的供應(yīng)物執(zhí)行所有這些任務(wù)。將這三個(gè)任務(wù)合并在一個(gè)孔中，可以保持液體流動(dòng)路徑短，保持裝置小，并保持分析時(shí)間短。
[0034]可選地，至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，以便在樣品中靶分子的分析過程中，恰好一個(gè)固相結(jié)合過程發(fā)生在至少一個(gè)結(jié)合元件上。當(dāng)全部生化分析或?qū)嶒?yàn)只包括單個(gè)固相結(jié)合過程，例如僅僅是為了樣品純化進(jìn)行預(yù)先觀察而不是為了檢測(cè)時(shí)，這樣的實(shí)施方案可能是特別有利的。
[0035]位于至少一個(gè)結(jié)合元件附近的裝置的至少一部分可以透過波長(zhǎng)范圍在大約I nm到大約10 μ m之間的電磁輻射，以便能夠?qū)Ρ砻靼蟹肿拥拇嬖诤?或量并捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物進(jìn)行基于電磁輻射的檢測(cè)。在這種實(shí)施方案中，基體的特別是靠近中心孔的部分可以透過用于檢測(cè)目的的電磁輻射，特別是在近紅外，可見光和/或紫外波長(zhǎng)范圍中的電磁輻射。因此,在中心孔中，在電磁輻射的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢測(cè)(例如基于熒光的檢測(cè))是可能的。當(dāng)裝置位于至少一個(gè)結(jié)合元件附近的部分可以透過波長(zhǎng)范圍在大約400 nm到大約800 nm之間的電磁輻射時(shí)，能夠進(jìn)行化合物的光學(xué)檢測(cè)。
[0036]裝置可以包括溫度操縱單元或可以與溫度操縱單元相連，該溫度操縱單元適于操縱位于結(jié)構(gòu)中的液體的溫度。這樣的溫度操縱單元可以包括加熱和/或冷卻元件，允許將樣品帶到特定的溫度，或執(zhí)行特定的溫度組合形式或順序。
[0037]溫度操縱單元可以 被改造，以按照?qǐng)?zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的溫度順序操縱位于結(jié)構(gòu)中的液體的溫度。這樣的聚合酶鏈反應(yīng)可能需要溫度循環(huán)，例如大約95°C，大約55°C和大約72°C。該順序可以執(zhí)行特定的預(yù)定時(shí)間間隔，并且可以重復(fù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。
[0038]至少一個(gè)結(jié)合元件可以被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合。具體來說，至少一個(gè)結(jié)合元件可以被構(gòu)造為捕獲多核苷酸。
[0039]至少一個(gè)結(jié)合元件可以包括選自捕獲分子(例如布置在結(jié)構(gòu)的表面上(例如固定在孔中)的報(bào)告化合物特異性捕獲分子)，布置在粒子上(例如珠子上)的捕獲分子，布置在結(jié)構(gòu)的多孔表面(例如多孔玻璃結(jié)構(gòu))上的捕獲分子中的至少一個(gè)，以及一種或多種不同的捕獲分子(例如布置在結(jié)構(gòu)的表面上不同位置的報(bào)告化合物特異性捕獲分子(例如不同種類的捕獲分子以陣列似的方式固定在孔中，例如在關(guān)于競(jìng)爭(zhēng)性分析的文本中))。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)結(jié)合元件也可以包括用于捕獲錨定基團(tuán)例如生物素的捕獲分子。
[0040]結(jié)構(gòu)可以具有大約I μ L到大約I mL之間的體積，特別是大約20 μ L到大約300μ L之間。例如，可以提供具有大約100 μ L體積的孔。
[0041]基體可以具有成形成以接受插管，為裝置供應(yīng)液體的溝槽。在這樣的實(shí)施方案中，對(duì)于用戶來說操縱裝置可能是非常容易的，因?yàn)橹恍枰獙⒂糜跇悠饭?yīng)的插管放置在溝槽中，與微流體通道系統(tǒng)適合地匹配和協(xié)作，從而允許進(jìn)行容易的分析，甚至即使是沒有特別的經(jīng)驗(yàn)或訓(xùn)練過的用戶也可以進(jìn)行。[0042]基體可以在結(jié)構(gòu)附近具有窗口部分，可以透過波長(zhǎng)范圍在大約I nm到大約10 μπι之間的電磁輻射(也就是說近紅外，可見光或紫外輻射)，特別是波長(zhǎng)范圍在基本上400 nm到基本上800 nm之間的電磁輻射(具體來說是可見光輻射)，從而允許流過(更準(zhǔn)確來說到達(dá))結(jié)構(gòu)或微流體網(wǎng)路的液體的彎月液面的基于電磁輻射的檢測(cè)。在這樣的實(shí)施方案中，基體的透光的窗口部分可以通過輻射檢測(cè)器檢測(cè)。當(dāng)泵抽通過微流體網(wǎng)路或結(jié)構(gòu)的流體的彎月液面通過窗口部分時(shí)，通過窗口部分的傳播性質(zhì)可以特征性的方式急劇改變，從而在輻射檢測(cè)器上產(chǎn)生表明彎月液面已經(jīng)到達(dá)裝置中的特定位置的信號(hào)。該信號(hào)可用于觸發(fā)目的，或作為致動(dòng)器的控制信號(hào)，因?yàn)橹聞?dòng)器的協(xié)同移動(dòng)和/或溫度操縱單元的控制可以適合按照被泵抽通過裝置的樣品的當(dāng)前位置來產(chǎn)生。例如，通過采取這樣的措施，當(dāng)發(fā)生溢流時(shí)，可以檢測(cè)到預(yù)定體積的水或緩沖液已經(jīng)被泵抽進(jìn)入裝置中。
[0043]結(jié)構(gòu)和另外的結(jié)構(gòu)構(gòu)成的至少一個(gè)可以包括兩個(gè)流體開口。這樣的流體開口可以是流體入口和流體出口。
[0044]覆蓋元件可以是撓性的覆蓋元件。特別是與剛性基體配合時(shí)，覆蓋元件和基體可以形成在三維空間上密封的通道，可以通過作用于覆蓋元件上的致動(dòng)器適合地控制。當(dāng)覆蓋元件的特定位置在外部力量的影響下至少部分可變形時(shí)，通過打開或關(guān)閉結(jié)構(gòu)或微流體網(wǎng)路選擇性地使液體能夠或不能流動(dòng)，是可能的。除此之外，使用這樣的覆蓋元件，沿著結(jié)構(gòu)運(yùn)輸液體是可能的。[0045]特別是當(dāng)提供了致動(dòng)器元件并將其改造成被致動(dòng)時(shí)能夠使覆蓋元件變形時(shí)，可以提供整合有混合，泵抽和/或閥功能的高性能芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-chip)。
[0046]任何一個(gè)結(jié)構(gòu)可以含有一種或多種具有生物學(xué)，生物化學(xué)和/或化學(xué)活性的物質(zhì)。因此，當(dāng)這樣的物質(zhì)，可以包括捕獲分子，報(bào)告化合物特異性捕獲分子，可檢測(cè)標(biāo)記物，裂解試劑和PCR試劑，以干燥的形式，特別是冷凍干燥的形式存在于孔中時(shí)，提供用戶只需要用液體(例如水，緩沖液和樣品)進(jìn)行填充就可以進(jìn)行全自動(dòng)分析的裝置，是可能的。當(dāng)必需的生化成分被提供在不同的孔中時(shí)，用戶可以簡(jiǎn)單地基于儲(chǔ)存在控制單元中的順序來開始實(shí)驗(yàn)，并可以將水或緩沖液提供給不同的輸入室。其余部分將由全自動(dòng)裝置來執(zhí)行。
[0047]通道可以具有大約50 μ m到大約I mm之間，特別是大約100 μπι到大約300 μπι之間的寬度(即是在基體的表面平面中垂直于流體流動(dòng)方向上的維度)。例如，通道的寬度可以是大約200 μ m。通道的高度(在垂直于基體的表面平面并垂直于流體流動(dòng)方向的方向上的維度)可以在大約20 μπι到大約300 μ m，特別是大約50 μπι到大約200 μπι之間的范圍內(nèi)。例如，通道的高度可以是大約100 μπι。與此相比，通道的長(zhǎng)度可以遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于寬度和高度，例如可以大于I _，具體來說可以大于I Cm，或甚至可以是幾厘米。
[0048]結(jié)構(gòu)可以包括適合用作液體的運(yùn)輸介質(zhì)的材料。例如,材料可以包含固體材料,凝膠材料，液體材料中的至少一種及其組合。因此，結(jié)構(gòu)可以是凹陷，或可以由用作液體的載體的材料而形成。
[0049]覆蓋元件可以包括撓性的膜或撓性的密封件。這樣的撓性膜或撓性密封件可以由例如乳膠這樣的材料制成，從而使得覆蓋元件可以在機(jī)械力(例如由致動(dòng)器元件產(chǎn)生的)的影響下?lián)闲缘刈冃巍?br> [0050]裝置可以包括適合于被致動(dòng)以使得覆蓋元件變形的致動(dòng)器元件，從而控制結(jié)構(gòu)和/或微流體網(wǎng)路中液體的流體流動(dòng)性質(zhì)。這樣的致動(dòng)器元件可以在控制單元的控制之下，可以具有多個(gè)協(xié)同作用于撓性覆蓋元件上的銷針(Pin)或型板，從而選擇性打開或關(guān)閉通道，出于泵抽或混合目的暫時(shí)減小通道或孔的體積，等等。
[0051]具體來說，致動(dòng)器元件可以被改造適于控制沿著通道的直線部分的液體的流體流動(dòng)性質(zhì)。當(dāng)流體沿著直線通道流動(dòng)時(shí)，當(dāng)該通道在特定部分被關(guān)閉時(shí)，垂直布置的致動(dòng)器元件可以有效地使流體不能流動(dòng)。
[0052]致動(dòng)器元件可以被改造以用作閥，用作流體混合器，和/或用作流體泵。
[0053]更具體來說，致動(dòng)器元件可以包括多個(gè)被改造適合于被協(xié)同致動(dòng)使得覆蓋元件變形的致動(dòng)器元件，從而按照控制單元確定的流體流動(dòng)方案控制液體的流體流動(dòng)性質(zhì)。因此，當(dāng)用戶選擇了包括通過各種不同通道運(yùn)輸流體和樣品的特定的實(shí)驗(yàn)或分析方法時(shí)，控制單元簡(jiǎn)單地控制致動(dòng)器元件的各個(gè)型板，提供撓性覆蓋元件的這種可逆的壓縮，從而完全自動(dòng)地執(zhí)行分析。
[0054]控制單元可以被改造適于控制致動(dòng)器元件將覆蓋元件變形的方式，使得靶分子被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上，使得靶分子在結(jié)構(gòu)中被擴(kuò)增，并使得指示靶分子的存在和/或量并捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物被檢測(cè)。因此，控制單元可以是裝置的中央調(diào)節(jié)器，協(xié)調(diào)各個(gè)不同部件的功能。
[0055]致動(dòng)器元件可以包括一個(gè)或多個(gè)銷針，它們被構(gòu)造為往復(fù)地，例如交替在向前和向后方向上移動(dòng)。通過在向前方向上移動(dòng)銷針，可以通過在通道中將撓性覆蓋元件壓向基體而關(guān)閉該通道。當(dāng)銷針向后移動(dòng)時(shí)，通道可以被再次打開，允許流體流動(dòng)。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)銷針可以具有至少部分彈性的尖端。
[0056]致動(dòng)器元件還可以被提供成可在垂直于基體的主表面的方向上移動(dòng)。通過在垂直于平面基體的方向上往復(fù)移動(dòng)，有效地打開和關(guān)閉成為可能。特別是，致動(dòng)器元件可以被提供成可移動(dòng)的，以選擇性關(guān)閉至 少一部分結(jié)構(gòu)，使得液體不能通過結(jié)構(gòu)進(jìn)行運(yùn)輸。在另一種操作模式下，致動(dòng)器元件可以被移動(dòng)，以選擇性打開至少一部分結(jié)構(gòu)，使得液體能夠運(yùn)輸通過結(jié)構(gòu)。
[0057]致動(dòng)器元件可以改造成垂直于基體的主表面往復(fù)移動(dòng)，來選擇性地使液體能夠或不能流動(dòng)流體通過結(jié)構(gòu)。使用往復(fù)的致動(dòng)器可以允許流體可逆地和選擇性地能夠或不能流動(dòng)，允許非常靈活地操作裝置，并允許多次使用裝置(與其中通道被不可逆關(guān)閉以執(zhí)行單向閥功能的方法相反)。
[0058]致動(dòng)器元件可以適于在垂直于基體的主表面的方向上往復(fù)移動(dòng)，以將液體泵抽通過結(jié)構(gòu)。因此，通過致動(dòng)器元件控制結(jié)構(gòu)的體積或高度是可能的。致動(dòng)器元件還可以選擇性關(guān)閉結(jié)構(gòu)。關(guān)閉結(jié)構(gòu)可以在閥功能，混合功能或泵抽功能的背景下進(jìn)行。但是，在檢測(cè)階段使用這樣的致動(dòng)器也是可能的，因?yàn)槌鲇跈z測(cè)的目壓縮結(jié)構(gòu)和/或結(jié)合元件以增加被檢測(cè)的靶分子的局部濃度，和/或除去背景信號(hào)，是可能的。這可以允許增加準(zhǔn)確性。
[0059]可以提供驅(qū)動(dòng)單元以機(jī)械驅(qū)動(dòng)致動(dòng)器元件，其中驅(qū)動(dòng)單元可以通過控制單元控制。這樣的驅(qū)動(dòng)單元可以包括氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，液力驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)或電磁驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。
[0060]至少一個(gè)結(jié)合元件可以包括三維的介質(zhì)，例如粒子，珠子或多孔基質(zhì)。三維介質(zhì)可以布置和構(gòu)造為可以通過移動(dòng)致動(dòng)器元件可逆地壓縮。通過采取這樣的措施，有可能進(jìn)行非常準(zhǔn)確的檢測(cè)，因?yàn)楸粰z測(cè)的分子的局部濃度，可以通過將其上已經(jīng)結(jié)合有指示靶分子的存在或量的化合物或復(fù)合物的三維介質(zhì)(例如珠子)進(jìn)行壓縮來選擇性增加。[0061]裝置可以適于生物傳感器分析裝置，微流體盒或芯片實(shí)驗(yàn)室。因此，在小規(guī)模上，各種不同的生化功能可以被合并，以進(jìn)行完整的生化實(shí)驗(yàn)。
[0062]可以提供溫度傳感器，并被改造適于感應(yīng)運(yùn)輸通過裝置的液體的溫度。溫度傳感器可以整合在基體中，從而感應(yīng)流過微流體網(wǎng)路的液體的溫度?？蛇x地，溫度傳感器可以布置在致動(dòng)器元件上，例如在型板類致動(dòng)器的尖端上，以便當(dāng)將覆蓋元件壓向基體時(shí)，致動(dòng)器可以同時(shí)測(cè)量流體的局部溫度。
[0063]裝置可以包括適于操作液體的溫度的溫度操縱單元，它優(yōu)選布置在致動(dòng)器元件上。這樣的溫度操縱單元也可以整合在基體中，例如以電熱絲的形式整合在基體中，并加熱孔中的樣品?；蛘?，這樣的溫度操縱單元可以是外部裝置，例如外部電磁輻射源，其中電磁輻射(例如來自激光器)可以被導(dǎo)入孔中，導(dǎo)致使用電磁輻射作為能量源加熱孔中的流體。此外可選地，溫度操縱單元可以不包括或不僅僅包括加熱元件，還可以包括冷卻元件。對(duì)于這樣的實(shí)施方案來說，可以不費(fèi)力地使用珀耳帖致冷器(Peltier cooler).[0064]可以提供溫度操縱單元并改造為適于操作液體的溫度，其中溫度操縱單元可以包含第一加熱元件和第二加熱元件，結(jié)構(gòu)被布置在第一加熱元件和第二加熱元件之間。通過提供這樣的兩個(gè)加熱板，一個(gè)是連續(xù)的板，另一個(gè)是環(huán)形板，可以在使裝置仍然能夠使用基于電磁輻射的檢測(cè)器操作的情況下進(jìn)行加熱，因?yàn)榄h(huán)形板中的凹陷可以使電磁輻射被導(dǎo)入到中心孔中，并允許通過凹陷和第二加熱元件檢測(cè)熒光輻射。
[0065]可以提供溫度調(diào)控單元，并被改造為適于調(diào)控結(jié)構(gòu)中液體的溫度。這樣的調(diào)控實(shí)體可以包括測(cè)量實(shí)際溫度，以及在該測(cè)量的基礎(chǔ)上進(jìn)行加熱和/或冷卻行為，從而將溫度調(diào)節(jié)到所需的值。
[0066]可以提供檢測(cè)單元并被改造為適于檢測(cè)結(jié)構(gòu)中指示靶分子的存在和/或量，并捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物。這樣的檢測(cè)單元可以包括光學(xué)檢測(cè)單元，特別是熒光檢測(cè)單元。
[0067]基體和覆蓋元件可以是分別的元件，它們彼此相連。或者，基體和覆蓋元件可以由不同材料制成。
[0068]可以提供運(yùn)輸單元，并被改造為適于運(yùn)輸液體通過結(jié)構(gòu)和/或微流體網(wǎng)路。這樣的運(yùn)輸單元可以包括泵，特別是壓縮空氣泵，液壓泵，蠕動(dòng)泵和真空泵中的一個(gè)。此外，裝置可以被改造，使得在正常使用時(shí)，重力促使液體以所需的方式流過裝置。因此，在運(yùn)輸單元不活動(dòng)時(shí)，液體可以直接按所需方向流動(dòng)。但是，當(dāng)運(yùn)輸單元打開時(shí)，運(yùn)輸單元的影響可以超過重力的影響，從而允許選擇性地起始與重力相反方向的流體流動(dòng)。因此，重力與特定運(yùn)輸單元的組合可能是非常有利的，可以允許節(jié)能運(yùn)作。
[0069]運(yùn)輸單元可以被改造適于通過驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)和/或微流體網(wǎng)路中的氣泡來運(yùn)輸液體。通過將氣泡移動(dòng)通過裝置，可以支持或促進(jìn)液體運(yùn)輸通過裝置。
[0070]至少一個(gè)過濾器，特別是至少一個(gè)熔融玻璃過濾器，可以布置在結(jié)構(gòu)上(也就是說在中心孔的入口和/或出口處)，可以被改造適于防止布置在結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)結(jié)合元件(例如珠子)從結(jié)構(gòu)中被洗出。在流體流動(dòng)的影響下，機(jī)械力可以作用在結(jié)構(gòu)中的珠子或其它結(jié)合元件上。但是，當(dāng)在結(jié)構(gòu)的入口和/或出口處提供熔融玻璃過濾器，即由燒結(jié)材料制成的多孔過濾元件時(shí)，可以安全地阻止珠子被洗出中心室。熔融玻璃過濾器可以被提供為環(huán)形形狀，允許被插入到裝置中相應(yīng)形狀的環(huán)形溝槽中。[0071]至少一個(gè)結(jié)合元件可以包括表面功能化。術(shù)語“表面功能化”可以是指表面被加工處理成可以進(jìn)行特定的結(jié)合功能這個(gè)事實(shí)。在這樣的實(shí)施方案中，結(jié)合元件可以是孔的表面的一部分，或連接或結(jié)合到孔的表面上。
[0072]基體和覆蓋元件可以彼此直接接觸?；蛘撸w可以不與覆蓋元件直接接觸。各種不同的幾何構(gòu)型都可能實(shí)現(xiàn)。
[0073]基體的位于結(jié)構(gòu)附近的一部分可以透過波長(zhǎng)范圍在大約400 nm到大約800 nm之間的電磁輻射，從而允許在結(jié)構(gòu)中進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。因此，可見光可用于檢測(cè)目的。這樣的檢測(cè)可以在光吸收，光反射或熒光的產(chǎn)生的基礎(chǔ)上進(jìn)行，例如使用與被檢測(cè)的分子或復(fù)合物結(jié)合的熒光標(biāo)記物。
[0074]至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，使得在靶分子的分析過程中，至少兩個(gè)固相結(jié)合過程發(fā)生在至少一個(gè)結(jié)合元件的恰好一個(gè)上。換句話說，同一個(gè)結(jié)合元件可用于多個(gè)固相結(jié)合過程。例如，帶有結(jié)合基團(tuán)的珠子可用于將靶分子捕獲出樣品，并且隨后可用于捕獲化合物例如被擴(kuò)增的和標(biāo)記的靶分子，作為后續(xù)檢測(cè)的基礎(chǔ)。
[0075]或者，至少一個(gè)結(jié)合元件可以被改造，使得在靶分子的分析過程中，至少兩個(gè)固相結(jié)合過程發(fā)生在不同的至少一個(gè)結(jié)合元件上。在這樣的構(gòu)造中，例如一方面從樣品捕獲分子，另一方面檢測(cè)表明靶分子的成分，是使用兩種不同的結(jié)合元件來捕獲的。例如，可以提供珠子用于將靶分子捕獲出樣品。另一方面，可以在競(jìng)爭(zhēng)性分析的情況下使用捕獲分子，例如固定在孔中的報(bào)告化合物特異性捕獲分子，以捕獲表明樣品中靶分子的存在或量的成分，例如報(bào)告化合物。
[0076]另一種情況下，方法包括了形成復(fù)合物，每種復(fù)合物含有靶核酸和捕獲分子，其中每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶核酸的區(qū)域的結(jié)合部分，以及錨定基團(tuán)；將復(fù)合物與結(jié)合元件相接觸，結(jié)合元件被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，從而將復(fù)合物結(jié)合在結(jié)合元件上；對(duì)一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增；將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上；以及測(cè)定表明被捕獲的祀分子的存在和/或量的值。`
[0077]—或多種靶核酸可以是單鏈或雙鏈核酸。
[0078]方法還可以包括在將一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前將靶核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0079]方法還可以包括將捕獲的被擴(kuò)增的靶核酸從結(jié)合元件上釋放，并重復(fù)將一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟。在這樣的實(shí)施方案中，從結(jié)合元件上釋放被捕獲的擴(kuò)增的靶核酸，以及重復(fù)將一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟的循環(huán)，可以進(jìn)行至少10次或至少20次。
[0080]表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值可以在至少一個(gè)循環(huán)后測(cè)定，例如在每個(gè)從結(jié)合元件上釋放被捕獲的擴(kuò)增的靶核酸，以及重復(fù)將一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟的循環(huán)之后。
[0081]結(jié)合元件可以包括一個(gè)或多個(gè)能夠捕獲靶核酸的捕獲分子。在這樣的實(shí)施方案中，靶核酸被一個(gè)或多個(gè)捕獲分子捕獲到相應(yīng)的結(jié)合元件上。結(jié)合元件還可以包含粒子。
[0082]形成包含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物的步驟的進(jìn)行，可以與將復(fù)合物與結(jié)合元件相接觸的步驟在空間上分開。
[0083]方法還可以包括對(duì)靶核酸進(jìn)行標(biāo)記。在例如將一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前或期間，和/或在將擴(kuò)增的靶核酸捕獲到相應(yīng)的結(jié)合元件上之前，可以通過加入一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記物對(duì)靶核酸進(jìn)行標(biāo)記。一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記物可以是熒光標(biāo)記物。
[0084]表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定，可以包括對(duì)獲得的一個(gè)或多個(gè)指示值進(jìn)行時(shí)間依賴性的監(jiān)測(cè)。
[0085]方法還可以包括在形成包含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物之前，提供一或多種靶核酸。提供一或多種靶核酸的步驟可以包括從生物學(xué)材料上釋放靶核酸。在這樣的實(shí)施方案中，生物學(xué)材料可以選自一種或多種原核細(xì)胞，一種或多種真核細(xì)胞，一種或多種紅細(xì)胞，以及一種或多種病毒粒子，以及它們的混合物。此外，從生物學(xué)材料中釋放靶核酸可以包括將生物學(xué)材料與裂解試劑相接觸。
[0086]提供一或多種靶核酸可以包括提供含有一或多種靶核酸的樣品，其中樣品可以選自全血，血漿，血清,尿液,痰液,唾液和腦脊髓液。
[0087]提供一或多種靶核酸可以與含有靶分子和捕獲分子的復(fù)合物的接觸步驟，對(duì)一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的步驟，將擴(kuò)增的靶核酸捕獲到相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟，以及測(cè)定表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的步驟，在空間上分開進(jìn)行。
[0088]方法還可以包括將一或多種靶核酸與并存的材料分離開。
[0089]在其它的實(shí)施方案中，示例性實(shí)施方案的方法在上面描述的裝置中進(jìn)行。例如，方法可以在裝置中進(jìn)行，該裝置包括剛性基體；至少部分覆蓋了基體的撓性覆蓋元件；在基體中形成的第一結(jié)構(gòu)，被改造為適于容納液體，并被改造為適于釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中包含有靶分子，例如靶核酸；在基體上形成的第二結(jié)構(gòu)，被改造為適于容納液體并包括至少一個(gè)結(jié)合元件，該結(jié)合元件被改造為適于捕獲靶分子并被改造為適于測(cè)定表明靶分子的存在和/或量的值；微流體網(wǎng)路，將至少第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)相互連通；以及致動(dòng)器單元，被改造為適于通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關(guān)閉一部分微流體網(wǎng)路，來實(shí)現(xiàn)第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)之間的流體流動(dòng)。此外，方法可以在裝置中進(jìn)行，該裝置包括被改造為適于容納液體的結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)結(jié)合元件，并與微流體網(wǎng)路流體連通；以及控制單元，被 改造為適于控制流體流過微流體網(wǎng)路的方式，使得靶分子例如靶核酸被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上，被改造為適于控制結(jié)構(gòu)中的靶分子的擴(kuò)增，并被改造為適于控制被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物的檢測(cè)。
[0090]裝置可以包括被改造為適于容納液體的第一結(jié)構(gòu)。在這樣的實(shí)施方案中，包括靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物在第一結(jié)構(gòu)中形成。
[0091 ] 此外，裝置可以包括第二結(jié)構(gòu)，它被構(gòu)造用于檢測(cè)一或多種靶核酸，含有覆蓋著第二孔的覆蓋元件，以及適于被驅(qū)動(dòng)使得覆蓋元件變形的致動(dòng)器單元。在這樣的實(shí)施方案中，表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定，可以在第二結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。
[0092]此外，將一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和/或?qū)U(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上，也可以在第二結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。
[0093]使用被致動(dòng)的致動(dòng)器使得覆蓋元件變形，可以進(jìn)行表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定。覆蓋元件可以被變形，使得檢測(cè)孔的體積減小。在這樣的實(shí)施方案中，在測(cè)定表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值之后，第二孔的體積可以被重新增加。
[0094]按照本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案，提供了方法，該方法包括:提供一定量報(bào)告化合物；第一結(jié)合元件被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合；第二結(jié)合元件能夠捕獲報(bào)告化合物；一定量的靶核酸能夠與報(bào)告化合物形成復(fù)合物；與報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了報(bào)告化合物被第二結(jié)合元件的捕獲；一定量的捕獲分子，其中每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶核酸的區(qū)域的結(jié)合部分以及錨定基團(tuán)；形成包含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物；將復(fù)合物與第一結(jié)合元件相接觸，將復(fù)合物結(jié)合到第一結(jié)合元件上；從第一結(jié)合元件上釋放出至少一部分量的祀核酸；形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的祀核酸的復(fù)合物；將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上；以及測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。
[0095]報(bào)告化合物可以含有一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記。一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記。此外，報(bào)告化合物可以是寡核苷酸。
[0096]方法還可以包括根據(jù)表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，來確定表明靶核酸的存在和/或量的值。
[0097]方法還可以包括在測(cè)定了表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值之后，將剩余部分量的報(bào)告化合物從第二結(jié)合元件上釋放出來；形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸的復(fù)合物；將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上；以及測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。在這樣的實(shí)施方案中，釋放，形成復(fù)合物，捕獲和測(cè)定的步驟可以進(jìn)行額外的N次，其中N是大于或等于I的整數(shù)，例如N≥5，N≥10或N≥20。
[0098]此外，一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟，可以伴隨進(jìn)行。
[0099]方法還可以包括將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。在這樣的實(shí)施方案中，靶核酸的擴(kuò)增可以在形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸的復(fù)合物的步驟之前開始。
[0100]表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，可以在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟達(dá)到化學(xué)平衡之前進(jìn)行測(cè)定。具體來說，表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，可以在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟開始后I秒到120秒時(shí)進(jìn)行測(cè)定。
[0101]方法還可以包括在將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前對(duì)它們進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0102]第二結(jié)合元件可以包括能夠?qū)?bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的一種或多種不同的報(bào)告化合物特異性捕獲分子。捕獲分子可以是寡核苷酸。不同的報(bào)告化合物特異性捕獲分子可以布置在相應(yīng)的第二結(jié)合元件的不同位置上。此外，報(bào)告化合物可以通過與報(bào)告化合物特異性捕獲分子形成復(fù)合物而捕獲在第二結(jié)合元件上。報(bào)告化合物能夠與靶核酸形成復(fù)合物的相互作用位點(diǎn)的至少一部分，也能夠與報(bào)告化合物特異性捕獲分子形成復(fù)合物。報(bào)告化合物特異性捕獲分子和靶核酸可以競(jìng)爭(zhēng)與報(bào)告化合物形成復(fù)合物。
[0103]擴(kuò)增可以包括變性雙鏈核酸的步驟。雙鏈核酸可以包括報(bào)告化合物與靶核酸的復(fù)合物，報(bào)告化合物與報(bào)告化合物特異性捕獲分子的復(fù)合物，雙鏈的報(bào)告化合物和雙鏈的靶核酸。
[0104]擴(kuò)增還可以包括將引物分子與靶核酸退火的步驟。在該實(shí)施方案中，退火步驟可以與一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，和/或?qū)]有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟相伴進(jìn)行。
[0105]擴(kuò)增可以是循環(huán)式的擴(kuò)增，例如PCR。PCR的進(jìn)行可以包括使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。循環(huán)式擴(kuò)增可以包括至少10個(gè)循環(huán)或至少20個(gè)循環(huán)。
[0106]表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，可以在至少一個(gè)循環(huán)后進(jìn)行測(cè)定，例如在循環(huán)式擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)后。此外，表明靶核酸的存在和/或量的值，可以在每次表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值被測(cè)定之后進(jìn)行測(cè)定。
[0107]表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，可以包括指示值的時(shí)間依賴性監(jiān)測(cè)。
[0108]此外，表明靶核酸的存在和/或量的值，可以根據(jù)將表明報(bào)告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸的存在和/或量的值相關(guān)聯(lián)的校正曲線來確定。
[0109]方法也可以在上述的裝置中進(jìn)行。例如，方法可以在裝置中進(jìn)行，該裝置包括剛性基體；至少部分覆蓋了基體的撓性覆蓋元件；在基體中形成的第一結(jié)構(gòu)，適于容納液體，并適于釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中包含靶核酸；在基體上形成的第二結(jié)構(gòu)，適于容納液體并含有至少一個(gè)結(jié)合元件，該結(jié)合元件適于捕獲靶核酸并適于測(cè)定表明靶核酸的存在和/或量的值；微流體網(wǎng)路，將至少第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)相互連通；以及致動(dòng)器單元，適于通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關(guān)閉一部分微流體網(wǎng)路，來實(shí)現(xiàn)第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)之間的流體流動(dòng)。方法也可以在裝置中進(jìn)行，該裝置包括適于容納液體的的結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)結(jié)合元件，并與微流體網(wǎng)路流體連通；以及控制單元，適于控制流體流過微流體網(wǎng)路，使得靶核酸被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上，適于控制結(jié)構(gòu)中的靶分子的擴(kuò)增，并適于控制被捕獲在`至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物的檢測(cè)。
[0110]裝置還可以包含適于容納液體的第一結(jié)構(gòu)。在這樣的實(shí)施方案中，含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物的形成在第一結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。
[0111]此外，裝置可以包含適于容納液體的第二結(jié)構(gòu)，在第二結(jié)構(gòu)中可以提供第一以及可選的第二結(jié)合元件。在這樣的實(shí)施方案中，形成含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物；將復(fù)合物與第一結(jié)合元件相接觸，以將復(fù)合物結(jié)合到第一結(jié)合元件上；從第一結(jié)合元件上釋放至少一部分量的祀核酸；形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的祀核酸的復(fù)合物；將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上；以及測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，在第二結(jié)構(gòu)例如中心孔中進(jìn)行。
[0112]提供一或多種靶核酸可以包括提供含有一或多種靶核酸的樣品。樣品可以是體積為I μ L到50 μ L的液體樣品。此外,樣品可以是液體全血樣品。
[0113]在另一方面，方法包括擴(kuò)增至少一種靶多核苷酸以形成雙鏈擴(kuò)增子，將擴(kuò)增子與被構(gòu)造為能夠選擇性結(jié)合擴(kuò)增子的表面相接觸，使擴(kuò)增子通過錨定基團(tuán)結(jié)合到表面上，可選地測(cè)定擴(kuò)增子的存在。方法還可以包括在可選的檢測(cè)步驟后將擴(kuò)增子從表面上釋放，將釋放出的擴(kuò)增子進(jìn)行另外至少一輪擴(kuò)增循環(huán)，將獲得的擴(kuò)增子與表面相接觸，使擴(kuò)增子通過錨定基團(tuán)結(jié)合到表面上，可選地測(cè)定擴(kuò)增子的存在。方法還可以包括進(jìn)行釋放，進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，接觸和可選的測(cè)定的步驟N次，其中N是大于或等于I的整數(shù)。特別是N >5，更特別是N≥10，更特別是N≥20。
[0114]方法還可以包括在擴(kuò)增步驟之前，提供靶多核苷酸，形成含有從病原體釋放出的靶多核苷酸和至少一個(gè)捕獲分子的復(fù)合物，每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶多核苷酸的區(qū)域的結(jié)合部分和錨定基團(tuán)，以及將復(fù)合物與表面相接觸，表面被構(gòu)造為非選擇性地與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，從而將復(fù)合物與表面非選擇性地結(jié)合。在這樣的方法中，提供多核苷酸可以包括釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中包含靶多核苷酸。釋放的步驟可以包括將含有一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的樣品與裂解試劑和捕獲分子相接觸。將樣品與裂解試劑和捕獲分子相接觸的步驟可以包括將樣品與冷凍干燥形式的裂解試劑和捕獲分子相接觸。
[0115]在這樣的方法中，提供靶多核苷酸的步驟可以包括提供相伴的材料，方法還可以包括分離表面結(jié)合的復(fù)合物和相伴的材料。在這樣的方法中，相伴的材料可以包括多核苷酸從中釋放出來的至少一種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物。表面可以是粒子的表面。
[0116]在另一方面，方法包括提供一或多種靶多核苷酸，形成含有靶多核苷酸和至少一種捕獲分子的復(fù)合物，每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶多核苷酸的區(qū)域的結(jié)合部分和錨定基團(tuán)，以及將復(fù)合物與表面相接觸，表面被構(gòu)造為非選擇性地與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，從而將復(fù)合物與表面非選擇性地結(jié)合。在這樣的方法中，提供的步驟可以包括釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中包含多核苷酸。方法還可以包括將表面結(jié)合的復(fù)合物與從一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒釋放出的其它內(nèi)含物分離開來。
[0117]在另一方面，方法包括形成含有一定量報(bào)告化合物，能夠捕獲報(bào)告化合物的結(jié)合元件，以及一定量能夠與報(bào)告化合物形成復(fù)合物的靶核酸的物質(zhì)的組合物，與報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了結(jié)合元件對(duì)報(bào)告化合物的捕獲；形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸的復(fù)合物；將沒有與靶核酸復(fù)合的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上；以及測(cè)定捕獲在結(jié)合元件上的表明報(bào)告化合物的存在和/或量的值。
[0118]換句話說，方法可以包 括 允許一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物，并允許沒有與靶核酸形 成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物被捕獲在結(jié)合元件上。
[0119]方法可以在選自生物傳感器分析裝置，微流體盒和芯片實(shí)驗(yàn)室的裝置中進(jìn)行。
[0120]在某些實(shí)施方案中，方法還包括在表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的基礎(chǔ)上測(cè)定表明靶核酸的存在和/或量的值。表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，可以包括指示值的時(shí)間依賴性的監(jiān)測(cè)。在具體的實(shí)施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值，是根據(jù)將表明報(bào)告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸的存在和/或量的值相關(guān)聯(lián)的校正曲線來確定的。
[0121]在其它實(shí)施方案中，方法還包括在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物，將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上，以及測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的步驟之后，從結(jié)合元件上釋放剩余部分量的報(bào)告化合物。
[0122]釋放，形成復(fù)合物，捕獲以及確定表明靶核酸的存在和/或量的值的步驟，可以進(jìn)行另外的N次，其中N是大于或等于I的整數(shù)。在具體的實(shí)施方案中，N≤5，≤10或≤20。
[0123]方法在形成復(fù)合物的步驟之前，還可以包括:將至少一部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上；測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值；以及從結(jié)合元件上釋放捕獲的報(bào)告化合物。
[0124]在某些實(shí)施方案中，將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的祀核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的步驟，可以相伴進(jìn)行。
[0125]在其它實(shí)施方案中，方法包括對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。靶核酸的擴(kuò)增可以在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟之前開始。
[0126]表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，可以在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的步驟達(dá)到化學(xué)平衡之前進(jìn)行測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，指示值在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的步驟開始后I秒到120秒時(shí)進(jìn)行測(cè)定。
[0127]報(bào)告化合物可以包含一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記。在具體的實(shí)施方案中，一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記是熒光標(biāo)記。在其它具體實(shí)施方案中，報(bào)告化合物是寡核苷酸。
[0128]在它實(shí)施方案中，方法還包括在將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前，對(duì)它們進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0129]在其它實(shí)施方案中，形成物質(zhì)的組合物的步驟包括形成物質(zhì)的組合物，該物質(zhì)包括一定量的第一報(bào)告化合物，一定量的能夠與第一報(bào)告化合物形成復(fù)合物的第一靶核酸，與第一報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了結(jié)合元件對(duì)第一報(bào)告化合物的捕獲，一定量的第二報(bào)告化合物，以及一定量的能夠與第二報(bào)告化合物形成復(fù)合物的第二靶核酸，與第二報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了結(jié)合元件對(duì)第二報(bào)告化合物的捕獲。
[0130]在方法中使用的結(jié)合元件可以包含一種或多種能夠?qū)?bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的不同的捕獲分子。捕獲分子也可以被稱為報(bào)告化合物特異性捕獲分子。在具體的實(shí)施方案中，捕獲分子是寡核苷酸。不同的捕獲分子也可以布置在相應(yīng)的結(jié)合元件的不同位置上。
[0131]報(bào)告化合物可以通過與捕獲分子形成復(fù)合物而捕獲在結(jié)合元件上。在具體的實(shí)施方案中，報(bào)告化合物上的至少一部分能夠與靶核酸形成復(fù)合物的相互作用位點(diǎn)，也能夠與捕獲分子形成復(fù)合物。在其它具體的實(shí)施方案中，捕獲分子和靶核酸競(jìng)爭(zhēng)與報(bào)告化合物形成復(fù)合物。
[0132]在其它實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括變性雙鏈核酸的步驟。雙鏈核酸可以包括報(bào)告化合物與靶核酸的復(fù)合物，報(bào)告化合物與捕獲分子的復(fù)合物，雙鏈報(bào)告化合物以及雙鏈靶核酸。
[0133]擴(kuò)增也可以包括將引物分子與靶核酸退火的步驟。退火步驟可以與一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，和/或?qū)]有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的步驟相伴進(jìn)行。
[0134]擴(kuò)增可以是循環(huán)式的擴(kuò)增。在具體的實(shí)施方案中，循環(huán)式的擴(kuò)增是PCR。循環(huán)式擴(kuò)增可以包含至少10個(gè)循環(huán)或至少20個(gè)循環(huán)。在其它實(shí)施方案中，進(jìn)行PCR包括了使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。
[0135] 表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，可以在循環(huán)式擴(kuò)增的至少一個(gè)循環(huán)后進(jìn)行測(cè)定。在具體的實(shí)施方案中，該值在循環(huán)式擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)后測(cè)定。在其它實(shí)施方案中，表明祀核酸的存在和/或量的值，在每次表明捕獲在結(jié)合兀件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值被測(cè)定之后進(jìn)行測(cè)定。
[0136]可以提供被成形用于執(zhí)行任何一個(gè)上述方法的裝置。
[0137]從下面的描述，圖和權(quán)利要求書中，其它的方面，目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0138]圖中的說明是綱要性的。在不同的圖中，相似的或同樣的元件被提供有同樣的附圖標(biāo)記。
[0139]圖1a是多核苷酸分析方法的流程圖。
[0140]圖1b是可用于執(zhí)行圖1a的方法的檢測(cè)系統(tǒng)的視圖。
[0141]圖1c是圖1b的檢測(cè)系統(tǒng)的視圖，其中檢測(cè)系統(tǒng)被顯示為進(jìn)行圖1a的方法的檢測(cè)步驟時(shí)的致動(dòng)狀態(tài)。
[0142]圖1d顯示了與粒子結(jié)合的擴(kuò)增子。
[0143]圖1e顯示了與粒子結(jié)合的擴(kuò)增子。
[0144]圖2顯示了適于圖1b和Ic的檢測(cè)系統(tǒng)中的分析裝置。
[0145]圖3是圖2的分析裝置，與用于操作裝置的型板致動(dòng)器一起顯示。
[0146]圖4顯示了使用新鮮的或冷凍干燥的裂解緩沖液進(jìn)行的分析的結(jié)果(RT-PCR產(chǎn)物曲線和凝膠電泳)，其中裂解緩沖液可以作為冷凍干燥的丸粒儲(chǔ)存而不喪失功能。
[0147]圖5顯示了用于從血液裂解混合物中捕獲寡核苷酸(即HIV RNA)的鏈親和素瓊脂糖漿液的量的影響，其中使用200 μ L,100yL或50 μ L鏈親和素瓊脂糖漿液進(jìn)行的分析的結(jié)果表明，50 μ L懸浮液的結(jié)合能力就足以捕獲基本上所有的RNA分子。
[0148]圖6顯示了用于從血液裂解混合物中捕獲寡核苷酸(即HIV RNA)的鏈親和素瓊脂糖懸浮液的量的影響，其中使用10 μ L和7μ L鏈親和素瓊脂糖懸浮液進(jìn)行的分析的結(jié)果表明，10 μ L懸浮液的結(jié)合能力就足以捕獲基本上所有的RNA分子。
[0149]圖7顯示了溫育時(shí)間對(duì)被分析的多核苷酸和捕獲探針之間復(fù)合物的形成(即雜交)的影響，其中在溫育時(shí)間2分鐘后，絕大部分的多核苷酸不能被回收到，而溫育10分鐘后，在上清液中不能檢測(cè)到RNA。
[0150]圖8顯示了溫育時(shí)間對(duì)被分析的多核苷酸和捕獲探針之間復(fù)合物的形成(即雜交)的影響。
[0151]圖9顯示了溫育時(shí)間對(duì)捕獲步驟(即復(fù)合物的生物素錨定基團(tuán)與鏈親和素瓊脂糖粒子的結(jié)合)的影響，其中顯示出5分鐘的溫育時(shí)間就足以捕獲所有的多核苷酸分子(即在上清液中不能檢測(cè)到RNA分子)。
[0152]圖10顯示了使用新鮮的或儲(chǔ)存了幾小時(shí)或7天的冷凍干燥的鏈親和素瓊脂糖粒子進(jìn)行的分析的結(jié)果(RT-PCR產(chǎn)物曲線)，其中鏈親和素瓊脂糖粒子可以被冷凍干燥并復(fù)溶而不喪失功能。
[0153]圖11顯示了使用新鮮的或冷凍干燥的清洗緩沖液進(jìn)行的分析的結(jié)果(RT-PCR產(chǎn)物曲線)，其中清洗緩沖液可以被冷凍干燥并復(fù)溶而不喪失功能。
[0154]圖12顯示了進(jìn)行的用于顯示鏈親和素瓊脂糖粒子與RT-PCR的相容性的試驗(yàn)的結(jié)果(RT-PCR產(chǎn)物曲線和瓊脂糖凝膠電泳)，其中10 μ L鏈親和素瓊脂糖粒子懸浮液可以用于RT-PCR擴(kuò)增而不損失擴(kuò)增效能。
[0155]圖13顯示了按照示例性實(shí)施方案的分析方法的特異性，其中結(jié)果(RT-PCR產(chǎn)物曲線和瓊脂糖凝膠電泳)顯示，HIV RNA不與鏈親和素瓊脂糖粒子非特異性結(jié)合(即在不存在捕獲探針的情況下)，在裂解過程中同時(shí)釋放的人類血細(xì)胞的任何RNA也不被捕獲/擴(kuò)增。
[0156]圖14顯示了在鏈親和素瓊脂糖粒子上檢測(cè)擴(kuò)增子的熒光圖像，其中生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子被捕獲在鏈親和素瓊脂糖粒子上，在熒光標(biāo)記的探針與被捕獲的擴(kuò)增子雜交后被可視化。
[0157]圖15說明了瓊脂糖凝膠電泳顯示出，捕獲在鏈親和素瓊脂糖粒子上的多核苷酸(即HIV RNA)可以直接用作擴(kuò)增的模板而不需要其它的處理步驟(即洗脫，稀釋或濃縮)。
[0158]圖16顯示了鏈親和素瓊脂糖粒子的相應(yīng)的熒光圖像，其中與陰性探針相比，在陽性探針中檢測(cè)到了更多的熒光鏈親和素瓊脂糖粒子。
[0159]圖17概要說明了裝置。
[0160]圖18描繪了裝置的前側(cè)面。
[0161]圖19圖示了圖18的裝置的后側(cè)面。
[0162]圖20圖示了裝置的主視圖。
[0163]圖21描繪了裝置的橫截面圖。
[0164]圖22示意說明了用于檢測(cè)多核苷酸的競(jìng)爭(zhēng)性方法。
`[0165]圖23顯示了用于測(cè)定樣品中人類I型脊髓灰質(zhì)炎病毒DNA的競(jìng)爭(zhēng)性分析方法的結(jié)果。
[0166]圖24顯示了用于測(cè)定樣品中HIV gag/env PCR產(chǎn)物的量的基于陣列的競(jìng)爭(zhēng)性分析方法的原理以及結(jié)果。
[0167]圖25說明了在圖24中顯示的分析的過程中的不同的步驟。
[0168]圖26示意說明了用于檢測(cè)多核苷酸的競(jìng)爭(zhēng)性方法。
[0169]圖27顯示了用于測(cè)定樣品中HIV B亞型和HIV O2亞型的量的競(jìng)爭(zhēng)性分析的結(jié)果。
[0170]圖28顯示了用于測(cè)定樣品中不同量的HIV B亞型的競(jìng)爭(zhēng)性分析的結(jié)果。
[0171]發(fā)明詳述
生物學(xué)樣品的分析可以包括測(cè)定一種或多種多核苷酸(例如DNA，RNA,mRNA或rRNA)是否存在于樣品中。例如，人們可以分析樣品，以確定表明特定病原體的存在的多核苷酸是否存在。
[0172]在一個(gè)實(shí)施方案中，用于分析的方法包括形成復(fù)合物，每個(gè)復(fù)合物含有靶核酸和捕獲分子，其中每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶核酸的區(qū)域的結(jié)合部分和錨定基團(tuán)；將復(fù)合物與結(jié)合元件接觸，結(jié)合元件被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，以將復(fù)合物結(jié)合到結(jié)合元件上；對(duì)一或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增；將擴(kuò)增的靶核酸捕獲大相應(yīng)的結(jié)合元件上；以及對(duì)表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值進(jìn)行測(cè)定。
[0173]術(shù)語靶核酸可以是指可以通過方法檢測(cè)的核酸分子(即能夠與捕獲分子形成復(fù)合物的靶核酸；參見下文)。這樣的核酸分子的例子包括天然存在的核酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及人工設(shè)計(jì)的核酸，例如核酸類似物例如尤其是肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA),它們是化學(xué)合成的或通過重組基因技術(shù)產(chǎn)生的(參見例如Sambrook, J.等(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)(Molecular, Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,在此以其全文引為參考)。天然存在的核酸的具體的例子包括DNA序列例如基因組DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互補(bǔ)的核酸序列。這樣的核酸可以是任何長(zhǎng)度的，既可以是單鏈的也可以是雙鏈的分子。典型情況下，靶核酸的長(zhǎng)度為10到10，000個(gè)核苷酸，例如20到2，000個(gè)核苷酸，30到1，000個(gè)核苷酸或50到500個(gè)核苷酸。在本文中使用的術(shù)語“核苷酸”應(yīng)該被理解為是指核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸(即RNA和DNA分子)。
[0174]靶核酸可以是與病毒感染有關(guān)的核酸。與病毒感染有關(guān)的核酸是指任何存在于被分析的，已經(jīng)被一種或多種病毒感染的液體樣品中的病毒來源的核酸分子(即其核苷酸序列與病毒基因組中相應(yīng)的序列一致或互補(bǔ))。感染從中獲得液體樣品的宿主的病毒，可以是DNA病毒(即具有DNA基因組的病毒)或RNA病毒(即具有RNA基因組的病毒)(綜述在例如Biichen-Osmond, C.(2003).《病毒的分類學(xué)與分類》,在《臨床微生物學(xué)手冊(cè)》(第八版)第二卷中，(Taxonomy and Classification of Viruses.1n: Manual of ClinicalMicrobiology, 8th ed., vol.2), p.1217-1226，ASM Press, Washington DC,以其全文引為參考)。DNA病毒的例子包括尤其是乳多空病毒科(Papovaviridae)(例如乳頭瘤病毒)，腺病毒科(Adenoviridae)(例如腺病毒)和皰疫病毒科(Herpesviridae)(例如Epstein-Barr病毒,細(xì)胞肥大病毒)的病毒。RNA病毒的例子包括尤其是小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，黃病毒科(Flaviviridae)(例如丙型肝炎病毒)，纖絲病毒科(Fi1viridae)(例如馬爾堡病毒，埃博拉病毒)和逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如人類免疫缺陷病毒(HIV))的病毒。在某些實(shí)施方案中，被檢測(cè)的核酸與逆轉(zhuǎn)錄病毒科的成員引起的感染相關(guān)，特別是它們與HIV感染相關(guān)。本文中使用的術(shù)語“HIV”是指HIV-1和HIV-2，以及從其衍生的任何亞型。
[0175]因?yàn)樵S多DNA病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒(值得注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制以便需要將RNA病毒基因組反轉(zhuǎn)錄成DNA)可以潛伏的前病毒形式將它們的遺傳信息整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此術(shù)語“與病毒感染有關(guān)的核酸”不僅僅是指源自于游離的和細(xì)胞相關(guān)的病毒的核酸，而且還包括了整合在宿主基因組中的前病毒DNA分子，反轉(zhuǎn)錄的病毒DNA分子(即病毒復(fù)制的“中間體”)，以及源自于前病毒DNA的轉(zhuǎn)錄本(即通過宿主DNA基因組的轉(zhuǎn)錄獲得的RNA分子)。
[0176]典型情況下，靶核酸不以分離的形式，而是以懷疑含有一種或多種靶核酸的樣品的形式用于本發(fā)明的方法。術(shù)語“一種或多種”是指一種或多種不同類型的核酸，例如具有不同核苷酸序列的分子和/或從不同的來源傳下來的分子(例如從感染宿主細(xì)胞的不同病原體衍生的核酸)。
[0177]術(shù)語樣品是指任何被分析的，并且被懷疑含有一種或多種被檢測(cè)的靶核酸的液體。因此，樣品可以包括溶解在水或適合的緩沖液(例如Tris/EDTA)中的純化的核酸制備物，以及各種不同的生物學(xué)樣品。可以使用該發(fā)明進(jìn)行分析的液體樣品的例子包括尤其是有機(jī)和無機(jī)化學(xué)物溶液,飲用水,污水,人類和非人類的體液例如全血,血漿,血清,尿液,痰液，唾液或腦脊髓液，來自動(dòng)物，植物或組織培養(yǎng)物的細(xì)胞提取液，原核和真核細(xì)胞懸浮液，噬菌體制備液等。
[0178]全血可以是指含有其所有組分的血液。換句話說，全血包括血細(xì)胞例如紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板，以及血細(xì)胞懸浮在其中的血漿。
[0179]樣品還可以包含一種或多種其它試劑，例如稀釋劑，溶劑或緩沖液，它們可能來自于樣品在進(jìn)行本發(fā)明的方法之前進(jìn)行的可選的純化和/或步驟。但是，在某些實(shí)施方案中，被分析的樣品是未處理的樣品，例如未處理的全血樣品。術(shù)語未處理的可以表示在樣品收集(例如從患者抽取血液)之后和將其進(jìn)行本發(fā)明的方法之前，沒有發(fā)生進(jìn)一步的樣品加工(例如分級(jí)方法，干燥/復(fù)溶等)。
[0180]被分析的流體樣品的體積可以在I μ L到50 μ L的范圍內(nèi)，典型情況下在I μ L至Ij 45 μ L，或 I μ L 至Ij 40 μ L，或 I μ L 至Ij 30 μ L，或 I μ L 至Ij 25 μ L，或 I μ L 至Ij 20 μ L，或 I μ L到15 μ L的范圍內(nèi)。在具體的實(shí)施方案中，流體樣品的體積在IyL到10 μ L的范圍內(nèi)。全血樣品也可以使用超過50 μ L的樣品體積進(jìn)行分析。
[0181]捕獲分子是指顯示出特異性結(jié)合行為和/或特征性的反應(yīng)性的分子，使其適合于與靶核酸形成復(fù)合物。典型情況下使用核酸作為捕獲分子?？梢杂米鞑东@分子的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸類似物例如尤其是肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)。天然存在的核酸的具體的例子包括DNA序列例如基因組DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互補(bǔ)的核酸序列。這樣的核酸可以是任何長(zhǎng)度的，既可以是單鏈的也可以是雙鏈的分子。典型情況下，核酸捕獲分子是長(zhǎng)度為10到150個(gè)核苷酸，例如20到100個(gè)核苷酸或30到70個(gè)核苷酸的單鏈寡核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，捕獲分子可以在PCR中用作引物，以擴(kuò)增在給定的流體樣品中存在的任何目標(biāo)靶核酸。
[0182]在某些實(shí)施方案中，捕獲分子可以包括至少一個(gè)特異性序列區(qū)域(即上面所指的結(jié)合部分)，它與靶核酸(例如與病毒感染有關(guān)的核酸)的序列區(qū)域互補(bǔ)，從而允許捕獲分子與被檢測(cè)的核酸之間的堿基配對(duì)。典型情況下，特異性結(jié)合區(qū)域長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸，例如至少30個(gè)核苷酸或至少40個(gè)核苷酸。`具體來說，捕獲分子的結(jié)合區(qū)域的核苷酸序列與靶核酸的相應(yīng)核苷酸序列互補(bǔ)。
[0183]在導(dǎo)入被分析的流體樣品之前，可以在一個(gè)或多個(gè)上面描述的裝置的適于容納液體的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)中提供捕獲分子(例如以冷凍干燥的或干燥的形式)。或者，捕獲分子可以與樣品一起(例如相伴地)或在樣品已經(jīng)導(dǎo)入后導(dǎo)入到裝置中。
[0184]可以使用一種或多種捕獲分子。換句話說，可以使用一種或多種不同類型的捕獲分子，例如一種或多種具有不同核苷酸序列的核酸分子。相伴使用的一種以上的捕獲分子也可以被稱為“文庫(kù)”。這樣的文庫(kù)包含至少兩種不同的分子，但是也可以包含許多種不同的分子，例如至少不同的5種，至少不同的10種，至少不同的30種等。文庫(kù)也可以陣列元件或任何其它空間布置的形式存在。
[0185]在某些實(shí)施方案中，在裝置中進(jìn)行的分析還包括將含有被檢測(cè)的靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物與裝置的結(jié)合元件相接觸，結(jié)合元件被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，以便將復(fù)合物與結(jié)合元件結(jié)合。
[0186]術(shù)語結(jié)合元件或支持元件是指捕獲分子(因此還有含有這些捕獲分子的任何復(fù)合物)可以經(jīng)過捕獲分子的錨定基團(tuán)通過共價(jià)的或非共價(jià)的相互作用連接到其上的任何基質(zhì)。這樣的基質(zhì)的例子包括尤其是陣列元件的基質(zhì)或合成的粒子，例如磁性珠子(例如順磁性聚苯乙烯珠子，也被稱為Dynabeads?)和乳膠珠子，以及多孔的表面例如CPG等。依賴于捕獲分子的類型，錨定基團(tuán)的類型以及目標(biāo)應(yīng)用，在每種情況下可能有各種不同的連接。例如，在捕獲分子的錨定基團(tuán)可以是生物素基團(tuán)的情況下，它可以與連接到結(jié)合元件上的親和素或鏈親和素基團(tuán)偶聯(lián)?；蛘?，捕獲分子可以含有一段腺苷殘基(例如10個(gè)腺苷殘基)，它將與結(jié)合在結(jié)合元件上的一段相應(yīng)的胸苷殘基相互作用。具體的含有錨定基團(tuán)的偶聯(lián)試劑可以從不同的供應(yīng)商商購(gòu)，在本【技術(shù)領(lǐng)域】是公知的(參見例如Sambrook, J.等，同上；Ausubel, F.M.等，同上；以及 Lottspeich, F.和 Zorbas H.,同上)。
[0187]在導(dǎo)入被分析的流體樣品之前，結(jié)合元件可以被提供在裝置的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)中。結(jié)合元件可以被提供在與捕獲分子相同的結(jié)構(gòu)中，或在至少一個(gè)不同的結(jié)構(gòu)中。典型情況下，形成捕獲分子與靶核酸的復(fù)合物的步驟與將復(fù)合物與結(jié)合元件相接觸的步驟，在空間上分開進(jìn)行，即在裝置的不同結(jié)構(gòu)或孔或反應(yīng)室中進(jìn)行。例如，形成捕獲分子與靶核酸的復(fù)合物的步驟可以在裂解孔中進(jìn)行，將復(fù)合物與結(jié)合元件相接觸的步驟在中心孔中進(jìn)行，如圖17中描繪的。在這樣的實(shí)施方案中，捕獲分子和結(jié)合元件通常被提供在適于容納液體的不同的結(jié)構(gòu)中。除了在加入樣品前在裝置中提供結(jié)合元件之外，結(jié)合元件也可以與樣品一起(即相伴地)或在樣品已經(jīng)導(dǎo)入之后導(dǎo)入到裝置中。
[0188]在具體實(shí)施方案中，方法還包括將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，也就是說，在對(duì)它們進(jìn)行進(jìn)一步分析之前增加它們?cè)跇悠分写嬖诘牧浚员阌谶M(jìn)一步的檢測(cè)。典型情況下，靶核酸的擴(kuò)增通過循環(huán)式擴(kuò)增來進(jìn)行。循環(huán)式擴(kuò)增可以包含等于或大于2的任何數(shù)量的擴(kuò)增循環(huán)。通常情況下，循環(huán)式擴(kuò)增反應(yīng)包含至少10個(gè)或至少20個(gè)循環(huán)。[0189]示例性的循環(huán)式擴(kuò)增是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR是分子生物學(xué)中已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，被詳細(xì)描述在例如Sambrook等，同上；和Ausubel, F.M.等，同上中。典型情況下，通過使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，PCR被用于擴(kuò)增雙鏈DNA分子。在某些實(shí)施方案中，在循環(huán)式擴(kuò)增中使用的DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，特別是5’ 一3’核酸外切酶活性。這樣的DNA聚合酶的例子包括尤其是Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(可以從多個(gè)供應(yīng)商商購(gòu))。
[0190]當(dāng)靶核酸是RNA分子時(shí)，在對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前可以對(duì)它們進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(即是從相應(yīng)的RNA分子產(chǎn)生DNA分子)。反轉(zhuǎn)錄是分子生物學(xué)中的另一種標(biāo)準(zhǔn)方法，也描述在例如Sambrook等，同上；和Ausubel, F.M.等，同上中。
[0191]對(duì)于核酸擴(kuò)增來說，裝置可以包含一個(gè)或多個(gè)溫度控制單元和/或溫度調(diào)控單元，用于控制和/或調(diào)控反應(yīng)室中的溫度。這樣的溫度控制單元和/或溫度調(diào)控單元可以包含一個(gè)或多個(gè)分離的加熱和/或冷卻元件，它們可以與裝置的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)室直接接觸。典型情況下，一個(gè)或多個(gè)加熱和/或冷卻元件由導(dǎo)熱材料制成。這樣的導(dǎo)熱材料的例子包括尤其是硅，陶瓷材料例如氧化鋁陶瓷，和/或金屬例如高級(jí)別鋼，鋁，銅或黃銅。適合的溫度控制單元和/或溫度調(diào)控單元的示例性描述也可以在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/02094中發(fā)現(xiàn)，以其全文引為參考。
[0192]例如，在適合于容納液體的結(jié)構(gòu)中控制/調(diào)控溫度，也可以通過使用由導(dǎo)電材料制成的室來完成。室體可以是至少部分圍繞著裝置的至少一種結(jié)構(gòu)或反應(yīng)室的固體物體。結(jié)構(gòu)至少部分可以是室體的完整的部件(即由與室體相同的材料制成)。導(dǎo)電材料的例子包括導(dǎo)電的合成材料，例如具有5到30%碳纖維的聚酰胺，具有5到30%碳纖維的聚碳酸酯，具有2到20%不銹鋼纖維的聚酰胺，以及具有5到40%碳纖維的聚苯硫醚。此外，室體可以被設(shè)計(jì)成含有增大和縮小的部分，允許對(duì)反應(yīng)室或相應(yīng)的表面進(jìn)行特異性加熱。
[0193]結(jié)構(gòu)中溫度的測(cè)量可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的各種方法來進(jìn)行，例如通過使用整合的阻抗傳感器，半導(dǎo)體傳感器，光波導(dǎo)傳感器，多色染料或液晶。此外，反應(yīng)室中的溫度可以使用室體中整合的溫度傳感器，高溫計(jì)或紅外傳感器來測(cè)定，或通過測(cè)量參數(shù)，例如發(fā)生檢測(cè)的表面的折射率或樣品的PH值，的溫度依賴性變化來測(cè)定，例如通過測(cè)量pH敏感性指示劑的顏色變化。
[0194]通常情況下，擴(kuò)增例如PCR包含三個(gè)基本步驟——變性，引物的退火和引物的延伸，它們以循環(huán)的方式重復(fù)地進(jìn)行。但是，擴(kuò)增還可以分別在第一次“真正的”擴(kuò)增循環(huán)之前包含最初的變性步驟，和/或在完成最后的擴(kuò)增循環(huán)之后包含最后的延伸步驟。在某些實(shí)施方案中，靶核酸的擴(kuò)增包括(至少)變性雙鏈核酸的步驟，和/或在靶核酸上退火和延伸引物分子的組合步驟(即“兩步PCR”)。
[0195]典型情況下，變性步驟包括將被分析的樣品加熱到94_95°C的溫度，一般為0.5秒到5分鐘，從而導(dǎo)致雙鏈核酸模板解鏈。將被分析的樣品進(jìn)行這樣的變性步驟，導(dǎo)致(即允許)樣品中的雙鏈核酸，包括雙鏈靶核酸和捕獲分子與靶核酸的復(fù)合物(結(jié)合到結(jié)合元件上)，同時(shí)變性，后者導(dǎo)致靶核酸從結(jié)合元件上釋放。
[0196]典型情況下，退火步驟包括將被分析的樣品冷卻到40-65° C的溫度，一般為I秒到5分鐘，以允許引物分子與變性的核酸模板鏈的結(jié)合(即雜交/堿基配對(duì))。使用的反應(yīng)溫度依賴于被退火的引物分子的化學(xué)和/或物理性質(zhì)，例如它們的核苷酸序列組成，熔點(diǎn)溫度，它們發(fā)生分子內(nèi)折疊(例如形成雙鏈發(fā)夾或轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu))的傾向等。在某些實(shí)施方案中，被分析的樣品進(jìn)行這樣的退火步驟，導(dǎo)致(即允許)雙鏈靶分子的重新結(jié)合，以及靶核酸與捕獲分子的復(fù)合物的形成，后者導(dǎo)致將靶核酸捕獲或重新捕獲在結(jié)合元件上。因此，在某些實(shí)施方案中，退火步驟和通過與捕獲分子形成復(fù)合物將靶核酸捕獲在結(jié)合元件上的步驟相伴進(jìn)行。
`[0197]最后，典型的延伸步驟包括使用DNA聚合酶對(duì)雜交的引物分子進(jìn)行延伸以產(chǎn)生DNA模板鏈的全長(zhǎng)的拷貝。擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度由使用的引物對(duì)的5’末端確定。典型情況下，延伸步驟在70-72°C下進(jìn)行I秒到10分鐘。在某些實(shí)施方案中，將被分析的樣品進(jìn)行這樣的延伸步驟，可以通過允許在退火步驟中已經(jīng)形成的引物與靶核酸的復(fù)合物延伸，產(chǎn)生任選摻入了隨后可以被檢測(cè)的可檢測(cè)的標(biāo)記物的雙鏈的被擴(kuò)增的核酸片段，從而導(dǎo)致了被分析的靶核酸的復(fù)制。
[0198]在具體的實(shí)施方案中，方法還包括將典型情況下通過將被分析的樣品進(jìn)行PCR而被擴(kuò)增的靶核酸捕獲到相應(yīng)的結(jié)合元件上(即將靶核酸固定在其上)。正如上面已經(jīng)描述的，靶核酸可以通過與通過錨定基團(tuán)仍然結(jié)合在結(jié)合元件上的捕獲分子形成復(fù)合物而捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上。
[0199]方法還可以包括將捕獲的被擴(kuò)增的靶核酸從結(jié)合元件上釋放，以及重復(fù)將一種或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟。釋放可以包括從結(jié)合元件上分開或解開靶核酸。這可以通過例如裂解任何共價(jià)鍵來酶法實(shí)現(xiàn)，或者在靶核酸是通過核酸捕獲分子經(jīng)互補(bǔ)堿基配對(duì)而結(jié)合到結(jié)合元件上的情況下，通過增加分析發(fā)生在其中的結(jié)構(gòu)中的溫度，從而導(dǎo)致核酸鏈的分離(即變性)來完成。
[0200]在這樣的實(shí)施方案中，從結(jié)合元件上釋放捕獲的被擴(kuò)增的靶核酸，以及重復(fù)將一種或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟的循環(huán)，而可以被進(jìn)行至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少50次或至少100次。測(cè)定表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的步驟，可以在至少一個(gè)循環(huán)后進(jìn)行，例如在每個(gè)從結(jié)合元件上釋放捕獲的被擴(kuò)增的靶核酸，以及重復(fù)將一種或多種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上的步驟的循環(huán)后進(jìn)行。
[0201]形成含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物，其中每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶核酸的區(qū)域的結(jié)合部分和錨定基團(tuán)的步驟，可以與將復(fù)合物與結(jié)合元件相接觸的步驟在空間上分開進(jìn)行，其中結(jié)合元件被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，從而將復(fù)合物結(jié)合到結(jié)合元件上。在這樣的實(shí)施方案中，方法在含有至少兩個(gè)適于容納液體的結(jié)構(gòu)的裝置中進(jìn)行。至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)可以例如與微流體網(wǎng)路流體連通。例如，方法可以在圖18和19中顯示的裝置500中進(jìn)行。含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物可以在第一結(jié)構(gòu)502中形成。然后可以將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到第二結(jié)構(gòu)512中，復(fù)合物在其中與上述的被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合的結(jié)合元件相接觸。
[0202]表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定，可以包括檢測(cè)/測(cè)定允許對(duì)捕獲(或重新捕獲)在結(jié)合元件上的靶核酸進(jìn)行定性和/或定量測(cè)量的參數(shù)，例如電導(dǎo)性，氧化還原電勢(shì)，光吸收，熒光強(qiáng)度或生物發(fā)光。可以只測(cè)定這些參數(shù)中的一種，但是相伴或相繼測(cè)定一種以上的參數(shù)(例如電導(dǎo)性和由適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物引起的熒光信號(hào)的強(qiáng)度)也是可能的。
[0203]為了進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)，可以將靶核酸用一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記?？蓹z測(cè)的標(biāo)記物可以是任何包含 一種或多種適合的化學(xué)物質(zhì)或酶的化合物或基團(tuán)，可以在化學(xué)，物理或酶反應(yīng)中直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的化合物或信號(hào)。因此，通過能夠與目標(biāo)報(bào)告化合物形成相互作用，這樣的標(biāo)記物可能是該報(bào)告化合物的檢測(cè)所必需的，或?qū)⒋龠M(jìn)該報(bào)告化合物的檢測(cè)。在本文中使用時(shí)，該術(shù)語應(yīng)該被理解為包括了可檢測(cè)標(biāo)記物本身(也被稱為“標(biāo)記”)，以及任何與一種或多種這樣的可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的化合物。此外，干擾標(biāo)記物產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的基團(tuán)(例如在淬滅劑與熒光團(tuán)彼此緊鄰時(shí)“劫持”熒光團(tuán)的激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射的淬滅劑)也可以屬于可檢測(cè)標(biāo)記物?？蓹z測(cè)標(biāo)記物可以被整合或連接到靶核酸上，例如以修飾的和/或標(biāo)記的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或雙脫氧核糖核苷酸的形式。
[0204]標(biāo)記可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】熟知的方法來完成(參見例如Sambrook, J.等，同上；以及Lottspeich, F.和Zorbas H.,同上)。標(biāo)記物可以選自尤其是突光標(biāo)記物,酶標(biāo)記物，有色標(biāo)記物，生色標(biāo)記物，發(fā)光標(biāo)記物，放射活性標(biāo)記物，半抗原，生物素，金屬?gòu)?fù)合物，金屬和膠體金。所有這些類型的標(biāo)記物在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是公知的。由這樣的標(biāo)記物介導(dǎo)的物理反應(yīng)的例子是在輻射或激發(fā)后發(fā)射熒光或磷光，或當(dāng)使用放射活性標(biāo)記物時(shí)發(fā)射X-射線。堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，半乳糖苷酶和內(nèi)酰胺酶是酶標(biāo)記物的例子，它們催化產(chǎn)色反應(yīng)產(chǎn)物的形成。在具體的實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。大量的熒光標(biāo)記物在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是公知的，可以從不同的供應(yīng)商商購(gòu)(參見例如《手冊(cè):熒光探針和標(biāo)記技術(shù)指南》(第 10 版)(The Handbook - A Guide to Fluorescent Probesand Labeling Technologies, 10th ed.), (2006),《分子探針》(Molecular Probes),Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA,在此以其全文引為參考)。
[0205]為了檢測(cè)這樣的標(biāo)記物，可以使用適合于測(cè)定表明捕獲在支持元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的檢測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)可以與裝置500相連。典型情況下，檢測(cè)系統(tǒng)位于一個(gè)第二結(jié)構(gòu)512對(duì)面，任選位于發(fā)生檢測(cè)的特定表面區(qū)域的對(duì)面。合適的檢測(cè)系統(tǒng)的選擇取決于若干參數(shù)，例如用于檢測(cè)的標(biāo)記物的類型，所進(jìn)行分析的種類。多種光學(xué)和非光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的?？梢耘c方法使用的通常意義的檢測(cè)系統(tǒng)參見例如，Lottspeich F.，和 Zorbas H.,同上中。
[0206]典型情況下，檢測(cè)系統(tǒng)是光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，方法的進(jìn)行包括簡(jiǎn)單的檢測(cè)系統(tǒng)，它可以基于參數(shù)例如熒光，光吸收，共振轉(zhuǎn)移等的測(cè)量。
[0207]在其它實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)是基于用熒光團(tuán)標(biāo)記的光譜激發(fā)的核酸的熒光強(qiáng)度的比較。熒光是特定分子當(dāng)被產(chǎn)生特征性吸收和發(fā)射行為的特定波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，發(fā)射出它們自己的光的能力。具體來說，熒光信號(hào)的定量檢測(cè)是通過修改過的熒光顯微鏡方法來進(jìn)行的(綜述參見例如 Lichtman, J.W.和 Conchello, J.A.(2005) Nature Methods 2,910-919 ；Zimmermann, T.(2005) Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.95, 245-265,以其全文引為參考)。由此，從光吸收和光發(fā)射產(chǎn)生的信號(hào)分別被一個(gè)或多個(gè)濾光片和/或堇青石分離，并成像在適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器上。數(shù)據(jù)分析通過數(shù)字圖像處理方法來進(jìn)行。圖像加工可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】眾所周知的幾種軟件包來實(shí)現(xiàn)(例如精確數(shù)字圖像處理軟件(MathematicaDigital Image Processing), ΕΙΚΟΝΑ,或Image-PRO)另一種適合于這種目的的軟件是Iconoclust 軟件(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany)。
[0208]適合的檢測(cè)系統(tǒng)可以基于測(cè)定熒光信號(hào)的經(jīng)典方法，例如外熒光或暗視野熒光顯微術(shù)(綜述在例如Lakowicz, J.R.(1999)的《突光光譜學(xué)原理》(第二版)(Principles ofFluorescence Spectroscopy, 2nd ed.), Plenum Publishing Corp., NY,中，以其全文引為參考)。
[0209]另一種可以使用的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)是共聚焦熒光顯微術(shù)，其中通過點(diǎn)光源將物體在透鏡的聚焦平面中照亮。重要的是，點(diǎn)光源，物體和點(diǎn)光檢測(cè)器位于光學(xué)共軛的平面上。這樣的共聚焦系統(tǒng)的例子在例如Diaspro，A.(2002)《共聚焦和二光子顯微術(shù):基礎(chǔ)，應(yīng)用和進(jìn)展》(Confocal and 2-photon-microscopy: Foundations, Applications andAdvances), Wiley-Liss, Hobroken, NJ,中有詳細(xì)的描述，以其全文引為參考。突光-光學(xué)系統(tǒng)通常是不帶自動(dòng)聚焦的熒光顯微鏡，例如具有固定焦距的熒光顯微鏡。
[0210]其它也可以使用的熒光檢測(cè)方法包括尤其是全內(nèi)部熒光顯微術(shù)(參見例如Axelrod, D.(1999)的《具有逐漸消失的照明的表面突光顯微術(shù)》(Surface fluorescencemicroscopy with evanescent illumination),在Lacey, A.主編的《生物學(xué)中的光學(xué)顯微術(shù)》(Light Microscopy in Biology,Oxford University Press, New York, 399-423)中)，熒光壽命成像顯微術(shù)(參見例如Dowling, K.等，(1999) J.Mod.0ptics 46, 199-209)，突光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET ;參見例如 Periasamy, A.(2001) J.Biomed.0ptics 6,287-291)，生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET ;參見例如Wilson, ?\和Hastings, J.ff.(1998)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14，197-230)，以及熒光關(guān)聯(lián)光譜術(shù)(參見例如Hess, S.T.等，(2002) Biochemistry 41, 697-705);上述每個(gè)文獻(xiàn)以其全文引為參考。
[0211]在具體實(shí)施方案中，檢測(cè)使用FRET或BRET進(jìn)行，它們是基于熒光或生物發(fā)光淬滅劑對(duì)的相應(yīng)形成。FRET的應(yīng)用也描述在例如Liu, B.等，(2005) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 102，589-593 ;和 Szollosi, J.等，(2002) J.Biotechnol.82，251-266 中。BRET 的應(yīng)用被詳細(xì)描述在例如 Prinz, A.等，(2006) Chembiochem.1, 1007-1012 ;和Xu, Y.等，(1999) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 96，151-156，中；上述每個(gè)文獻(xiàn)以其全文引為參考。
[0212]一個(gè)或多個(gè)表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定，可以包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)獲得的指示值進(jìn)行時(shí)間依賴性的監(jiān)測(cè)(即重復(fù)地進(jìn)行測(cè)定/檢測(cè)步驟并監(jiān)測(cè)指示值的隨時(shí)間的過程)。
[0213]提供靶核酸的步驟可以包括從包含在樣品中的生物學(xué)材料釋放靶核酸。為此，可以將樣品加熱以破壞細(xì)胞膜和/或病毒殼體(例如通過使用下面描述的溫度控制單元和/或溫度調(diào)控單元)。在某些實(shí)施方案中，該釋放步驟包括將流體樣品與裂解試劑相接觸，裂解試劑例如含有一種或多種分解細(xì)胞膜和/或病毒殼體的去污劑的試劑。這樣的裂解試劑在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是眾所周知的(參見例如Sambrook, J.等，(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)，Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY),并可從許多供應(yīng)商商購(gòu)。
[0214]方法還可以包括從相伴的材料中分離該一種或多種靶核酸。
[0215]靶核酸的提供，可以與將含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物與結(jié)合元件相接觸，將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的靶核酸捕獲在相應(yīng)的結(jié)合元件上，以及測(cè)定表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的步驟，在空間上分開進(jìn)行。例如，靶核酸可以提供在與含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物在其中形成的相同的結(jié)構(gòu)502中。
[0216]在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法在下面描述的裝置中進(jìn)行。例如，裝置可以含有第一孔502，含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物形成在第一孔502中。此外，裝置可以含有第二孔512，表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定可以在被成形用于檢測(cè)一種或多種靶核酸的第二孔512中進(jìn)行。第二孔512可以包含覆蓋著第二孔的覆蓋元件，以及適于被致動(dòng)以使覆蓋元件變形的致動(dòng)器。此外，將一種或多種核酸進(jìn)行擴(kuò)增和/或?qū)U(kuò)增的靶核酸重新捕獲到相應(yīng)的結(jié)合元件上，也可以在`第二孔512中進(jìn)行。
[0217]表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定，可以使用被致動(dòng)以使覆蓋元件變形的致動(dòng)器來進(jìn)行。在這樣的實(shí)施方案中，覆蓋元件可以變形，使得檢測(cè)孔512的體積減小。此外，在表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值被測(cè)定后，第二孔的體積可以被重新增加。
[0218]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了方法，包括:
a)提供一定量報(bào)告化合物；第一結(jié)合元件被成形成與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合；第二結(jié)合元件能夠捕獲報(bào)告化合物；一定量的靶核酸能夠與報(bào)告化合物形成復(fù)合物；與報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了報(bào)告化合物被第二結(jié)合元件的捕獲；一定量的捕獲分子，其中每個(gè)捕獲分子含有特異性針對(duì)靶核酸的區(qū)域的結(jié)合部分和錨定基團(tuán)；
b)形成復(fù)合物，每個(gè)復(fù)合物含有靶核酸和捕獲分子；
c)將復(fù)合物與第一結(jié)合元件相接觸，以將復(fù)合物結(jié)合到第一結(jié)合元件上；
d)從第一結(jié)合元件上釋放出至少一部分量的靶核酸；
e)形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸的復(fù)合物；
f)將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上；
以及
g)測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。[0219]報(bào)告分子或報(bào)告化合物可以是任何能夠與一種或多種靶核酸形成復(fù)合物，并且可以被捕獲在支持元件例如第二結(jié)合元件上的分子，其中與靶核酸形成復(fù)合物抑制了報(bào)告化合物捕獲在支持元件例如第二結(jié)合元件上。術(shù)語“能夠形成復(fù)合物”可以是指報(bào)告分子和靶核酸之間的任何相互作用。換句話說，該術(shù)語表示，可以通過報(bào)告分子中包含的介導(dǎo)與靶的相互作用的共同的或不同的結(jié)合區(qū)域來實(shí)現(xiàn)的分子之間的彼此結(jié)合(例如通過互補(bǔ)核苷酸序列之間的Watson-Crick堿基配對(duì))。典型情況下，相互作用是可逆的。類似地，被捕獲在支持元件上或被捕獲在第二結(jié)合元件上，包括了報(bào)告分子與給定支持元件的任何直接或間接的(例如通過捕獲分子，參見下文)相互作用。該相互作用一般來說也是可逆的。
[0220]一般來說，報(bào)告分子可以是長(zhǎng)度為10到100個(gè)核苷酸，例如15到50個(gè)核苷酸，15到40個(gè)核苷酸或20到30個(gè)核苷酸的核酸分子(即上面描述的RNA或DNA分子)。通常情況下，報(bào)告分子是單鏈核酸分子(即寡核苷酸)。報(bào)告化合物被構(gòu)造為使得這樣的報(bào)告分子與被檢測(cè)的靶核酸的結(jié)合抑制了報(bào)告分子被捕獲在第二結(jié)合元件上。核酸報(bào)告分子可以包括至少一個(gè)特異性結(jié)合區(qū)域(在本文中也稱為“相互作用位點(diǎn)”)，該區(qū)域不僅能夠與靶核酸相互作用(例如通過結(jié)合到靶核酸的至少部分互補(bǔ)的序列區(qū)域上，從而例如允許報(bào)告分子與被檢測(cè)的靶核酸之間的Watson-Crick堿基配對(duì))，而且能夠被捕獲在第二結(jié)合元件上。典型情況下，報(bào)告分子中包含的特異性結(jié)合區(qū)域長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸，例如至少15個(gè)核苷酸，至少18個(gè)核苷酸或至少22個(gè)核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，報(bào)告分子的結(jié)合部分的核苷酸序列與靶核酸的相應(yīng)核苷酸序列互補(bǔ)。
[0221]可以使用一種或多種報(bào)告分子；換句話說，可以使用一種或多種不同類型的報(bào)告分子，例如一種或多種具有不同核苷酸序列的核酸分子。
[0222]第一結(jié)合元件可以是上面描述的結(jié)合元件。例如，第一結(jié)合元件可以是指任何固體基質(zhì)，捕獲分子，以及因此含有這樣的捕獲分子的任何復(fù)合物，可以通過捕獲分子的錨定基團(tuán)通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用結(jié)合到其上。這樣的基質(zhì)的例子包括尤其是合成的粒子例如磁性珠子(例如順磁性聚苯乙烯珠子，也被稱為Dynabeads?)和乳膠珠子。
[0223]第二結(jié)合元件可以是上面描述的結(jié)合元件。例如，第二結(jié)合元件是指任何固體基質(zhì)，報(bào)告分子可以直接(例如通過報(bào)告分子中包含的錨定基團(tuán))捕獲在其上，或以間接的方式通過一個(gè)或多個(gè)能夠通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用將報(bào)告分子捕獲到第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物特異性捕獲分子捕獲在其上?？梢允褂玫牡诙Y(jié)合元件的例子包括尤其是陣列元件的基體(例如顯微鏡載玻片，晶片或陶瓷材料)。
[0224]報(bào)告化合物特異性捕獲分子可以是任何包含在(例如連接或固定在)第二結(jié)合元件上的，顯示出特異性結(jié)合性質(zhì)和/或特征性反應(yīng)性的分子，這使得它適合于與報(bào)告分子形成復(fù)合物(即與報(bào)告分子結(jié)合)。典型情況下使用核酸作為捕獲分子?？梢杂米鲌?bào)告化合物特異性捕獲分子的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA),以及核酸類似物例如尤其是肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)。天然存在的核酸的具體的例子包括DNA序列例如基因組DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA，mRNA或rRNA分子，或其反向互補(bǔ)的核酸序列。這樣的核酸可以是任何長(zhǎng)度的，既可以是單鏈的也可以是雙鏈的分子。典型情況下，報(bào)告化合物特異性捕獲分子是長(zhǎng)度為10到100個(gè)核苷酸，例如15到50個(gè)核苷酸或20到30個(gè)核苷酸的單鏈寡核苷酸。
[0225]報(bào)告化合物特異性捕獲分子可以包含至少一個(gè)特異性序列區(qū)域(即結(jié)合區(qū)域)，它被構(gòu)造為與報(bào)告分子結(jié)合，例如與報(bào)告分子的互補(bǔ)序列區(qū)域通過報(bào)告化合物特異性捕獲分子和被檢測(cè)的核酸之間的堿基配對(duì)發(fā)生相互作用。典型情況下，特異性結(jié)合區(qū)域的長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸，例如至少15個(gè)核苷酸，至少18個(gè)核苷酸或至少22個(gè)核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，報(bào)告化合物特異性捕獲分子的結(jié)合區(qū)域的核苷酸序列與報(bào)告分子的相應(yīng)的核苷酸序列互補(bǔ)。
[0226]在某些實(shí)施方案中，報(bào)告化合物的至少一部分能夠與靶核酸形成復(fù)合物的相互作用位點(diǎn)，也能夠與報(bào)告化合物特異性捕獲分子形成復(fù)合物。換句話說，報(bào)告化合物特異性捕獲分子與靶核酸競(jìng)爭(zhēng)與報(bào)告化合物形成復(fù)合物，即是包含在報(bào)告化合物特異性捕獲分子和靶核酸中的相應(yīng)結(jié)合區(qū)域識(shí)別報(bào)告分子的同樣的或至少相似的對(duì)應(yīng)序列。本文中使用的術(shù)語“相似的序列”是指序列之間的差異僅僅是一個(gè)或多個(gè)單核苷酸誤配(即核苷酸的非互補(bǔ)配對(duì))或一個(gè)或幾多個(gè)單核苷酸添加，插入或缺失(即附加的或缺少的核苷酸殘基)。因此，包含在報(bào)告化合物特異性捕獲分子和靶核酸中的相應(yīng)結(jié)合區(qū)域至少是部分同一的。本文中使用的術(shù)語“部分同一的”是指序列之間的差異僅僅是如上所述的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸，或序列具有重疊的結(jié)合位點(diǎn)，即序列共有一部分共同的核苷酸序列，但是在序列區(qū)域的至少一個(gè)其它部分中不同。但是，包含在報(bào)告化合物特異性捕獲分子和靶核酸中的相應(yīng)結(jié)合區(qū)域識(shí)別報(bào)告分子的不同的，非重疊的(例如相鄰的)序列，但是報(bào)告化合物特異性捕獲分子或靶核酸與報(bào)告分子的結(jié)合在空間上干擾另一個(gè)分子與報(bào)告分子的結(jié)合，也是可能的。
[0227]可以使用一種或多種報(bào)告化合物特異性捕獲分子；換句話說，可以使用一種或多種不同類型的報(bào)告化合物特異性捕獲分子，例如一種或多種具有不同核苷酸序列的核酸分子。一種以上的報(bào)告化合物特異性捕獲分子的相伴使用也被稱為文庫(kù)。這樣的文庫(kù)包含至少兩種不同的分子，但是也可以包含許多種不同的分子，例如至少不同的10種，至少不同的20種，至少不同的50種等。文庫(kù)也可以布置在相應(yīng)的第二結(jié)合元件的不同位置上。例如，它們可以以陣列或任何其它空間布置的形式存在。
[0228]陣列(或微陣列 )可以是結(jié)合元件，例如第二結(jié)合元件(也被稱為基體)上捕獲分子，例如報(bào)告化合物特異性捕獲分子的確定的空間布置(布局)，其中陣列中每個(gè)分子的位置被獨(dú)立地確定。典型情況下，微陣列含有確定的位點(diǎn)或預(yù)定的區(qū)域(也被稱為陣列元件或點(diǎn))，它們可以特定的樣式布置，其中每個(gè)陣列元件一般只包含一種捕獲分子。捕獲分子例如報(bào)告化合物特異性捕獲分子在支持物例如第二結(jié)合元件上的布置，可以通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用來產(chǎn)生。但是，捕獲分子也可以直接固定在用于執(zhí)行方法的裝置的反應(yīng)室中(參見下文)。
[0229]典型情況下，靶核酸不是以分離的形式用于本發(fā)明的方法，而是以懷疑含有一種或多種靶核酸的樣品的形式，一種或多種靶核酸即是一種或多種不同類型的核酸，例如具有不同的核苷酸序列的分子和/或從不同來源傳下來的分子(例如源自于感染宿主細(xì)胞的不同病原體的核酸)。
[0230]在某些實(shí)施方案中，方法還包括根據(jù)表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值來確定表明靶核酸的存在和/或量的值。也就是說，可以根據(jù)在靶核酸/報(bào)告分子復(fù)合物形成之前存在的報(bào)告化合物的存在和/或量與該復(fù)合物形成之后被捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的量之間的差別，來計(jì)算特定樣品中存在的一種或多種靶核酸的存在和/或量。[0231]為了形成檢測(cè)反應(yīng)，報(bào)告化合物可以包含一種或多種如上所述的可檢測(cè)標(biāo)記物。在具體的實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。大量的英冠給標(biāo)記物在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是公知的，并且可以從不同的供應(yīng)商商購(gòu)(參見例如《手冊(cè):熒光探針和標(biāo)記技術(shù)指南》(第10版)(The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, IOth ed.)(2006),《分子探針》，(Molecular Probes), Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)。
[0232]為了檢測(cè)這樣的標(biāo)記物，用于進(jìn)行方法的裝置還可以包含適合于測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的檢測(cè)系統(tǒng)。例如，可以使用如上所述的適合于測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的靶核酸的存在和/或量的值的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0233]在某些實(shí)施方案中，方法還包括在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的革巴核酸形成復(fù)合物的步驟之后，從第二結(jié)合元件上釋放出剩余部分量的報(bào)告化合物，將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上，以及測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。
[0234]在其它實(shí)施方案中，釋放，形成復(fù)合物，捕獲和測(cè)定的步驟可以被重復(fù)額外的N次，其中N是大于或等于I的整數(shù)。換句話說，方法以循環(huán)的方式進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，整數(shù)N是≥5，≥10或≥20。
[0235]此外，一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟，可以相伴進(jìn)行。
[0236]在具體的實(shí)施方案中，方法還包括將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，也就是說，在將它們進(jìn)行進(jìn)一步分析之前增加它們?cè)跇悠分写嬖诘牧?，以促進(jìn)進(jìn)一步的檢測(cè)。典型情況下，靶核酸的擴(kuò)增通過循環(huán)式擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)。循環(huán)式擴(kuò)增可以包含任何等于或大于2的數(shù)量的擴(kuò)增循環(huán)。通常情況下，循環(huán)式擴(kuò)增反應(yīng)包含至少10個(gè)或至少20個(gè)循環(huán)。
[0237]示例性的循環(huán)式擴(kuò)增是如上所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。典型情況下，通過使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，PCR被用于擴(kuò)增雙鏈DNA分子。在某些實(shí)施方案中，在循環(huán)式擴(kuò)增中使用的DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，特別是5’ 一3’核酸外切酶活性。這樣的DNA聚合酶的例子包括尤其是Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(可以從多個(gè)供應(yīng)商商購(gòu))。利用該5’ 一3’核酸外切酶活性，DNA聚合酶可以核裂解性地攻擊與靶核酸結(jié)合的報(bào)告分子的標(biāo)記的5’ -末端，導(dǎo)致該報(bào)告分子的逐漸降解。結(jié)果，捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的量在每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)期間又降低。任選地，使用的DNA聚合酶也可以表現(xiàn)出3’ 一5’核酸外切酶活性(“校對(duì)活性”)，用于除去已經(jīng)在特定序列位置加入到新生DNA鏈中的不正確的核苷酸。這樣的具有兩種核酸外切酶活性的DNA聚合酶的例子包括尤其是Pwo DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶(兩種酶也可以從不同的供應(yīng)商商購(gòu))。
[0238]如果靶核酸是RNA分子，方法還可以包括在對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前如上所述對(duì)它們進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0239]靶核酸的擴(kuò)增可以在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟之前開始。也就是說，將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)允許報(bào)告化合物與靶核酸形成復(fù)合物，并且沒有與靶核酸形成復(fù)合物的報(bào)告化合物被重新捕獲在第二結(jié)合元件上。
[0240]對(duì)于核酸擴(kuò)增來說，在圖18和19中顯示的裝置500可用于執(zhí)行方法，該裝置還包含了一種或多種如上所述的溫度控制單元和/或溫度調(diào)控單元，用于控制和/或調(diào)控結(jié)構(gòu)或反應(yīng)室，例如中心孔502中的溫度。反應(yīng)室中的溫度的測(cè)量可以按照上面的描述來進(jìn)行。
[0241]在進(jìn)行分析的過程中，表明靶核酸的存在和/或量的值的檢測(cè)/測(cè)定可以只進(jìn)行一次，也可以進(jìn)行一次以上。在單個(gè)分析過程中進(jìn)行了一個(gè)以上檢測(cè)步驟的情況下，在某些實(shí)施方案中可以計(jì)算獲得的結(jié)果的平均值。在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】的專業(yè)人員已知的適合的計(jì)算機(jī)軟件來分析和進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，以確定尤其是一種或多種靶核酸的存在，長(zhǎng)度或序列，和/或計(jì)算它/它們的量。
[0242]在某些實(shí)施方案中，特別是如果報(bào)告化合物超過靶核酸的量，表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸的復(fù)合物的形成，和沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物在第二結(jié)合元件上的捕獲達(dá)到平衡之前進(jìn)行。例如，測(cè)定/檢測(cè)步驟在擴(kuò)增反應(yīng)的退火步驟期間進(jìn)行。但是，在退火步驟完成之后(即延伸步驟期間或完成之后)進(jìn)行測(cè)定/檢測(cè)，也是可能的。
[0243]在其它實(shí)施方案中，表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，在一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟和將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟之后I秒到120秒內(nèi)進(jìn)行(例如I，5，10，15，20，30，60或120秒)。
[0244]在其它實(shí)施方案中，表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，在包含了變性，退火和延伸步驟的循環(huán)式擴(kuò)增的至少一個(gè)循環(huán)后進(jìn)行，例如在退火步驟期間或完成之后進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，該值的測(cè)定在每個(gè)循環(huán)式擴(kuò)增的循環(huán)之后進(jìn)行。在其它具體實(shí)施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值的測(cè)定，在每次表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值被測(cè)定之后進(jìn)行。
[0245]在某些實(shí)施方案中，表 明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，包括了對(duì)指示值的時(shí)間依賴性的監(jiān)測(cè)(即重復(fù)地執(zhí)行測(cè)定/檢測(cè)步驟，并監(jiān)測(cè)指示值隨時(shí)間的過程)。
[0246]在其它實(shí)施方案中，表明祀核酸的存在和/或量的值，是根據(jù)將表明報(bào)告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸的存在和/或量的值相關(guān)聯(lián)的校正曲線來測(cè)定的。
[0247]方法可以在上述的裝置中進(jìn)行，該裝置含有適于容納液體的結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)含有至少一個(gè)結(jié)合元件，并與微流體網(wǎng)路流體連通；控制單元，適于控制流體流過微流體網(wǎng)路，以便靶分子被捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上，適于控制靶分子在結(jié)構(gòu)中的擴(kuò)增，并適于控制捕獲在至少一個(gè)結(jié)合元件上的化合物的檢測(cè)。例如，方法可以在裝置中進(jìn)行，該裝置含有剛性基體；至少部分覆蓋基體的撓性覆蓋元件；在基體中形成的第一結(jié)構(gòu)，適于容納液體并適于釋放一種或多種細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中包含靶分子；在基體中形成的第二結(jié)構(gòu)，適于容納液體，并含有至少一個(gè)結(jié)合元件，適于捕獲靶分子并用于測(cè)定表明靶分子的存在和/或量的值；微流體網(wǎng)路，至少將第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)相互連通；以及致動(dòng)器單元，適于通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關(guān)閉一部分微流體網(wǎng)路，來實(shí)現(xiàn)第一結(jié)構(gòu)和第二結(jié)構(gòu)之間的流體流動(dòng)。
[0248]例如，可以使用包含了第一孔502的裝置500。在這樣的實(shí)施方案中，形成含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物的步驟在第一孔中進(jìn)行。
[0249]裝置500可以包含第二孔512。在這樣的實(shí)施方案中，第一結(jié)合元件和第二結(jié)合元件被提供在第二孔中，并且將復(fù)合物與第一結(jié)合元件相接觸以將復(fù)合物結(jié)合在第一結(jié)合元件上的步驟，從第一結(jié)合元件上釋放至少一部分量的靶核酸的步驟，形成一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸的復(fù)合物的步驟，將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟，以及測(cè)定表明捕獲在第二結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的步驟，在第二孔中進(jìn)行。
[0250]按照被發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案，方法包括:
-形成物質(zhì)的組合物，該物質(zhì)包含:
一定量的報(bào)告化合物，
能夠結(jié)合報(bào)告化合物的結(jié)合元件，以及 一定量的能夠與報(bào)告化合物結(jié)合的靶核酸，
靶核酸與報(bào)告化合物的結(jié)合抑制了報(bào)告化合物與結(jié)合元件的結(jié)合；
-將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸結(jié)合；
-將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物結(jié)合在結(jié)合元件上；以及 -測(cè)定表明結(jié)合在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。
[0251]在第一步中，方法可以包括形成物質(zhì)的組合物，該物質(zhì)包含一定量的報(bào)告化合物，結(jié)合元件和一定量的靶核苷酸。本文使用的術(shù)語“形成組合物”是指上述成分的任何組合或混合。這可以通過將成分同時(shí)地，相繼地或分別地導(dǎo)入到適合用于進(jìn)行該方法的分析裝置的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)室中來實(shí)現(xiàn)。可選地，在將混合物導(dǎo)入裝置中之前，將單獨(dú)的成分進(jìn)行混合，也是可能的。
[0252]正如前面已經(jīng)描述的， 方法還可以使用一種以上的報(bào)告化合物和一種以上的靶核苷酸來進(jìn)行。因此，在某些實(shí)施方案中，形成物質(zhì)的組合物的步驟包括形成含有下列成分的物質(zhì)的組合物:
-一定量的第一報(bào)告化合物，
-一定量的能夠與第一報(bào)告化合物形成復(fù)合物的第一靶核酸，與第一報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了第一報(bào)告化合物被結(jié)合元件的捕獲，
-一定量的第二報(bào)告化合物，以及
-一定量的能夠與第二報(bào)告化合物形成復(fù)合物的第二靶核酸，與第二報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制了第二報(bào)告化合物被結(jié)合元件的捕獲。
[0253]裝置可以是任何適合于通過被發(fā)明的方法分析樣品的儀器設(shè)備。用于本方法的典型的裝置描述在本文中。這樣的裝置的示例性實(shí)施方案描述在圖17到19中。其它適合于進(jìn)行本方法的裝置描述在歐洲專利申請(qǐng)EP 06 122 695和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2007/051861中，每個(gè)專利申請(qǐng)?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖肌?br> [0254]在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)室可以包含兩個(gè)或多個(gè)子室。這可以通過提供帶有一個(gè)或多個(gè)分區(qū)或洞的第一表面和/或第二表面來實(shí)現(xiàn)，這些表面用作兩個(gè)或多個(gè)子室之間的側(cè)壁。
[0255]在其他實(shí)施方案中，用于本方法的裝置包括了一個(gè)以上反應(yīng)室，以在不同的反應(yīng)室中平行地執(zhí)行一個(gè)樣品的多個(gè)分析，或以連續(xù)的方式執(zhí)行分析的不同步驟。就此而言，反應(yīng)室可以彼此之間流體連通。流體連通包含了單個(gè)反應(yīng)室之間的任何相互連通，可以是直接地，也可以是間接地通過其它的方式例如共同的樣品導(dǎo)入通道，填充單元，加工單元等。但是，本文中使用的該術(shù)語不必需意味著在導(dǎo)入樣品后，反應(yīng)室彼此之間永久地流體連通。反應(yīng)室也可能是暫時(shí)流體連通的，例如通過位于反應(yīng)室之間的連接處的單向或雙向閥來實(shí)現(xiàn)。
[0256]在形成了物質(zhì)的組合物之后，方法可以包括將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟。換句話說，可以允許報(bào)告化合物與靶核酸結(jié)合，例如通過報(bào)告化合物和靶核酸的互補(bǔ)核苷酸序列的堿基配對(duì)形成雙鏈核酸分子。一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的存在的靶核酸形成復(fù)合物的事實(shí)，表明在分析開始時(shí)存在的報(bào)告化合物的總濃度可能超過存在的靶核酸的總濃度。
[0257]隨后，可以將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余量的報(bào)告化合物，通過上面描述的報(bào)告分子中包含的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域捕獲(即結(jié)合)到結(jié)合元件上(直接地，或結(jié)合到連接在結(jié)合元件上的捕獲分子上)。因?yàn)榘泻怂崤c報(bào)告分子的復(fù)合物的形成抑制了報(bào)告分子在結(jié)合元件上的捕獲，與執(zhí)行形成靶核酸/報(bào)告分子復(fù)合物的步驟之前存在的量相比，靶核酸/報(bào)告分子復(fù)合物的形成減少了可以被捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告分子的量。
[0258]最后，方法可以包括測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定，包括檢測(cè)/測(cè)定允許對(duì)捕獲(或重新捕獲)在結(jié)合元件上的報(bào)告分子進(jìn)行定性和/或定量測(cè)定的參數(shù)，例如電導(dǎo)性，氧化還原電勢(shì)，光吸收，熒光強(qiáng)度或生物發(fā)光?？梢灾粶y(cè)定這些參數(shù)中的一種，但是相伴地或相繼地測(cè)定一種以上的參數(shù)(例如電導(dǎo)性和由適合的標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光信號(hào)的強(qiáng)度)，也是可能的。
[0259]為了執(zhí)行檢測(cè)反應(yīng)，報(bào)告化合物可以包含一種或多種如上所述的可檢測(cè)標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物。可檢測(cè)標(biāo)記物可以整合或連接到報(bào)告分子上，例如以修飾的和/或標(biāo)記的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或雙脫氧核糖核苷酸的形式。
[0260]為了檢測(cè)這樣的標(biāo)記物，用于執(zhí)行方法的裝置還可以含有如上所述適合于測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的檢測(cè)系統(tǒng)，例如光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)可以與反應(yīng)室相連。典型情況下，檢測(cè)系統(tǒng)位于至少一個(gè)反應(yīng)室之一的對(duì)面，可選地位于發(fā)生檢測(cè)的特定表面區(qū)域的對(duì)面。
[0261]在某些實(shí)施方案中，方法還包括在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的革巴核酸形成復(fù)合物，將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上，以及測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的步驟之后，將剩余部分量的報(bào)告化合物從結(jié)合元件上釋放出來。本文使用的術(shù)語“釋放”，是指從結(jié)合元件上分開或解開報(bào)告分子。這可以通過例如裂解任何共價(jià)鍵來酶法實(shí)現(xiàn)，或者在核酸報(bào)告分子是通過核酸捕獲分子經(jīng)互補(bǔ)堿基配對(duì)而結(jié)合到結(jié)合元件上的情況下，通過增加分析發(fā)生在其中的反應(yīng)室中的溫度，從而導(dǎo)致核酸鏈的分離(即變性)來完成。
[0262]在其它實(shí)施方案中，釋放，形成復(fù)合物，捕獲和測(cè)定的步驟可以被重復(fù)額外的N次，其中N是大于或等于I的整數(shù)。換句話說，方法以循環(huán)的方式進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，整數(shù)N是≥5，≥10或≥20。
[0263]在某些實(shí)施方案中，在形成復(fù)合物的步驟之前，方法還包括將至少一部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上；測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值；以及從結(jié)合元件上釋放被捕獲的報(bào)告化合物。因此，進(jìn)行這些附加的步驟能夠測(cè)定在允許報(bào)告化合物與靶核酸之間形成復(fù)合物之前，最初存在的報(bào)告化合物的量。將獲得的值與將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上之后測(cè)定到的值進(jìn)行比較，提供了對(duì)樣品中存在的靶核酸的存在和/或量的測(cè)定。
[0264]在具體的實(shí)施方案中，方法還包括對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，也就是說，在將它們進(jìn)行進(jìn)一步分析之前增加它們?cè)跇悠分写嬖诘牧?，以便于進(jìn)一步的檢測(cè)。典型情況下，靶核酸的擴(kuò)增通過循環(huán)式擴(kuò)增的方式來實(shí)現(xiàn)。循環(huán)式擴(kuò)增可以包含任何等于或大于2的數(shù)量的擴(kuò)增循環(huán)。通常，循環(huán)式擴(kuò)增反應(yīng)包括至少10個(gè)或至少20個(gè)循環(huán)。示例性的循環(huán)式擴(kuò)增是如上所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
[0265]在進(jìn)行分析期間，表明靶核酸的存在和/或量的值的檢測(cè)/測(cè)定，可以只進(jìn)行一次，也可以進(jìn)行一次以上。在單一分析過程中進(jìn)行一個(gè)以上檢測(cè)步驟的情況下，計(jì)算獲得的結(jié)果的平均值。在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)，可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】的專業(yè)人員所熟知的適合的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析和數(shù)學(xué)處理，以確定尤其是一種或多種靶核酸的存在，長(zhǎng)度或序列，和/或計(jì)算它/它們的量。[0266]參考圖la，用于測(cè)定分子靶的方法100包含了裂解步驟102 (用于在存在帶有錨定基團(tuán)的捕獲分子的情況下裂解樣品，例如全血)，復(fù)合物形成步驟110 (用于形成HIV核酸和帶有錨定基團(tuán)的捕獲探針的復(fù)合物，例如雜交)，捕獲步驟114 (用于通過錨定基團(tuán)將復(fù)合物捕獲在固相基質(zhì)上)，清洗步驟118 (用于除去所有未結(jié)合的物質(zhì)，例如核酸，蛋白，低分子量污染物等)，擴(kuò)增步驟120 (用于擴(kuò)增和標(biāo)記捕獲的核酸)和檢測(cè)步驟126 (用于檢測(cè)擴(kuò)增子)。按照方法100，多核苷酸從樣品的一種或多種靶病原體中釋放。被釋放的與靶病原體有關(guān)的多核苷酸被捕獲在表面上。將被捕獲的多核苷酸與樣品中的相伴物質(zhì)(例如擴(kuò)增抑制劑)分離開來。分離出的捕獲的多核苷酸被擴(kuò)增以形成擴(kuò)增子。通過檢測(cè)擴(kuò)增子確定多核苷酸的存在。因?yàn)閿U(kuò)增的多核苷酸與祀病原體有關(guān)，一種或多種祀病原體的存在和/或身份可以被確定(例如定性地和/或定量地)。在示例性的實(shí)施方案中，方法100包括了根據(jù)血液樣品中存在的一種或多種病毒的測(cè)定來測(cè)定病毒載量。下面，將討論方法100的各個(gè)不同的步驟。
[0267]在裂解步驟102中，多核苷酸106從血液樣品104中存在的病原體中釋放?？梢园凑账璺椒▽⒍嗪塑账釓陌胁≡w中釋放(例如熱的，化學(xué)的，機(jī)械的方法，或通過它們的組合)。在示例性實(shí)施方案中，通過將樣品104與含有裂解樣品中的病原體的物質(zhì)的裂解液體相組合來釋放多核苷酸。能夠裂解病原體的液體的例子可以在Boom R., Sol C.J.,Salimans M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J.,Rapid And Simple Method For Purification Of Nucleic Acids,(用于純化核酸的快速和簡(jiǎn)單的方法)J.Clin.Microbiol.1990 Mar; 28 (3):495-503,中發(fā)現(xiàn)，在此引為參考。
[0268]示例性的裂解液體含有一種或多種變性劑(例如硫氰酸胍(GuSCN)(例如大約4.57M))，pH緩沖劑(例如Tris-HCl (例如pH 6.4,45 mM)，螯合劑(例如EDTA 20mM)，以及去污劑(例如 Triton X-100，1.2% (w/v)和 / 或皂苷(例如 0.2 %))，鹽(例如 MgCl2 (例如 75 mM)和 / 或 ZnCl2 (例如 I mM))。
[0269]裂解步驟102典型情況下包括形成含有被釋放的多核苷酸106，樣品104的伴隨物(例如細(xì)胞成分，擴(kuò)增抑制劑，蛋白和其它物質(zhì))以及捕獲分子108i的混合物。每個(gè)捕獲分子108i含有多核苷酸結(jié)合部分109i和生物素錨定基團(tuán)111。每個(gè)多核苷酸結(jié)合部分109i是與多核苷酸106的不同區(qū)域互補(bǔ)的(例如特異性針對(duì)它的)多核苷酸序列。例如，捕獲分子108a含有與多核苷酸106的靶區(qū)域113互補(bǔ)的結(jié)合部分109a，捕獲分子108b含有與多核苷酸106的不同的靶區(qū)域115互補(bǔ)的結(jié)合部分109b。典型情況下，對(duì)于每個(gè)被測(cè)定的多核苷酸，使用至少一種(例如兩種或以上，三種或以上，四種或以上)不同的捕獲分子。
[0270]在某些實(shí)施方案中，多核苷酸106在存在捕獲分子108i的情況下從靶病原體中釋放。這可以通過例如將樣品104基本上同時(shí)與捕獲分子108i和裂解液體成分進(jìn)行組合來完成。樣品104可以與捕獲分子108i組合，裂解液體成分可以與捕獲分子108i組合，裂解液體成分在液體狀態(tài)或干燥(例如冷凍干燥)狀態(tài)下。
[0271]在可選的實(shí)施方案中，多核苷酸從樣品104的病原體中釋放，獲得的混合物與捕獲分子108i組合。例如，可以將樣品104和除了捕獲分子108i之外的裂解液體成分組合，并允許溫育一段時(shí)間，然后再將溫育過的混合物與捕獲分子108i組合。
[0272]在示例性的實(shí)施方案中，多核苷酸106是HIV-RNA，捕獲分子108i的結(jié)合部分109?與其區(qū)域互補(bǔ)。
[0273]現(xiàn)在轉(zhuǎn)到復(fù)合物形成步驟110，將一種或多種捕獲分子108i與多核苷酸106組合(例如與其雜交)，以形成復(fù)合物112。復(fù)合物形成步驟110可以通過例如允許被釋放的多核苷酸106在存在捕獲分子108i的情況下溫育一段足以形成復(fù)合物112的時(shí)間來進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中,溫育時(shí)間為至少大約60秒(例如至少大約120秒，至少大約360秒)。在某些實(shí)施方案中，溫育時(shí)間為大約600秒或以下(例如大約480秒或以下，大約420秒或以下)。在示例性的實(shí)施方案中，溫育時(shí)間是大約5分鐘。
[0274]對(duì)于每個(gè)被測(cè)定的多核苷酸來說，捕獲分子108i的總濃度典型情況下足以捕獲復(fù)合物112中的大部分(例如至少60%，至少75%，至少90%，基本上全部)多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，一種或多種(例如 大部分或全部)捕獲分子108i的每種的濃度是至少大約
0.ΙμΜ (例如至少大約0.25 μ Μ，至少大約0.5 μ Μ)。一種或多種(例如大部分或全部)捕獲分子的每種中的濃度，在典型情況下是大約2 μ M或以下(例如大約1.5 μ M或以下，大約
Iμ M或以下)。在示例性的實(shí)施方案中，一種或多種(例如大部分或全部)捕獲分子的每種的濃度是大約0.625 μ Mo
[0275]轉(zhuǎn)到捕獲步驟114，將復(fù)合物112和捕獲粒子117組合以形成復(fù)合物119。每個(gè)捕獲復(fù)合物119含有一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物112和捕獲粒子117。復(fù)合物112典型情況下非選擇性地結(jié)合到粒子117上。每個(gè)捕獲粒子117含有鏈親和素捕獲表面116。捕獲粒子117通過捕獲分子108i的一個(gè)或多個(gè)生物素錨定基團(tuán)111與鏈親和素捕獲表面116之間的相互作用捕獲每個(gè)復(fù)合物112。示例性的捕獲粒子117包括直徑為大約34 μ M的鏈親和素瓊脂糖珠子(Amersham),該珠子用diH20預(yù)先清洗以除去乙醇。每次分析使用大約10，000到20，000顆珠子，相當(dāng)于每10 μ L全血大約3 nmol生物素的結(jié)合能力。
[0276]典型情況下，捕獲步驟114在將樣品104與多核苷酸106和捕獲分子108i溫育一段足以形成復(fù)合物112的時(shí)間后開始。例如，樣品104可以在存在裂解液體和捕獲分子108?的情況下溫育，然后將獲得的混合物與捕獲粒子117組合。
[0277]典型情況下，捕獲分子108i和粒子117的總濃度，足以定量捕獲與樣品104中的一種或多種祀病原體中的每種有關(guān)的一種或多種選定的多核苷酸106中的每種。因此,對(duì)于每種被測(cè)定的多核苷酸106來說，基本上所有(例如至少75%，至少90%，至少95%，至少97.5%或基本上所有)的多核苷酸被捕獲分子108i和粒子117捕獲。
[0278]轉(zhuǎn)向清洗步驟118，將捕獲復(fù)合物119與沒有被粒子117捕獲的相伴的物質(zhì)(例如核酸，蛋白，細(xì)胞成分，裂解試劑等)分離開。在某些實(shí)施方案中，使用具有小得足以阻止復(fù)合物119通過，但大得足以允許沒有被粒子117捕獲的物質(zhì)通過的孔徑的過濾器，對(duì)捕獲復(fù)合物119進(jìn)行過濾。
[0279]捕獲復(fù)合物119可以用清洗液體清洗，以增加與相伴的物質(zhì)的分離。在某些實(shí)施方案中，使用了兩種或以上不同的清洗液體。在某些實(shí)施方案中，第一清洗液體含有去污劑以除去通過疏水相互作用粘附到粒子上的低分子量物質(zhì)，蛋白和其它細(xì)胞成分，第二清洗液體用于除去去污劑，否則可能干擾隨后的擴(kuò)增過程。示例性的第一清洗液體包含0.15 MLiCl, 0.1% SDS(因?yàn)镾DS是PCR抑制劑，它可以在PCR步驟前被除去)，10 mM Tris-HCl pH
8.0 和 I mM EDTA。示例性的第二清洗液體包含 0.15 M LiCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTA。適合的清洗液體被描述在例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開N0.20040215011A1中，以其全文引為參考。
[0280]轉(zhuǎn)向擴(kuò)增步驟120，使用探針122對(duì)多核苷酸106進(jìn)行擴(kuò)增。典型情況下，擴(kuò)增是PCR擴(kuò)增。在示例性的實(shí)施方案中，多核苷酸106是RNA，擴(kuò)增是RT-PCR。在某些實(shí)施方案中，病原體是HIV。
[0281]參考圖ld，在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增步驟120產(chǎn)生了擴(kuò)增子130。在雜交條件(例如溫度)下，擴(kuò)增子130被固定在粒子117的鏈親和素表面116上的捕獲探針分子108a，108b和108c捕獲。將擴(kuò)增子用熒光標(biāo)記試劑125標(biāo)記，該試劑中含有光學(xué)標(biāo)記物124 (例如熒光標(biāo)記物)和與擴(kuò)增子130的區(qū)`域互補(bǔ)的多核苷酸部分129。
[0282]參考圖le，在可選的實(shí)施方案中，每個(gè)探針122包含光學(xué)標(biāo)記物124 (例如熒光標(biāo)記物)。其它的探針108j包含與擴(kuò)增子130的區(qū)域互補(bǔ)的多核苷酸部分109j，并且還帶有生物素錨定基團(tuán)111。將探針分子108 j捕獲到粒子117的鏈親和素表面116上。擴(kuò)增步驟124產(chǎn)生了直接標(biāo)記的擴(kuò)增子130，每個(gè)擴(kuò)增子含有標(biāo)記物124。將擴(kuò)增子130用固定在粒子117的鏈親和素表面116上的探針分子108j捕獲。探針108j的結(jié)合部分109j可以與用于捕獲步驟114的探針108i的相同或不同。探針108j和/或珠子117可以與多核苷酸106以及其它用于進(jìn)行擴(kuò)增步驟120的成分混合。
[0283]在檢測(cè)步驟126中，擴(kuò)增子130被檢測(cè)(例如通過標(biāo)記物111的熒光檢測(cè))。檢測(cè)步驟126可以用捕獲在粒子117的鏈親和素表面116上的擴(kuò)增子130來進(jìn)行?？梢赃M(jìn)行檢測(cè)步驟126，而不用首先將擴(kuò)增子與不含探針122的液體組合。例如，可以使用在減小了表面的距離后在第一和第二表面之間存在的捕獲的擴(kuò)增子130來進(jìn)行檢測(cè)步驟126。這種用于進(jìn)行檢測(cè)步驟126的方法的實(shí)施方案接下來參考圖1b和圖1c進(jìn)行討論。
[0284]參考圖1b和圖lc，用于進(jìn)行方法100的至少檢測(cè)步驟126的系統(tǒng)200，含有微流體盒202，檢測(cè)系統(tǒng)210，型板致動(dòng)器212，以及與檢測(cè)系統(tǒng)210和致動(dòng)器212相連的處理器218。
[0285]盒202包含了第一基體206和第二基體208，它們一起限定了檢測(cè)室204。第一基體206典型情況下對(duì)于用于激發(fā)和檢測(cè)來自擴(kuò)增子130的標(biāo)記物124的熒光的光的波長(zhǎng)來說是透光的(例如透明的)。第一基體206可以由例如聚合物，玻璃或硅石形成。第二基體208由可彎曲的或撓性的材料(例如彈性聚合物)形成。第一基體206—般不如第二基體208撓性。
[0286]致動(dòng)器212含有型板214和被成形用于驅(qū)動(dòng)型板朝向和遠(yuǎn)離第二基體208的型板驅(qū)動(dòng)器236。型板致動(dòng)器236可以由例如壓縮空氣，電磁鐵，壓電式裝置或其它適合的致動(dòng)裝置致動(dòng)。如圖1c中所示，當(dāng)被致動(dòng)朝向第二基體208的壁238時(shí)，型板214減少了第一基體206的內(nèi)壁232與第二基體208的內(nèi)壁234之間的距離“d”。在圖1c的減少的距離狀態(tài)下，至少某些帶有被捕獲的擴(kuò)增子130的捕獲粒子117保留在表面232和234之間。相反，大部分圍繞著粒子117的液體從表面232和234之間被移走。
[0287]檢測(cè)系統(tǒng)210被構(gòu)造為在圖1c的減少的距離狀態(tài)下檢測(cè)盒202中擴(kuò)增子130的存在。檢測(cè)系統(tǒng)210包含光源246(例如激光器)，成像檢測(cè)器240以及光學(xué)系統(tǒng)242。在使用中，光源246照亮存在于基體206和208的內(nèi)表面232和234之間的物質(zhì)。從擴(kuò)增子130的標(biāo)記物124發(fā)射的熒光250被檢測(cè)。被檢測(cè)到的熒光250指示擴(kuò)增子130的存在。處理器218接收來自檢測(cè)系統(tǒng)210的指示了被檢測(cè)的熒光的信號(hào)。處理器218可以測(cè)定擴(kuò)增子130的存在，因此也能夠測(cè)定樣品104中相應(yīng)病原體的存在。
[0288]一般來說，保留在內(nèi)表面232和234之間的液體發(fā)射出與擴(kuò)增子130的存在無關(guān)的背景熒光252。背景熒光252的強(qiáng)度通常與保留在內(nèi)表面232和234之間的液體的量成比例。但是，來自擴(kuò)增子130的標(biāo)記物124的標(biāo)記物熒光250的強(qiáng)度，在空間上位于粒子117的附近。成像檢測(cè)器240接收和檢測(cè)標(biāo)記物熒光250和背景熒光252。但是，因?yàn)樵趫D1c的減少的距離狀態(tài)下液體從內(nèi)表面232和234之間被移走，因此與圖1b的未減少的狀態(tài)下相比，標(biāo)記物熒光252相對(duì)于背景熒光250的信噪比較高。
[0289]方法100的示例性實(shí)施方案可以如下進(jìn)行。從個(gè)體獲得大約5到10 μ L的毛細(xì)血管血液(例如指尖，耳垂)。將血樣與大約90 μ L含有裂解成分和捕獲分子108i的裂解緩沖液組合。將得到的混合物在21°C攪拌溫育大約5分鐘。將溫育過的混合物與對(duì)應(yīng)于3nmol生物素結(jié)合能力的相當(dāng)于大 約10 μ L漿液的量的粒子117 (即作為在20%乙醇中的粒子漿液購(gòu)買的粒子)組合。將含有粒子的混合物在21°C攪拌溫育大約5分鐘。溫育后，通過用型板致動(dòng)器系統(tǒng)350操作盒300來除去上清液。將粒子用第一清洗緩沖液清洗(例如每次用50 μ L體積清洗，共3次)，然后用第二清洗緩沖液清洗(例如每次用50 μ L體積清洗，共3次)。清洗后，除去上清液。將清洗過的粒子與擴(kuò)增介質(zhì)組合，并進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)(例如定量)被捕獲的多核苷酸106。
[0290]參考圖14，檢測(cè)了來自擴(kuò)增子130的熒光(例如，使用儀器的減少的距離模式，例如圖1b和圖1c中顯示的)。擴(kuò)增子130可以在擴(kuò)增的多個(gè)不同加熱和冷卻循環(huán)的每個(gè)循環(huán)之后進(jìn)行檢測(cè)。通過這種方式，可以及時(shí)跟蹤擴(kuò)增子濃度的增加。典型情況下，擴(kuò)增子在結(jié)合到粒子117上時(shí)被檢測(cè)到。
[0291]盡管在描述方法100時(shí)包含了從病原體釋放多核苷酸的步驟，但方法100可以包含其它用于提供多核苷酸的步驟。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸從非病原性細(xì)胞(例如植物，人類，動(dòng)物等)釋放。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸是基因表達(dá)分析的產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸的提供不需要釋放步驟，和/或提供為已經(jīng)從細(xì)胞或其它生物學(xué)樣品中釋放出來的多核苷酸。
[0292]接下來，將討論典型情況下能夠進(jìn)行方法100的大多數(shù)(例如所有)步驟的分析系統(tǒng)和微流體盒的實(shí)施方案。[0293]參考圖2，微流體盒300含有第一基體301，第二基體303和微流體網(wǎng)路305。第一和第二基體301和303可以具有與對(duì)盒202的基體206和208所描述的相似的性質(zhì)。
[0294]微流體網(wǎng)路305被構(gòu)造為接受樣品和各種不同的試劑材料，允許對(duì)這些材料進(jìn)行操作(例如混合，運(yùn)輸和溫育)，以便于表明一種或多種靶病原體的存在的擴(kuò)增子的檢測(cè)。
[0295]微流體網(wǎng)路305包含了樣品入口 302，它通過通道304與裂解室306相連，裂解室通過通道308和接頭307與檢測(cè)室332相連；第一液體入口 310通過通道312與第一試劑室314相連，該第一試劑室通過通道316與接頭307相連；第二液體入口 318通過通道319與第二試劑室320相連，該第二試劑室通過通道322與接頭307相連；第三液體入口 324通過通道326與擴(kuò)增標(biāo)記試劑室328相連，該擴(kuò)增標(biāo)記試劑室通過通道330與接頭307相連。接頭307通過廢物通道336與廢物室334相連。檢測(cè)室332通過廢物通道340與廢物室334相連，廢物通道含有過濾器，其大小可以阻止粒子317通過，但是允許在方法100的清洗步驟118中描述的未捕獲的物質(zhì)通過。
[0296]
典型情況下，試劑室306，314，320，328含有用于進(jìn)行方法100所述的步驟的冷凍干燥的試劑(例如作為丸粒)。在使用中，液體(例如水，緩沖液，水性溶劑或其它液體)被導(dǎo)入到相應(yīng)室的入口中。液體使冷凍干燥的試劑溶解，形成了液體。在示例性的實(shí)施方案中，裂解室306含有促進(jìn)靶病原體的裂解的冷凍干燥的試劑和對(duì)應(yīng)于病原體的多核苷酸的捕獲分子308i。典型情況下，反應(yīng)室306的冷凍干燥的試劑用樣品(例如全血樣品)單獨(dú)溶解，或與加入的液體組合起來溶解。在示例性實(shí)施方案中，室314含有冷凍干燥的試劑，當(dāng)與導(dǎo)入到入口 310的液體組合時(shí)形成了清洗液體(例如第一清洗液體(緩沖液))。示例性實(shí)施方案中，室320含有冷凍干燥的試劑，當(dāng)與導(dǎo)入到入口 318的液體組合時(shí)形成了清洗液體(例如第二清洗液體(緩沖液))。在示例性實(shí)施方案中，室328含有冷凍干燥的試劑，當(dāng)與導(dǎo)入到入口 324的液體組合時(shí)形成了擴(kuò)增混合物(例如第二清洗液體(緩沖液))。
[0297]典型情況下，在使用裝置300之前，粒子116被放置在室306的網(wǎng)路305的下游中。例如，在使用前粒子116可以放置在檢測(cè)室332中。粒子116可以通過下面討論的型板的適合的致動(dòng)，用來自室306，314，320，328的液體清洗。
[0298]參考圖3，顯示了微流體盒300以及用于操作盒300的型板致動(dòng)系統(tǒng)350。致動(dòng)器系統(tǒng)300含有致動(dòng)器基部352和多個(gè)型板354i。每個(gè)型板354i用與型板驅(qū)動(dòng)器236相似的相應(yīng)的型板驅(qū)動(dòng)器來致動(dòng)。在使用中，盒300隨著撓性基體303定位，面對(duì)著致動(dòng)器基部352和型板354i。每個(gè)型板354i在空間上對(duì)應(yīng)于微流體網(wǎng)路305的不同位置。例如，型板354d對(duì)應(yīng)于廢物通道336。當(dāng)致動(dòng)時(shí)，型板354d壓迫覆蓋在通道336上的基體303，從而阻塞了通道336，并阻止流體沿著它們通過。
[0299]因此，第二基體303或覆蓋元件的撓性性質(zhì)，確保了當(dāng)型板施加機(jī)械力在撓性的第二基體303的指定部分上時(shí)，它可以可逆的方式變形。換句話說，如果需要可逆的閥作用，第二基體303的變形是可逆的，使得當(dāng)型板354i施加的力量被除去時(shí)，第二基體303返回到其初始的位置，使得流體可以再次沿著相應(yīng)的通道336通過。
[0300]與此相反，第一基體301的剛性性質(zhì)是指第一基體301的材料被構(gòu)造為使得一旦通過型板354i施加力到第一基體301上，第一基體301不會(huì)發(fā)生對(duì)閥的功能有影響的變形。因此，第二基體303提供了撓性，而第一基體301提供了穩(wěn)定性。[0301]其它型板類似地對(duì)應(yīng)于網(wǎng)路305的其它通道。型板354a和354c分別對(duì)應(yīng)于廢物通道340和接頭307。型板354a和354c的致動(dòng)封閉了檢測(cè)室332，允許進(jìn)行多個(gè)加熱和冷卻的循環(huán)而不顯著損失其中的液體。過濾器341允許用來自室306，314，320和328的液體清洗室332中的粒子116而不損失粒子。還有其它的型板，分別對(duì)應(yīng)于室306，314，320，328和332。這些型板的重復(fù)致動(dòng)可用于攪拌室中的物質(zhì)(例如液體)，以便于混合(例如樣品和試劑的混合)。沿著通道順序地致動(dòng)型板可用于沿著通道移動(dòng)液體。可以通過例如致動(dòng)相應(yīng)的型板操作室的上游，下游和上方，來清空室中的內(nèi)含物。
[0302]在一個(gè)實(shí)施方案中，基體是足夠可逆的，使得在重復(fù)的型板致動(dòng)和移除后(例如至少10次致動(dòng)和移除，或至少50次致動(dòng)和移除)，基體返回到其原始位置，使得微流體網(wǎng)路位于特定型板下的部分可以被重復(fù)地阻塞和重新打開。
[0303]盒300可以如下操作。將一定量(例如大約5-10 μ L之間)的樣品(例如全血)和任選量(例如大約5到50 μ L之間)的液體(例如水)通過入口 302導(dǎo)入到室306的網(wǎng)路305中。將一定量(例如大約20到200 4 1^之間)的液體通過相應(yīng)的入口導(dǎo)入到室314，320和328中。分別導(dǎo)入的樣品和任選的液體使室306，314，320和328中存在的冷凍干燥試劑復(fù)溶。對(duì)應(yīng)于每個(gè)室的型板被致動(dòng)，攪拌其中的液體試劑混合物，以促進(jìn)混合。在裂解室306中，裂解緩沖液從病原體釋放多核苷酸106 (例如像在裂解步驟102中那樣)。將釋放的多核苷酸與捕獲分子108i組合以形成復(fù)合物112 (例如像在復(fù)合物形成步驟110中那樣)。
[0304] 將室306中的裂解混合物移到檢測(cè)室332中，并與粒子116混合和溫育，形成了捕獲復(fù)合物119 (例如，像在捕獲步驟114中那樣)。室332中的混合物可以例如使用型板進(jìn)行攪拌。在捕獲步驟114溫育結(jié)束時(shí)，使用操作盒300的型板致動(dòng)系統(tǒng)350將液體/上清液從檢測(cè)室332移除到廢物室334中。
[0305]在從廢物室332除去液體/上清液后，將清洗液體從室314和320通過室332移動(dòng)，以便將復(fù)合物119與相伴的物質(zhì)分離開(例如，像在清洗步驟118中那樣)。在清洗過程中可以通過型板354b對(duì)室332進(jìn)行攪拌。
[0306]在室332中將相伴物質(zhì)與復(fù)合物119分離后，將擴(kuò)增試劑從室328移動(dòng)到檢測(cè)室332，對(duì)得到的內(nèi)含物進(jìn)行多次PCR循環(huán)(例如，像在擴(kuò)增步驟120中那樣)。
[0307]在一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的每個(gè)循環(huán)后，致動(dòng)型板354b以減小檢測(cè)室332的相對(duì)的內(nèi)表面之間的距離。復(fù)合物119，如果存在的話，保持捕獲在內(nèi)表面之間，而其他內(nèi)含物則相對(duì)被除去，如同在圖1c中對(duì)于裝置200討論的那樣。檢測(cè)一般使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行(例如像對(duì)裝置200描述的那樣)。典型情況下，對(duì)復(fù)合物112的擴(kuò)增子130進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增子處于雜交狀態(tài)并結(jié)合到粒子117，類似于復(fù)合物119 (例如，像在檢測(cè)步驟126中那樣)。在每個(gè)循環(huán)之后，擴(kuò)增子130的群體數(shù)量增加。從捕獲復(fù)合物119產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也隨之增加?？梢员O(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)數(shù)的增加，以確定可以對(duì)擴(kuò)增子130進(jìn)行定量的閾值循環(huán)。因?yàn)槎嗪塑账?06的捕獲是定量進(jìn)行的(例如，像在捕獲步驟114中那樣)，因此擴(kuò)增子130的定量檢測(cè)允許對(duì)樣品中存在的多核苷酸106的量進(jìn)行定量測(cè)定。因此，在例如病原體是病毒(例如HIV)的情況下，樣品(例如全血)中的病毒載量可以被測(cè)定。
[0308]盒300還可以包括含有多個(gè)固定化的多核苷酸的陣列，每個(gè)多核苷酸對(duì)應(yīng)于不同病原體亞型的多核苷酸序列。在檢測(cè)步驟126之后，進(jìn)行擴(kuò)增子130的雜交以確定病原體亞型。在示例性的實(shí)施方案中，陣列含有被構(gòu)造為以確定HIV的亞型的多核苷酸。[0309]盡管描述的盒300的操作包含了添加液體試劑，但液體試劑也可以儲(chǔ)存在盒上，例如在透明包裝(blister pack)中，并在使用時(shí)釋放。
[0310]適合于光學(xué)測(cè)定標(biāo)記物124的存在的系統(tǒng)的其它例子被描述在下列每個(gè)申請(qǐng)中:2005年I月6日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP2005/004923的美國(guó)連續(xù)申請(qǐng)，該國(guó)際專利申請(qǐng)指定美國(guó)并要求了 2004年I月6日提交的德國(guó)專利申請(qǐng)DE 10 2004 022 263的優(yōu)先權(quán)，以及2006年11月6日提交的專利申請(qǐng)?zhí)朜0.US 11/593，021的美國(guó)連續(xù)申請(qǐng)，每個(gè)這些申請(qǐng)以其全文引為參考。
[0311]接下來，參考圖4到圖16，將對(duì)按照示例性實(shí)施方案的分析過程中的各種不同步驟進(jìn)行解釋。
[0312]圖4圖示了裂解室。
[0313]圖5到圖10圖示了 RNA復(fù)合物在固相基質(zhì)上的捕獲。
[0314]圖11圖示了清洗。
[0315]圖12和圖13圖示了擴(kuò)增。
[0316]圖14到圖16圖示了檢測(cè)。
[0317]圖17a圖示了示例性的系統(tǒng)400，用于執(zhí)行至少?gòu)臉悠凡东@靶，擴(kuò)增靶和檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)表明樣品中靶的存在的值的步驟。
[0318]圖17b圖示了示例性的系統(tǒng)400，用于執(zhí)行至少?gòu)臉悠凡东@靶，擴(kuò)增靶和在操作狀態(tài)下檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)表明樣品中靶的存在的值的步驟。
[0319]圖17c圖示了在圖17a和17b中描繪的閥單元435的示例性實(shí)施方案。
[0320]圖17d圖示了在圖17c中描繪的閥2的示例性實(shí)施方案。
[0321]參考圖17a和b，示例性的系統(tǒng)400包含了微流體盒401，檢測(cè)系統(tǒng)455，用于加熱至少一部分盒的系統(tǒng)451，致動(dòng)器元件441-444和致動(dòng)器437-440，閥單元435，壓縮機(jī)431，液體儲(chǔ)存器461和處理器471。
[0322]盒401包含了基體402和第一覆蓋元件403，它們共同限定了第一和第二孔408和407。第一覆蓋元件403是至少部分撓性的，允許覆蓋元件被可逆地壓向基體402。盒還含有第二覆蓋元件，與基體402 —起限定了通道410，411和412。在某些實(shí)施方案中，第二覆蓋元件也是至少部分撓性的。通道和孔通過洞413，414，415，416相互連通，以形成微流體網(wǎng)路。
[0323]在各種不同的實(shí)施方案中，基體402可以是由任何適合的材料，例如塑料，玻璃，金屬或半導(dǎo)體制成的物理體。它可以是任何基本上平面的(即二維的)或非平面的(即三維的)表面。這樣的三維物體的例子是具有腔或洞的物理體，包括含有流體通路(例如通道)的反應(yīng)室(其中可以發(fā)生生物，化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng))。
[0324]第一孔408，也可以被稱為裂解孔，適于容納流體，并用于釋放細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物，內(nèi)含物中含有通過系統(tǒng)400分析的靶分子。例如，第一孔408可以適于通過包含上述的裂解試劑409來釋放細(xì)胞，孢子或病毒的內(nèi)含物。裂解試劑409可以以干燥的形式提供。
[0325]第二孔407也可以被稱為中心孔，適于容納流體，并含有粒子406作為第一結(jié)合元件，粒子適于捕獲與捕獲分子復(fù)合的靶，并任選地含有第二結(jié)合元件417，適于捕獲報(bào)告分子。第二孔407還含有過濾元件405，以阻止粒子406通過，但允許氣體，液體和溶解在液體中的物質(zhì)通過?？?07和408經(jīng)過洞415和414通過通道411相互連通。
[0326]更通常來說，第一或第二孔408，407可以是任何結(jié)構(gòu)，即任何可以用作載體以接受樣品或物質(zhì)的物理實(shí)體。特別是，這樣的結(jié)構(gòu)可以包含凹陷例如溝槽，孔或通道，或者也可以包括其中可以容納物質(zhì)，并通過它可以移動(dòng)物質(zhì)的材料,例如凝膠。
[0327]在各種不同的實(shí)施方案中，結(jié)合元件含有被成形成結(jié)合具有特定構(gòu)型的分子的部件。這樣的結(jié)合元件可以是也可以不是固定在表面上的分子。結(jié)合能力也可以直接來自于表面構(gòu)型(例如多孔的表面結(jié)構(gòu))。將結(jié)合元件提供作或提供在三維元件例如珠子或多孔支持物上，也是可能的。然后這樣的三維元件的表面，或結(jié)合到三維元件例如粒子的表面上的分子，可以用作結(jié)合元件。對(duì)不同分子敏感的不同結(jié)合元件，也可以布置(例如以類似矩陣的方式)在結(jié)構(gòu)的表面上。結(jié)合元件的例子在上面與本文公開的各種不同方法一起進(jìn)行了描述。
[0328]裂解孔408和中心孔407的體積可以是100 μ L。在示例性實(shí)施方案中，通道410-412的寬度是200 μ m，通道410-412的高度是100 μ m。
[0329]在各種不同的實(shí)施方案中，這樣的微流體網(wǎng)路可以包含一個(gè)或多個(gè)通道和/或孔，它們可以彼此相互連通。例如，這樣的微流體網(wǎng)路的各種不同通道可以是分叉的或分支的，從而允許沿著預(yù)定的路徑通過微流體網(wǎng)路運(yùn)輸液體(未顯示)。
[0330]系統(tǒng)400還可以包含致動(dòng)器系統(tǒng)，它含有由氣動(dòng)致動(dòng)器437，438，439，440驅(qū)動(dòng)的致動(dòng)器元件441，442，443和444，以及閥單元435，壓縮機(jī)431和壓縮空氣儲(chǔ)存器433。壓縮機(jī)431可以經(jīng)常調(diào)整壓縮空氣儲(chǔ)存器433中的預(yù)定壓力。
[0331]每個(gè)致動(dòng)器元件441，442，443，444由相應(yīng)的致動(dòng)器致動(dòng)。在使用中，盒401用至少部分撓性的覆蓋元件403定位到面對(duì)致動(dòng)器和致動(dòng)器元件。每個(gè)致動(dòng)器元件在空間上對(duì)應(yīng)于盒401的微流體網(wǎng)路的不同`位置。例如，致動(dòng)器元件442對(duì)應(yīng)于洞414，它經(jīng)過通道411和洞415通向孔407。當(dāng)致動(dòng)時(shí)，致動(dòng)器元件442壓縮覆蓋在洞414上的至少部分撓性的蓋子403，從而阻塞了洞414，防止流體沿著它通過。其它致動(dòng)器元件類似對(duì)應(yīng)于其它結(jié)構(gòu)。例如，致動(dòng)器元件443和444分別對(duì)應(yīng)于洞415和416。致動(dòng)器元件415和416的致動(dòng)密封了第二孔407，允許例如進(jìn)行多個(gè)加熱和冷卻循環(huán)，而不明顯損失其中的液體。
[0332]對(duì)于致動(dòng)器元件442的示例性的致動(dòng)來說,控制單元發(fā)送信號(hào)到閥單元。閥單元打開通向致動(dòng)器438的氣動(dòng)接頭436，從而對(duì)致動(dòng)器438施加壓力。因此，致動(dòng)器元件442移動(dòng)出來，壓縮覆蓋著洞414的至少部分撓性的蓋子403。為了釋放致動(dòng)器元件，控制單元發(fā)送相應(yīng)的信號(hào)到閥單元。閥單元關(guān)閉通向致動(dòng)器438的氣動(dòng)接頭，從而將致動(dòng)器元件442移動(dòng)回來，釋放了覆蓋著洞414的至少部分撓性的蓋子403。
[0333]致動(dòng)器元件可以適于使第一撓性的蓋子403彈性變形，以執(zhí)行各種不同的任務(wù)。例如，如上所述，致動(dòng)器元件442適于壓縮覆蓋著洞414的至少部分撓性的蓋子403，從而阻塞洞414，并阻止流體沿著它流過，而致動(dòng)器元件441適于通過重復(fù)地壓住和釋放覆蓋著孔408的第一撓性蓋子來將液體在孔408中移動(dòng)。
[0334]在一個(gè)實(shí)施方案中，致動(dòng)器元件可以是能夠通過機(jī)械力選擇性打開或關(guān)閉微流體網(wǎng)路的每個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)的元件。例如，這樣的致動(dòng)器元件可以是銷針或型板，它們可以壓向撓性的覆蓋元件，將后者壓到基體的表面上，從而選擇性地打開或關(guān)閉通道。
[0335]在某些實(shí)施方案中，致動(dòng)器元件441，442，443和444的尖端由彈性材料制成，例如硅酮，樹膠等。致動(dòng)器元件442，443和444的直徑可以是洞414，415和416的直徑的1.5倍。洞414，415和416的典型的直徑是0.5 mm。
[0336]如上所述，提供了與致動(dòng)器437-440相連的氣動(dòng)閥單元435。閥單元435從控制單元471接收驅(qū)動(dòng)信號(hào)。因此,控制單元471控制致動(dòng)器元件441-444的操作。
[0337]提供了控制單元471例如微處理器，適于控制流體樣品的分析，使得流體樣品的靶分子被捕獲在結(jié)合元件406上。控制單元471還控制中心孔407中的靶分子的擴(kuò)增。此外，控制單元471控制表明靶分子的存在和/或量，并捕獲在結(jié)合元件417上的化合物的檢測(cè)。在靶分子分析的過程中，所有固相結(jié)合過程發(fā)生在中心孔407的結(jié)合元件406上。特別是，沒有固相結(jié)合過程發(fā)生在裂解孔408中。
[0338]在實(shí)施方案中，控制單元可以是能夠控制裝置的一種或多種其它部件的功能，并且能夠具體協(xié)調(diào)每個(gè)部件的功能的電子部件。在控制單元中，編碼或算法可以被儲(chǔ)存或被用戶定義在軟件，硬件，或混合形式(即包括軟件和硬件部件)中，使得能夠進(jìn)行特定的分析，實(shí)驗(yàn)或測(cè)定。具體來說，這樣的控制單元可以包含具有處理能力(任選地還具有儲(chǔ)存能力)并被構(gòu)造為以執(zhí)行特定的實(shí)驗(yàn)方案的處理器。具體來說，這樣的控制單元可以是微處理器或CPU (中央處理器)。
[0339]中心孔407中流體的溫度可以被溫度操縱單元操縱，溫度操縱單元含有氣動(dòng)冷卻器453，溫度傳感器(未顯示)，以及布置在基體402的上表面附近的加熱板451和具有中央凹陷459的第二環(huán)形加熱板451以允許中心孔407中的分子的光學(xué)檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，加熱板包含了用于調(diào)整加熱板和/或第二孔的溫度的溫度傳感器?？刂茊卧?71可以控制板451的溫度分布，從而操作中心結(jié)構(gòu)407中液體的溫度(例如在分析過程中按照溫度順序執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)，以擴(kuò)增 靶分子)。具體來說，溫度操縱單元451具有將位于中心孔407中的液體的溫度升高到高達(dá)95°C的能力。
[0340]在基體402和覆蓋元件404之間，提供了流體界面418，以允許通過通道410和洞413將液體例如水或緩沖液或氣體例如空氣插入到微流體系統(tǒng)中。還可以提供另一個(gè)界面482，允許將樣品481插入到微流體系統(tǒng)中。
[0341]在某些實(shí)施方案中，基體402至少部分是透光的，從而允許對(duì)中心孔407中的成分進(jìn)行基于光輻照的檢測(cè)，這將在下面解釋。
[0342]含有光源(未顯示)例如激光二極管的檢測(cè)系統(tǒng)455適于產(chǎn)生電磁輻射光束，通過第二加熱元件451中的凹陷459入射中心室407。在該室407中存在熒光標(biāo)記的情況下，產(chǎn)生了次級(jí)電磁光束，可以通過第二加熱元件451中的凹陷459傳播，并可以被檢測(cè)系統(tǒng)455中的檢測(cè)器(未顯示)例如發(fā)光二極管檢測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)455的表明靶分子的濃度的檢測(cè)信號(hào)可以通過控制單元界面456提供給控制單元471，用于進(jìn)一步處理。因此，正如可以從圖17中看到的，控制單元471也協(xié)調(diào)檢測(cè)系統(tǒng)455的功能。
[0343]在某些實(shí)施方案中，在檢測(cè)過程中，檢測(cè)致動(dòng)器457壓縮中心孔，以減小撓性的覆蓋元件403與404之間或撓性的覆蓋元件403和404與基體402之間的距離，從而從檢測(cè)區(qū)中排出含有沒有結(jié)合到結(jié)合元件406或417之一上的物質(zhì)的液體。
[0344]提供了液體供給461，以將液體例如水或緩沖液泵過由孔408和407，貫穿孔413，414，415，416和通道410，411和412形成的微流體網(wǎng)路。
[0345]液體通過裝置400的運(yùn)輸也可以通過用負(fù)壓(未顯示)吸吮液體來進(jìn)行?？梢蕴峁┕鈱W(xué)傳感器464，用于按照下面的解釋控制室408中的液位。如果孔408用來自液體供給461的液體進(jìn)行填充，控制單元471通過界面446發(fā)送相應(yīng)的信號(hào)到閥單元435。閥單元通過氣動(dòng)接頭463打開閥，將壓力施加在液體供給461上，從而將液體從液體供給461通過液體接頭462，通道410和洞413壓入孔408。
[0346]當(dāng)光學(xué)傳感器464檢測(cè)到表明孔408中液體的存在的信號(hào)時(shí)，傳感器發(fā)送信號(hào)通過界面465到達(dá)控制單元471。然后控制單元471發(fā)送信號(hào)到閥單元435。閥單元關(guān)閉閥，從而停止了液體供給461上的壓力，進(jìn)而停止了孔408外部的液體的移動(dòng)。
[0347]也可以提供其它的光學(xué)傳感器，以控制其它結(jié)構(gòu)例如通道(410，411和412，傳感器未顯示)或孔(407，傳感器未顯示)中的液位。
[0348]在各種不同的實(shí)施方案中，樣品481可以包含任何固體，液體或氣態(tài)物質(zhì)或其組合。例如，物質(zhì)可以是液體或懸浮液，更具體來說是生物學(xué)物質(zhì)(例如血液，特別是全血)。這樣的物質(zhì)可以包括蛋白，多肽，核酸，脂類，碳水化合物，病毒，細(xì)菌等。在實(shí)施方案中，樣品是可能含有靶的物質(zhì)的組合物。
[0349]正如可以從圖17看出的那樣，控制單元471還通過界面447控制泵431?？梢蕴峁嚎s空氣儲(chǔ)存器433，以將泵抽過程與氣動(dòng)冷卻器453的致動(dòng)器437-440的性能和檢測(cè)致動(dòng)器457相協(xié)調(diào)。
[0350]系統(tǒng)400還包含用戶界面單元472，它也可以被稱為輸入/輸出裝置。通過用戶界面單元472，用戶可以定義系統(tǒng)400所運(yùn)行的實(shí)驗(yàn)。換句話說，用戶界面472可以使用戶對(duì)系統(tǒng)400進(jìn)行編程，以便執(zhí)行具體的分析。這樣的用戶界面472可以包含具有顯示單元例如LCD，等離子體裝置或陰極射線管的圖形用戶界面(GUI)。此外，在用戶界面472上可以提供輸入元件，例如鍵盤，操縱桿，按鈕，軌跡球或甚至聲音識(shí)別系統(tǒng)的麥克風(fēng)。用戶界面472與控制單元通過數(shù)據(jù)連線連接。
`[0351]參考圖17c和d，在某些`實(shí)施方案中，閥單元435含有多個(gè)(η)單閥(2)。每個(gè)閥由含有通道(2.3)的轉(zhuǎn)子(2.1)和定子(2.2)構(gòu)成，二者用4條彈簧連續(xù)安裝和固定，以施加恒定的壓力。每個(gè)閥有4個(gè)洞(a，b，c，d)，a與通氣設(shè)備相連，b與壓縮機(jī)相連，c與氣動(dòng)致動(dòng)器相連，d與致動(dòng)器的通氣位點(diǎn)相連。
[0352]載體(3)與放置在管內(nèi)部的球形螺釘相連。管(6)中的導(dǎo)槽使得載體可以移動(dòng)。驅(qū)動(dòng)軸(5)的旋轉(zhuǎn)移動(dòng)將導(dǎo)致球形螺釘和相連的載體在X軸方向運(yùn)動(dòng)。這使得載體能夠運(yùn)動(dòng)到每個(gè)閥(2)的位置。載體將鎖在轉(zhuǎn)子(2.1)中。
[0353]管(6)的90°的運(yùn)動(dòng)將導(dǎo)致載體(3)和轉(zhuǎn)子(2.1)的90°的運(yùn)動(dòng)。轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)子盤中的袋將打開或關(guān)閉閥接頭(a, b和c, d ；d, a和b, C)。
[0354]下面，參考圖18和圖19，將對(duì)按照另一個(gè)示例性實(shí)施方案的裝置500進(jìn)行解釋。圖18顯示了裝置500的前視圖，圖19顯示了后視圖。裝置500含有在基體402中形成的溝槽501，用于插入套管(未顯示)，通過它可以將樣品供應(yīng)到裝置500中。提供了裂解室502，其中裂解所需的物質(zhì)可以以干燥的形式儲(chǔ)存。中心孔512用于執(zhí)行操作裝置500所需的所有固相結(jié)合過程。提供了其它的孔504，506，508和510，在其中提供了干燥形式的各種其它物質(zhì)，可用于清洗步驟，PCR步驟等。提供了廢物室514作為孔，分析所不再需要的液體可以被運(yùn)輸?shù)狡渲小?br> [0355]盡管在圖18和圖19中沒有顯示，但在廢物室514中可以提供液體吸附性物質(zhì)，可以吸收進(jìn)入廢物室514的流體。通過采取這種措施，可以確保防止不需要的液體從廢物室514回流到裝置500的其它部分中，從而避免任何污染。例如，可膨脹的聚合物(也可以用于尿布中)可用于這樣的目的。
[0356]正如可以從圖18具體看到的，提供了多個(gè)流體連接端口 520，524，521，525，540，542，544，545，548，578，580，558，562，564，560，561，552，550，516，554，530，528，532 和526，用于連接不同的通道，它們將在下面解釋。
[0357]正如可以從圖19看到的，顯示了其它的流體連接端口 541，560，566，519，512。此外，預(yù)見到多個(gè)通道 538，522，518，527，529，536，572，574，576，539，562，570，546，556，568和 534，連接各個(gè)流體連接端口 520，524，521，525，540，542，544，545，548，578，580，558，562，564，560，561，552，550，516，554，530，528，532，526，541，560，566，519 和孔 502，504，506，508，510和512。此外，顯示了流體入口 593，通過它可以將流體例如水注射到裝置500中。通過流體出口 594，可以從裝置500中排出流體(例如排出空氣以降低壓力)。還顯示了流體入/出口 597。
[0358]顯示了可以被遮光板擋住的第一窗口部分598和可以被遮光板擋住的第二窗口部分599，當(dāng)裝置500中的流體柱的彎月液面通過與遮光板相關(guān)的透明窗口部分598，599時(shí)，可以用于進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。當(dāng)一個(gè)遮光板檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于窗口部分598，599的室之一充滿了液體或溢流后，這可以被光學(xué)檢測(cè)到，并可以用于產(chǎn)生控制控制單元(在圖18和圖19中沒有顯示)的控制信號(hào)，以相應(yīng)地控制裝置500的操作。
[0359]當(dāng)插管的第一部分被插入到溝槽501中時(shí)，插管的第二部分可以插入到患者中，以從患者獲取血樣，并將全血樣品直接注射到裝置500中。
[0360]盡管沒有顯示在圖18和 圖19中，但任何一個(gè)流體連接端口 520，524，521，525，540，542，544，545，548，578 ，580，558，562，564，560，561，552，550，516，554，530，528，532，526，541，560，566，519可以被能夠被致動(dòng)器銷針(在圖18和圖19中沒有顯示)壓縮的撓性元件覆蓋，使得銷針可用于選擇性打開或關(guān)閉任何單獨(dú)的一個(gè)流體連接端口 520，524，521，525，540，542，544，545，548，578，580，558，562，564，560，561，552，550，516，554，530，528，532，526，541，560，566，519，從而實(shí)現(xiàn)閥的功能。
[0361]盡管沒有顯示在圖18和圖19中，孔502，504，506，508，510和512中任何一個(gè)可以被能夠被致動(dòng)器銷針(在圖18和圖19中沒有顯示)壓縮的撓性元件覆蓋，使得銷針可用于選擇性地壓在孔502，504，506，508，510和512上，從而用作混合器或泵。
[0362]正如可以從圖18看到的那樣，形成中心孔512的部件587是模壓的塑料元件，可以被插入到基體402的溝槽585，583中。該塑料元件587可以從兩側(cè)形成圖案或構(gòu)成，以便可以形成部件590，591，578，548，580，558等。
[0363]下面，將對(duì)在裝置500中，特別是基于中心孔512進(jìn)行的分析進(jìn)行解釋，這種分析可以允許以快速的方式，例如在I小時(shí)之內(nèi)，執(zhí)行HIV載量的測(cè)定。
[0364]珠子可以提供在中心室512中。這些珠子可以構(gòu)造為從以前裂解的樣品捕獲靶分子(例如HIV RNA)。例如，珠子可以被構(gòu)造為與捕獲分子的錨定基團(tuán)結(jié)合，以結(jié)合含有靶多核苷酸和捕獲分子的復(fù)合物，其中捕獲分子含有特異性針對(duì)靶多核苷酸的區(qū)域的結(jié)合部分和錨定基團(tuán)。
[0365]附圖標(biāo)記541表示與壓縮空氣的連接(參見圖19中的箭頭)，以便壓縮空氣可以通過元件538，518，516，并進(jìn)入孔502。因此，使用壓縮空氣泵抽空孔502是可能的。在通過溝槽501提供的血樣應(yīng)該用水稀釋的情況下，該水可以通過流體入口 593提供。
[0366]在一個(gè)實(shí)施方案中，全血樣品(或其它樣品)可以被運(yùn)輸?shù)娇?02中，用于例如裂解。血液可以被吸入到裝置500中，通過首先壓縮喲室，將血液施加入到毛細(xì)管中，將毛細(xì)管與裂解室502相接觸，然后釋放裂解室502，從而將血液吸入到裝置500中。
[0367]為此，將上述的相應(yīng)的裂解試劑以干燥的形式提供在裂解孔502中。裂解孔還可以含有包含錨定基團(tuán)和特異性針對(duì)靶多核苷酸的區(qū)域的結(jié)合部分的捕獲分子。然后，將現(xiàn)在可以包含含有靶多核苷酸和捕獲分子的復(fù)合物的樣品通過部件554和556 (通過壓縮空氣)運(yùn)輸?shù)讲考?58。在這種情況下，部件552被相應(yīng)的致動(dòng)器關(guān)閉。經(jīng)過部件558，580，樣品可以被運(yùn)輸?shù)街行目?12中。為此，中心孔512的溝槽591和590可以裝備有過濾器，例如熔融玻璃過濾器(沒有顯示在圖18和圖19中)，以阻止在流體流動(dòng)力的影響下，中心孔502中的珠子從該孔502中被除去。因此，經(jīng)過溝槽591和590中的過濾器或熔融玻璃過濾器，被裂解的樣品可以通過部件576運(yùn)輸?shù)街行目?12中。
[0368]在中心孔512中，可以提供第一結(jié)合元件例如珠子或功能化表面，以便靶或含有靶多核苷酸和捕獲分子的復(fù)合物可以結(jié)合在中心室512的固相捕獲結(jié)構(gòu)上。可以進(jìn)行溫育，以便珠子與樣品材料適當(dāng)?shù)鼗旌稀0369]空氣流將液體(即被裂解的樣品的未被捕獲的成分)從中心孔512經(jīng)過部件558，560,561壓到廢物514中。因此，許多沒有被中心孔512中的珠子捕獲的樣品的成分被運(yùn)輸?shù)綇U物室514中。因此，只有靶保留在中心孔512中，而全血樣品的剩余部分現(xiàn)在在廢物514中。因此，中心孔512現(xiàn)在收容有珠子以及含有捕獲探針和靶的復(fù)合物。
[0370]然后，可以對(duì)中心孔512進(jìn)行清洗，其中以固體形式提供在清洗孔504中的清洗緩沖液的成分被用于產(chǎn)生清洗緩沖液。這樣的清洗步驟可能是有利的，因?yàn)樵诓东@步驟后，某些不純物質(zhì)仍然可能存在于室502中，特別是在使用全血樣品時(shí)，或樣品通過插入到溝槽501中的插管提供時(shí)。
[0371]清洗緩沖液可以在空氣壓力的作用下經(jīng)部件541，540，542，546，548，578，591，574，512被泵抽。
[0372]正如上面已經(jīng)指出的那樣，清洗緩沖液被制備在清洗孔504中。在清洗孔504中，用于這種清洗緩沖液的鹽可以以干燥的形式存在。為了制備清洗緩沖液，水可以從部件566經(jīng)過部件564，562，570，552 (當(dāng)部件554關(guān)閉時(shí))，527 (當(dāng)部件532，525，530關(guān)閉時(shí))運(yùn)輸，以便水被提供到部件521 (開放)。水可以被泵抽到清洗孔504中，直到與部件520相連的透明窗口被水充滿，這可以由通過部件520旁的透明窗口附近的遮光板檢測(cè)彎月液面來檢測(cè)。一旦收到相應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)，水的供應(yīng)可以被終止。
[0373]然后，致動(dòng)器(未顯示)可以上下往復(fù)地壓縮覆蓋在清洗孔504上的撓性覆蓋元件，以進(jìn)行混合，溶解提供在其中的鹽。
[0374]然后通過對(duì)各個(gè)閥進(jìn)行相應(yīng)的控制并通過提供壓縮空氣，清空充滿水的通道，使得水可以被泵抽到廢物室514中。
[0375]然后可以將在清洗孔504中制備的清洗緩沖液壓入中心孔512，使得可以在中心孔512中進(jìn)行清洗程序。在清洗之后，可以將清洗溶液泵入到廢物室514中。
[0376]接下來,可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將祀RNA轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的DNA。這樣的步驟在檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV的情況下是特別需要的，在其它情況下，例如當(dāng)檢測(cè)DNA病毒時(shí)，則不是必須的。為了執(zhí)行這樣的反轉(zhuǎn)錄，可以將反轉(zhuǎn)錄所需的成分例如引物，酶和緩沖液從反轉(zhuǎn)錄孔508泵抽到中心孔512中。
[0377]任選的，反轉(zhuǎn)錄孔508中的成分還可以含有另一套其它的捕獲分子，可以具有捕獲在反轉(zhuǎn)錄過程中在中心孔512中產(chǎn)生的DNA分子的特異性能力。
[0378]因?yàn)樵诜崔D(zhuǎn)錄后，靶DNA沒有保留在室512的珠子上，因此將溶液運(yùn)輸?shù)綇U物容器514中將減小樣品的量。為此，現(xiàn)在將樣品從中心孔512泵到PCR孔510中，在該樣品中可以溶解PCR鹽，其中PCR孔510中的PCR緩沖液可以含有聚合酶，能夠與靶多核苷酸形成復(fù)合物的報(bào)告分子，引物和/或緩沖液。或者，反轉(zhuǎn)錄緩沖液含有針對(duì)合成的DNA鏈的捕獲分子，這些鏈的捕獲以與最初捕獲HIV核酸相同的方式進(jìn)行。然后，可以將樣品泵回到中心孔512 中。
[0379]但是，真正的PCR擴(kuò)增然后在中心孔512中進(jìn)行。為此，通過執(zhí)行溫度循環(huán)在中心孔512中進(jìn)行PCR，也就是說，重復(fù)例如40次95°C 5秒和60°C 10秒的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫度循環(huán)包含3種或以上不同的溫度，例如可以進(jìn)行包括30個(gè)循環(huán)的95°C 20秒，55°C 30秒和72°C 30秒。但是，其它的PCR循環(huán)方案也可以在中心孔中進(jìn)行。
[0380]在某些實(shí)施方案中，為了調(diào)節(jié)中心孔512中的溫度，可以在中心孔512的上方和下方提供兩個(gè)加熱板。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)加熱孔中的一個(gè)可以是連續(xù)的，另一個(gè)可以具有凹陷，以允許隨后進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，如上所述，檢測(cè)可以在擴(kuò)增過程中發(fā)生。
[0381]例如，在第一實(shí)施方案中，可以在中心孔512中進(jìn)行捕獲分子的競(jìng)爭(zhēng)性分析。因此，在該實(shí)施方案中，第一結(jié)合元件例如珠子被用于捕獲含有靶核酸和捕獲分子的復(fù)合物，第二結(jié)合元件含有固定在中心孔512中的報(bào)告化合物特異性捕獲分子的陣列，被用于檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)性分析包括將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物的形成抑制了報(bào)告化合物被固定在中心孔512中的報(bào)告化合物特異性捕獲分子的陣列捕獲。固定在中心孔512中的報(bào)告化合物特異性捕獲分子能夠捕獲至少剩余部分量的沒有與靶多核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物。通過在孔512中提供不同類型的報(bào)告化合物特異性捕獲分子的陣列用于檢測(cè)，辨別不同類型的HIV病毒，例如I型HIV和2型HIV，是可能的，甚至辨別HIV病毒的不同亞型也是可能的。
[0382]在第二個(gè)實(shí)施方案中，使用與已經(jīng)用于捕獲步驟并用于檢測(cè)的結(jié)合元件相同的結(jié)合元件，例如珠子，也是可能的。在該實(shí)施方案中，通過錨定基團(tuán)連接到珠子上的捕獲寡核苷酸可以與被擴(kuò)增的靶DNA的復(fù)合物雜交，該擴(kuò)增的靶DNA本身可以含有熒光標(biāo)記物。
[0383]被捕獲的報(bào)告化合物或被捕獲的靶分子可以通過光學(xué)檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)，例如使用如上所述的熒光標(biāo)記物。具體來說，可以操作具有光源(未顯示)和光檢測(cè)器(未顯示)的光學(xué)系統(tǒng)，以便測(cè)量PCR過程中信號(hào)的時(shí)間依賴性，這使得可以推導(dǎo)出HIV的病毒載量。換句話說，可以獲得并評(píng)估熒光信號(hào)的時(shí)間依賴性。
[0384]下面，參考圖20，將對(duì)按照示例性實(shí)施方案的裝置600進(jìn)行解釋。
[0385]圖20的實(shí)施方案類似于圖18，19的實(shí)施方案，因此相應(yīng)的部件用同樣的附圖標(biāo)記來表示。為了簡(jiǎn)單明了起見，在圖20中，通道和流體端口沒有用附圖標(biāo)記來表示。對(duì)于相應(yīng)的解釋，參考圖18和圖19。[0386]圖20顯示了與孔504相關(guān)的窗口部分602和與孔506有關(guān)的窗口部分694，它們能夠用于彎月液面檢測(cè)，因此能夠用于溢流檢測(cè)，并以此作為基礎(chǔ)確定作用在孔504，506上和作用在各種不同流體連接端口上的控制致動(dòng)器的控制信號(hào)。
[0387]標(biāo)出了重力矢量彥的方向，以顯示在某些實(shí)施方案中裝置600可以被操作的位置。在這些實(shí)施方案中，裝置600的操作是基于重力和通過壓縮空氣接頭606和供水接頭608提供的液體運(yùn)輸力的組合。此外，提供了通氣接頭610和通氣接頭612，以對(duì)相應(yīng)的流體結(jié)構(gòu)進(jìn)行通氣。
[0388]圖20示意性顯示了部分613，它可以作為圖20的整體解決方案的可選方案，提供為單獨(dú)的模塊，可以與其它模塊組合起來，形成用戶定義的裝置，在該裝置中各種不同模塊被裝配在一起。
[0389]下面，殘開圖21，將對(duì)按照另一個(gè)示例性實(shí)施方案的裝置700進(jìn)行解釋。
[0390]裝置700含有剛性基體704，其中形成了第一貫通洞709和第二貫通洞707。在基體704的第一主表面上形成了第一孔720和第二孔708。在基體704的相反的主表面上，形成了通道706。通道706與孔720和708分別通過洞709和707流體連通。
[0391]在剛性基體704的上表面上，形成了第一撓性覆蓋元件708，并附著在剛性基體704上。在基體704的下表面上形成了第二覆蓋元件，并層壓在剛性基體704上。
[0392]正如可以從圖21進(jìn)一步看出的那樣，提供了第一致動(dòng)器元件701和第二致動(dòng)器元件702，第一致動(dòng)器元件701適于壓在覆蓋元件720的第一部分上，以選擇性關(guān)閉貫穿洞通道709或整個(gè)孔720。通過相應(yīng)的方式，第二致動(dòng)器元件702可以選擇性打開或關(guān)閉孔708和/或貫穿洞707。因此，可以控制流體流過通道706進(jìn)入一個(gè)或兩個(gè)孔720或708。
[0393]圖22顯示了本發(fā)明的示例性競(jìng)爭(zhēng)性分析的示意圖。標(biāo)記的核酸報(bào)告分子(顯示為灰色曲線)通過核酸捕獲分子(顯示為黑色曲線)連接到結(jié)合元件(這里舉例為珠子)上。被檢測(cè)的靶核酸以雙鏈形式(兩條鏈被顯示為淺灰色/黑色曲線)存在于樣品中。對(duì)樣品進(jìn)行(循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的)變性步驟，允許靶核酸的鏈解離，報(bào)告分子從結(jié)合元件上釋放。在隨后的退火步驟中，允許一部分量的報(bào)告分子與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物，其中由于捕獲分子和核酸靶競(jìng)爭(zhēng)與報(bào)告分子的結(jié)合，靶核酸/報(bào)告分子復(fù)合物的形成抑制了報(bào)告分子被捕獲在結(jié)合元件上的能力。允許沒有與靶核酸復(fù)合的剩余部分量的報(bào)告化合物重新捕獲在結(jié)合元件上。在這個(gè)階段，表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，以及在其基礎(chǔ)上的表明靶核酸的存在和/或量的值，通過檢測(cè)報(bào)告分子中包含的標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)而被測(cè)定。在退火步驟之后或同時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的延伸步驟。然后，可以對(duì)樣品進(jìn)行另一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
[0394]圖23顯示了使用本發(fā)明的示例性競(jìng)爭(zhēng)性分析測(cè)定樣品中人類脊髓灰質(zhì)炎病毒IDNA (稱為“EV”，是指“腸道病毒DNA”)的量的結(jié)果與使用同樣的靶進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)Taq-man分析的比較。對(duì)各含有IO4個(gè)DNA拷貝的兩個(gè)樣品進(jìn)行了平行的分析:第一樣品(圖表中的標(biāo)記“探針”)被進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Rotor-Gene 6000實(shí)時(shí)旋轉(zhuǎn)PCR分析儀(Corbett LifeSciences, Sydney, Australia)按照制造商的說明書進(jìn)行。使用的PCR引物導(dǎo)致擴(kuò)增了150 bp的DNA片段。片段的檢測(cè)使用了所謂的Taqman?探針來完成，它分別在其5’末端含有6-羰基-熒光素(FAM)標(biāo)記，在其3’末端含有6-羰基四甲基羅丹明-琥珀酰亞胺酯(TAMRA)標(biāo)記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)?？偣策M(jìn)行了 50 個(gè) PCR 循環(huán)。第二樣品(“競(jìng)爭(zhēng)性分析”)還包含了與Taqman?探針具有相同的核苷酸序列，但是在其3’末端含有 CY3 擬花青標(biāo)記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)代替了 FAM/TAMRA標(biāo)記的報(bào)告分子，并使用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的裝置進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中檢測(cè)到的獲得的熒光信號(hào)顯示在圖中。
[0395]圖24圖示了原理并顯示了本發(fā)明的用于在樣品中測(cè)量HIV gag/env PCR產(chǎn)物的量的示例性的基于陣列的競(jìng)爭(zhēng)性分析的結(jié)果。圖24A圖示了分析的原理(也參見圖22)。開始時(shí)，沒有擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物即靶核酸存在。熒光標(biāo)記的核酸報(bào)告分子被結(jié)合到捕獲在陣列的基體上的報(bào)告化合物特異性探針上。如果沒有PCR產(chǎn)物產(chǎn)生，在每一輪擴(kuò)增反應(yīng)后，與報(bào)告化合物特異性探針雜交的報(bào)告分子的量保持恒定，因此測(cè)定到的熒光信號(hào)也保持恒定。如果PCR產(chǎn)物被合成，在每一個(gè)PCR循環(huán)后，與報(bào)告化合物特異性探針雜交的報(bào)告分子的量減少了，因此測(cè)定到的熒光信號(hào)也降低了。圖24B顯示了用于測(cè)定151 bp的HIVl gag/envPCR產(chǎn)物的量的基于陣列的競(jìng)爭(zhēng)性分析的結(jié)果。將不同量的片段(相對(duì)于IO4-1O6個(gè)拷貝)以及在其 5’末端含有 CY3 羰花青標(biāo)記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)的報(bào)告分子(“anti_cds029_5’ CY3”)一起進(jìn)行了 36個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。兩種不同類型的探針分子，一種是非特異性的(“ara_54986_NH2”)，一種是報(bào)告化合物特異性的(“cdso29_NH2”)，以圖25A中顯示的布置被捕獲在陣列基體上，并布置在使用的分析裝置的反應(yīng)室中。使用Iconoclust 軟件(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany)測(cè)定了 CT 值(“閾值”，即對(duì)指數(shù)擴(kuò)增階段的開始的度量，其中熒光以及因此DNA的量以線性方式增加)，并與針對(duì)用于產(chǎn)生校正曲線的相應(yīng)DNA濃度進(jìn)行作圖(圖24C)。在所有使用了受體特異性探針的樣品中，隨著PCR循環(huán)數(shù)量的增加，觀察到了熒光強(qiáng)度的逐漸的降低。相反，在使用非特異探針的樣品中，沒有觀察到熒光(圖24B)。
[0396]圖25描繪了 PCR擴(kuò)增的不同階段時(shí)在圖24中顯示的分析中使用的陣列。陣列基體上不同點(diǎn)的布置圖示在圖25A中。黑色圓圈表示使用了特異性探針(參見圖24)來捕獲報(bào)告分子的點(diǎn)(四個(gè)平行樣品)， 而白色圓圈表示使用了非特異性探針來捕獲報(bào)告分子的點(diǎn)(四個(gè)平行樣品)?；疑珗A圈代表陽 性對(duì)照，其中熒光標(biāo)記被點(diǎn)樣在陣列基體上。圖25B分別顯示了在擴(kuò)增循環(huán)1，12，18和21后獲取的陣列(對(duì)應(yīng)于圖24B中的IO5個(gè)DNA拷貝-樣品)的照片。在通過特異性探針分子捕獲在陣列上的樣品中，在PCR擴(kuò)增過程中可以觀察到突光信號(hào)強(qiáng)度的降低。
[0397]圖26A-D表示了本發(fā)明用于檢測(cè)多核苷酸的競(jìng)爭(zhēng)性方法的示例性實(shí)施方案的圖解說明。如圖26A所示，開始時(shí)沒有擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物即靶核酸存在。標(biāo)記的核酸報(bào)告分子(顯示為黑色曲線，并被稱為靶/探針特異性報(bào)告分子)被結(jié)合到捕獲在陣列的基體上的報(bào)告化合物特異性探針上。信號(hào)對(duì)應(yīng)于標(biāo)記的內(nèi)部對(duì)照分子(顯示為淺灰色曲線)，它被結(jié)合到捕獲在陣列的基體上的內(nèi)部對(duì)照特異性探針上。如圖26B所示，如果PCR進(jìn)入指數(shù)期早期，報(bào)告分子不僅與捕獲在基體上的報(bào)告分子特異性探針結(jié)合，而且與PCR產(chǎn)物的報(bào)告分子特異性區(qū)域結(jié)合。因此，如果PCR產(chǎn)物被合成，與捕獲在基體上的報(bào)告分子特異性探針雜交的報(bào)告分子的量將減少，因此測(cè)定到的信號(hào)將降低。當(dāng)PCR在指數(shù)期時(shí)信號(hào)明顯降低(參見圖26C)。當(dāng)PCR達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，捕獲在基體上的報(bào)告分子特異性探針的信號(hào)保持低水平(參見圖26D)。
[0398]圖27顯示了本發(fā)明的用于測(cè)定樣品中HIV亞型B和HIV亞型02的量的競(jìng)爭(zhēng)性分析的示例性實(shí)施方案的結(jié)果。在圖27A的實(shí)驗(yàn)中，樣品中只存在HIV亞型B?？梢钥吹?，對(duì)應(yīng)于特異性針對(duì)HIV亞型O2 (HIV sub O2)的標(biāo)記的核酸報(bào)告分子的信號(hào)保持恒定，而對(duì)應(yīng)于特異性針對(duì)HIV亞型B (HIV sub B)的標(biāo)記的核酸報(bào)告分子的信號(hào)在經(jīng)過大約13個(gè)PCR循環(huán)后顯著降低了(參見圖26)。在圖27B的實(shí)驗(yàn)中，樣品中只存在HIV亞型02。可以看到，對(duì)應(yīng)于特異性針對(duì)HIV亞型B (HIV sub B)的標(biāo)記的核酸報(bào)告分子的信號(hào)保持恒定，而對(duì)應(yīng)于特異性針對(duì)HIV亞型O2 (HIV sub O2)的標(biāo)記的核酸報(bào)告分子的信號(hào)在經(jīng)過大約25個(gè)PCR循環(huán)后顯著降低了(參見圖26)。
[0399]圖28顯示了本發(fā)明的用于測(cè)定樣品中HIV亞型B的不同量的競(jìng)爭(zhēng)性分析的示例性實(shí)施方案的結(jié)果。如果樣品中存在IO6個(gè)拷貝的HIV，對(duì)應(yīng)于特異性針對(duì)HIV亞型B(HIVsub B)的標(biāo)記的核酸報(bào)告分子的信號(hào)在經(jīng)過大約13個(gè)PCR循環(huán)后顯著降低(參見圖28A)。如果樣品中只存在IO4個(gè)HIV拷貝，對(duì)應(yīng)于特異性針對(duì)HIV亞型B (HIV sub B)的標(biāo)記的核酸報(bào)告分子的信號(hào)在經(jīng)過大約19個(gè)PCR循環(huán)后顯著降低(參見圖28B)。從圖28可以明顯看出，在信號(hào)降低前所需的PCR循環(huán)的數(shù)量是可檢測(cè)的，這允許對(duì)被分析的樣品中存在的革巴核酸的量作出結(jié)論。
[0400]下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的描述，它們的目的僅僅是圖示本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實(shí)施例
[0401]實(shí)施例1:用于測(cè)定人類脊髓灰質(zhì)炎病毒I DNA的競(jìng)爭(zhēng)性分析
所進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性分析的原理示意顯示在圖22中。將人類脊髓灰質(zhì)炎病毒I分離株TCDC01-861 的 DNA (GenBank 登記號(hào) AF538843)克隆在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體(pCR?2.1-T0P0?,Clontech, Inc.Palo Alto, CA, USA)中，用作DNA模板(在本文中也稱為“EV”(腸道病毒)DNA )。
[0402]對(duì)兩個(gè)各含有IO4個(gè)DNA拷貝的樣品進(jìn)行了平行的分析:第一樣品使用Rotor-Gene 6000 實(shí)時(shí)旋轉(zhuǎn) PCR 分析儀(Corbett Life Sciences, Sydney, Australia)按照制造商的說明書進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增。
[0403]第二樣品還包含了與Taqman?探針具有相同的核苷酸序列，但是在其3’末端含有CY3 擬花青標(biāo)記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)代替了 FAM/TAMRA 標(biāo)記的報(bào)告分子，并使用分析裝置在反應(yīng)室中直接進(jìn)行擴(kuò)增，其中陣列被放置在可加熱的基部表面上。
[0404]使用了下面的PCR引物:
正向PCR引物:
pr_for_EV_02:5’ -CAAACCAGTGATTGGCCTGTCGTAACG-3’
(對(duì)應(yīng)于AF538843的492-518位核苷酸)
反向PCR引物:
pr_rev_EV_01:5’-TTCACCGGATGGCCAATCCAATTCG-3’
(對(duì)應(yīng)于AF538843的617-641位核苷酸)
因此，PCR導(dǎo)致了 150bp的DNA片段的擴(kuò)增。按照制造商的說明書，PCR樣品含有200nM (終濃度)的每種 PCR 引物，以及 EnzymMix? 和 Ultrasense RT-PCR 試劑盒(InvitrogenCorporation, Carlsbad, CA, USA)的反應(yīng)緩沖液。
[0405]此外，為了檢測(cè)擴(kuò)增的PCR片段，使用Rotor-Gene 6000實(shí)時(shí)旋轉(zhuǎn)PCR分析儀，相應(yīng)的PCR樣品含有100 nM (終濃度)的雙重標(biāo)記的所謂Taqman?探針，它分別在其5’末端含有6-羰基-熒光素(FAM)標(biāo)記(即熒光團(tuán))，在其3’末端含有6-羰基四甲基羅丹明-琥珀酰亞胺酯(TAMRA)標(biāo)記(即淬滅劑)(兩種標(biāo)記都是從Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA, USA購(gòu)買的)。探針具有下面的序列:
HP_EV2_001: FAM-5’-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3’-
TAMRA
(對(duì)應(yīng)于AF538843的536-561位核苷酸)
為了進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性分析，PCR樣品還含有20 nM (終濃度)的報(bào)告分子，它與Taqman?探針具有相同的核苷酸序列，但是具有不同的標(biāo)記，具體為在其3’末端含有CY3羰花青標(biāo)記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA):
EV2_02CY3: 5’-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3’-CY3
(對(duì)應(yīng)于AF538843的536-561位核苷酸) 按照下面的溫度模式進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR:94°C 2分鐘，然后進(jìn)行50個(gè)循環(huán)的94°C 5秒，62° C 30 秒和 72° C 30 秒。
[0406]在PCR過程中兩個(gè)反應(yīng)的熒光信號(hào)都顯示在圖23中。
[0407]實(shí)施例2:用于測(cè)定HIVl RaR/env DNA的基于陣列的競(jìng)爭(zhēng)性分析
進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性分析的原理示意顯示在圖24A中。將合成的HIVl gag/env融合構(gòu)建物的DNA (EMBL 登記號(hào) A06258)克隆到表達(dá)載體 pCR?2.1-T0P0? (Clontech, Inc.Palo Alto,CA, USA)的EcoRI內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)中，用作DNA模板。
[0408]此外，使用了下面的PCR引物:
正向PCR引物:
cdia: 5’-TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3’
(對(duì)應(yīng)于A06258的214-232位核苷酸)
反向PCR引物:
cdis: 5’-ATCAAGCAGCCATGCAAATGTT-3’
(對(duì)應(yīng)于A06258的384-405位核苷酸)
因此，PCR導(dǎo)致了 151 bp的DNA片段的擴(kuò)增，它具有下面的序列:5’-ATC AAG CAG CCATGC MA TGT TAA MG AGA CCA TCA ATG AGG MG CTG CAG MT GGG ATA GAT TGC ATC CAGTCC ATG GAG GGC CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG MC CAA GGG GM GTG ACA TAG CAGGAA CTA CTA GTA CCC TTC A-3’ 。
[0409]PCR在分析裝置的反應(yīng)室中直接進(jìn)行，其中陣列被放置在可加熱的基部表面上。PCR樣品含有200 nM (終濃度)每種PCR引物，以及EnzymMix?和Ultrasense RT-PCR試劑盒(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)的反應(yīng)緩沖液。為了產(chǎn)生校正曲線，使用了對(duì)應(yīng)于0，104，105，和IO6個(gè)DNA拷貝的不同量的DNA模板(在I μ中)(每種濃度進(jìn)行四份實(shí)驗(yàn))。
[0410]為了進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性分析，PCR樣品還含有10 nM (終濃度)的報(bào)告分子，它在其5’末端具有 CY3 擬花青標(biāo)記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA):anti_cdso29_5’ CY3:
CY3-5’-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT-3’
(與下面描述的cdso29_NH2探針分子互補(bǔ))
按照下面的溫度模式進(jìn)行了 PCR:95°C 30秒，然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)的95°C 5秒，50°C30秒和72° C 30秒。
[0411]在每個(gè)循環(huán)中，在退火步驟結(jié)束時(shí)，使用位于分析裝置的頂表面對(duì)面的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)和 Iconoclust 軟件包(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany),測(cè)定了報(bào)告分子與兩種類型的探針的相互作用。在數(shù)據(jù)獲取過程中曝光時(shí)間是2.5秒。
[0412]兩種不同類型的探針分子以圖25A中顯示的布置方式被捕獲在陣列基體上。單獨(dú)的熒光標(biāo)記物被用作陽性對(duì)照。使用了下面的探針:
非特異性探針:
ara_54986_NH2: 5’-ACCAGCTTTGAACCCAACAC-3’
受體特異性探針:
cdso29_NH2: 5’-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGA-3，
使用 Iconoclust 軟件(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany)確定了CT值(“閾值”)，作為指數(shù)擴(kuò)增期開始的度量，在指數(shù)擴(kuò)增期中熒光以及因此DNA的量以線性方式增加，并與針對(duì)使用的相應(yīng)的DNA濃度進(jìn)行作圖，產(chǎn)生了校正曲線(圖24C)。測(cè)定到的平均CT值如下:在IO4個(gè)DNA拷貝的樣品中是22.0 ;在IO5個(gè)DNA拷貝的樣品中是18.5 ;在IO6個(gè)DNA拷貝的樣品中是15.0。
[0413]在所有使用了受體特異性探針的樣品中，隨著PCR循環(huán)數(shù)量的增加，觀察到了熒光強(qiáng)度的逐漸的降低。相反，在使用非特異探針的樣品中，沒有觀察到熒光(圖24B)。
[0414]陣列基體上不同點(diǎn)的布置示意圖示在圖25A中。黑色圓圈表示使用了特異性探針(參見圖24)來捕獲報(bào)告分子的點(diǎn)(四個(gè)平行樣品)，而白色圓圈表示使用了非特異性探針來捕獲報(bào)告分子的點(diǎn)(四個(gè)平行樣品)。灰色圓圈代表陽性對(duì)照，其中熒光標(biāo)記被點(diǎn)樣在陣列基體上。
[0415]圖25B分別顯示了在擴(kuò)增循環(huán)1，12，18和21后獲取的陣列(對(duì)應(yīng)于圖24B中的IO5個(gè)DNA拷貝的樣品)的照片。在通過特異性探針分子捕獲在陣列上的樣品中，在PCR擴(kuò)增過程中可以觀察到熒光信號(hào)強(qiáng)度的逐漸降低，這反過來對(duì)應(yīng)于被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的量的相伴的增加，可以通過與相應(yīng)的校正曲線進(jìn)行比較來定量。
[0416]應(yīng)該注意的是，術(shù)語“包含”不排除其它的要素或特征，并且單數(shù)的表達(dá)方式不排除復(fù)數(shù)形式。與不同的實(shí)施方案相關(guān)聯(lián)描述的要素也可以組合起來。
[0417]還應(yīng)該注意，權(quán)利要求書中的附圖標(biāo)記不講被解釋為對(duì)權(quán)利要求的范圍的限制。
【權(quán)利要求】
1.方法，包括: 形成含有下列成分的組合物: -一定量的報(bào)告化合物， -能夠捕獲報(bào)告化合物的結(jié)合元件，以及 -一定量的能夠與報(bào)告化合物形成復(fù)合物的靶核酸，與報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制報(bào)告化合物被結(jié)合元件捕獲； 將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物； 將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上；以及 測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括在表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的基礎(chǔ)上測(cè)定表明靶核酸的存在和/或量的值。
3.權(quán)利要求1或2的方法，還包括在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物，將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上，以及測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的步驟之后，從結(jié)合元件上釋放剩余部分量的報(bào)告化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，還包括進(jìn)行釋放，形成復(fù)合物，捕獲以及測(cè)定的步驟額外的N次，其中N是大于或等于I的整數(shù)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中N≥ 5。
6.權(quán)利要求4的方法，其中N≥10。
7.權(quán)利要求4的方法，其中N≥20。
8.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，還包括在形成復(fù)合物的步驟之前: 將至少一部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上； 測(cè)定表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值；以及 從結(jié)合元件上釋放被捕獲的報(bào)告化合物。
9.權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的方法，其中將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的步驟，相伴進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的方法，還包括對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。
11.權(quán)利要求10的方法，其中靶核酸的擴(kuò)增在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟之前開始。
12.權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)的方法，其中表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上達(dá)到化學(xué)平衡之前進(jìn)行測(cè)定。
13.權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的方法，其中表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，在將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在第二結(jié)合元件上的步驟開始后I秒到120秒時(shí)進(jìn)行測(cè)定。
14.權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告化合物包含一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
16.權(quán)利要求1到15任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告化合物是寡核苷酸。
17.權(quán)利要求10到16任一項(xiàng)的方法，還包括在將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增之前，對(duì)它們進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
18.權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的方法，其中形成物質(zhì)的組合物包括形成含有以下的物質(zhì)的組合物: -一定量的第一報(bào)告化合物， -一定量的能夠與第一報(bào)告化合物形成復(fù)合物的第一靶核酸，與第一報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制第一報(bào)告化合物被結(jié)合元件捕獲， -一定量的第二報(bào)告化合物，以及 -一定量的能夠與第二報(bào)告化合物形成復(fù)合物的第二靶核酸，與第二報(bào)告化合物形成復(fù)合物抑制第二報(bào)告化合物被結(jié)合元件捕獲。
19.權(quán)利要求1到18任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合元件包含一種或多種能夠?qū)?bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的不同的捕獲分子。
20.權(quán)利要求129的方法，其中捕獲分子是寡核苷酸。
21.權(quán)利要求19或2 0的方法，其中不同的捕獲分子布置在結(jié)合元件的不同位置上。
22.權(quán)利要求19到21任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告化合物通過與捕獲分子形成復(fù)合物而被捕獲在結(jié)合元件上。
23.權(quán)利要求19到22任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告化合物上的至少一部分能夠與靶核酸形成復(fù)合物的相互作用位點(diǎn)，也能夠與捕獲分子形成復(fù)合物。
24.權(quán)利要求19到23任一項(xiàng)的方法，其中捕獲分子和靶核酸競(jìng)爭(zhēng)與報(bào)告化合物形成復(fù)合物。
25.權(quán)利要求20到24任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增包括使雙鏈核酸變性的步驟。
26.權(quán)利要求25的方法，其中雙鏈核酸包括報(bào)告化合物與靶核酸的復(fù)合物，報(bào)告化合物與捕獲分子的復(fù)合物，雙鏈報(bào)告化合物以及雙鏈靶核酸。
27.權(quán)利要求20到26任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增包括將引物分子與靶核酸退火的步驟。
28.權(quán)利要求27的方法，其中退火步驟與將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分量的靶核酸形成復(fù)合物的步驟，和/或?qū)]有與靶核酸形成復(fù)合物的剩余部分量的報(bào)告化合物捕獲在結(jié)合元件上的步驟相伴進(jìn)行。
29.權(quán)利要求20到28任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增是循環(huán)式擴(kuò)增。
30.權(quán)利要求29的方法，其中循環(huán)式擴(kuò)增是PCR。
31.權(quán)利要求30的方法，其中進(jìn)行PCR包括使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。
32.權(quán)利要求29到31任一項(xiàng)的方法，其中循環(huán)式擴(kuò)增包括至少10個(gè)循環(huán)。
33.權(quán)利要求29到32任一項(xiàng)的方法，其中循環(huán)式擴(kuò)增包含至少20個(gè)循環(huán)。
34.權(quán)利要求29到33任一項(xiàng)的方法，其中表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，在循環(huán)式擴(kuò)增的至少一個(gè)循環(huán)后進(jìn)行測(cè)定。
35.權(quán)利要求29到34任一項(xiàng)的方法，其中表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值，在循環(huán)式擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)后進(jìn)行測(cè)定。
36.權(quán)利要求29到35任一項(xiàng)的方法，其中表明靶核酸的存在和/或量的值，每次在表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值被測(cè)定后進(jìn)行測(cè)定。
37.權(quán)利要求1到36任一項(xiàng)的方法，其中表明捕獲在結(jié)合元件上的報(bào)告化合物的存在和/或量的值的測(cè)定包含了指示值的時(shí)間依賴性的監(jiān)測(cè)。
38.權(quán)利要求2到37任一項(xiàng)的方法，其中表明靶核酸的存在和/或量的值，根據(jù)將表明報(bào)告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸的存在和/或量的值相關(guān)聯(lián)的校正曲線來確定。
39.權(quán)利要求1到38任一項(xiàng)的方法，其中方法在選自生物傳感器分析裝置，微流體盒和芯片實(shí)驗(yàn)室的裝置中進(jìn)行。
40.方法，包括: 將液體導(dǎo)入到微流體裝置的反應(yīng)室中，液體中含有靶多核苷酸， 將靶多核苷酸結(jié)合到位于反應(yīng)室中的第一結(jié)合元件上， 對(duì)反應(yīng)室中的靶多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增以形成擴(kuò)增子，擴(kuò)增在存在報(bào)告化合物的情況下進(jìn)行， 將一部分報(bào)告化合物在反應(yīng)室中與擴(kuò)增子結(jié)合， 將剩余部分的報(bào)告化合物與反應(yīng)室中的第二結(jié)合元件結(jié)合，以及 檢測(cè)與第二結(jié)合元件結(jié)合的報(bào)告化合物。
41.方法,包括: 將液體導(dǎo)入到微流體裝置的反應(yīng)室中，液體中含有靶多核苷酸， 將靶多核苷酸結(jié)合到位于反應(yīng)室中的第一結(jié)合元件上， 在反應(yīng)室中對(duì)靶多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增以形成擴(kuò)增子，擴(kuò)增在存在報(bào)告化合物的情況下進(jìn)行， 在反應(yīng)室中將一部分報(bào)告化合物與擴(kuò)增子結(jié)合， 將剩余部分的報(bào)告化合物與反應(yīng)室中的第二結(jié)合元件結(jié)合，以及 檢測(cè)與第二結(jié)合元件結(jié)合的報(bào)告化合物。
42.方法，包括: 在擴(kuò)增混合物中擴(kuò)增靶多核苷酸以形成擴(kuò)增子，擴(kuò)增在存在報(bào)告化合物的情況下進(jìn)行，至少一部分?jǐn)U增子能夠與報(bào)告化合物形成復(fù)合物， 將一部分量的報(bào)告化合物與至少一部分?jǐn)U增子形成復(fù)合物；以及 檢測(cè)剩余部分的報(bào)告化合物，剩余部分的成員沒有與擴(kuò)增子復(fù)合。
43.權(quán)利要求42的方法，還包括根據(jù)檢測(cè)到的剩余部分的報(bào)告化合物在擴(kuò)增后確定表明存在的擴(kuò)增子的數(shù)量的值。
44.權(quán)利要求43的方法，還包括根據(jù)表明擴(kuò)增子的數(shù)量的值來確定表明擴(kuò)增混合物中存在的靶多核苷酸的數(shù)量的值。
45.權(quán)利要求42-43之一的方法，其中: 擴(kuò)增的步驟還包括對(duì)擴(kuò)增混合物中存在的對(duì)照多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，以形成對(duì)照擴(kuò)增子，擴(kuò)增在存在對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物的情況下進(jìn)行，至少一部分對(duì)照擴(kuò)增子能夠與對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物形成復(fù)合物， 將一部分量的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物與至少一部分對(duì)照擴(kuò)增子形成復(fù)合物；` 檢測(cè)剩余部分的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物，剩余部分的成員沒有與對(duì)照擴(kuò)增子復(fù)合；以及根據(jù)檢測(cè)到的剩余部分的報(bào)告化合物和檢測(cè)到的剩余部分的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物在擴(kuò)增后確定表明存在的擴(kuò)增子的數(shù)量的值。
46.權(quán)利要求45的方法，其中報(bào)告化合物和對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物各含有光學(xué)標(biāo)記物，檢測(cè)的步驟包括檢測(cè)光學(xué)標(biāo)記物。
47.權(quán)利要求42到46任一項(xiàng)的方法，還包括將沒有與擴(kuò)增子復(fù)合的報(bào)告化合物與固定在表面上的結(jié)合元件相結(jié)合，其中對(duì)與結(jié)合元件結(jié)合的剩余部分的報(bào)告化合物進(jìn)行檢測(cè)。
48.權(quán)利要求47的方法，其中結(jié)合元件是第一結(jié)合元件，方法還包括將沒有與對(duì)照擴(kuò)增子復(fù)合的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物與固定在表面上的第二結(jié)合元件相結(jié)合，其中剩余部分的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物的檢測(cè)是對(duì)與第二結(jié)合元件結(jié)合的剩余部分的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物進(jìn)行的。
49.權(quán)利要求47的方法，其中結(jié)合元件位于反應(yīng)室中，檢測(cè)的步驟在反應(yīng)室中進(jìn)行。
50.權(quán)利要求48的方法，其中第一和第二結(jié)合元件位于反應(yīng)室中，檢測(cè)報(bào)告化合物和對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物的步驟在反應(yīng)室中進(jìn)行。
51.權(quán)利要求42到50任一項(xiàng)的方法，還包括在擴(kuò)增步驟之前將靶多核苷酸結(jié)合到第三結(jié)合元件上，并將靶多核苷酸從第三結(jié)合元件上釋放。
52.權(quán)利要求49或50的方法，還包括在擴(kuò)增步驟之前將靶多核苷酸結(jié)合到第三結(jié)合元件上，將靶多核苷酸從第三結(jié)合元件上釋放，其中第三種結(jié)合元件位于反應(yīng)室中。
53.權(quán)利要求42到49任一項(xiàng)的方法，還包括重復(fù)擴(kuò)增,形成復(fù)合物和檢測(cè)的步驟N次，N至少為2，并且重復(fù)的擴(kuò)增步驟包括擴(kuò)增擴(kuò)增子。
54.權(quán)利要求53的方法，還包括對(duì)于至少某些N次重復(fù)中的每次來說，在檢測(cè)到的剩余部分的報(bào)告化合物的基礎(chǔ)上，來測(cè)定表明擴(kuò)增子的數(shù)量的值。
55.權(quán)利要求54的方法，還包括對(duì)于N次重復(fù)中的至少一次來說，在表明擴(kuò)增子的數(shù)量的值的基礎(chǔ)上，來測(cè)定表明擴(kuò)增混合物中存在的靶多核苷酸數(shù)量的值。
56.權(quán)利要求53到55任一項(xiàng)的方法，其中N是至少20。
57.權(quán)利要求53到56任一項(xiàng)的方法，其中重復(fù)的擴(kuò)增步驟包括擴(kuò)增對(duì)照擴(kuò)增子，方法包括重復(fù)在對(duì)照擴(kuò)增子和對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物之間形成復(fù)合物，以及檢測(cè)剩余部分的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物N次的步驟。
58.權(quán)利要求57的方法，對(duì)于至少某些N次重復(fù)中的每次來說，根據(jù)檢測(cè)到的剩余部分的報(bào)告化合物和檢測(cè)到的剩余部分的對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物來測(cè)定表明擴(kuò)增子數(shù)量的值。
59.權(quán)利要求42到58任一項(xiàng)的方法，其中靶多核苷酸源自于病原體，方法包括裂解病原體以釋放靶多核苷酸。
60.權(quán)利要求59的方法，其中病原體是病毒。
61.權(quán)利要求60的方法，其中病毒是HIV。
62.權(quán)利要求42到61任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告化合物含有可光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物，當(dāng)報(bào)告化合物與擴(kuò)增子復(fù)合時(shí)，以及當(dāng)報(bào)告化合物沒有復(fù)合時(shí)，可光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物的可檢測(cè)性基本上相同。
63.權(quán)利要求62的方法,其中標(biāo)記物是突光，當(dāng)報(bào)告化合物與擴(kuò)增子復(fù)合時(shí)突光標(biāo)記物的量子產(chǎn)率，在報(bào)告化合物沒有與擴(kuò)增子復(fù)合時(shí)標(biāo)記物的量子產(chǎn)率的10%的范圍內(nèi)。
64.權(quán)利要求62的方法，其中對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物含有可光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物，當(dāng)對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物與對(duì)照擴(kuò)增子復(fù)合時(shí)，以及當(dāng)報(bào)告化合物沒有復(fù)合時(shí)，可光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物的可檢測(cè)性基本上相同。
65.權(quán)利要求64的方法，其中對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物的標(biāo)記物是熒光，當(dāng)對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物與對(duì)照擴(kuò)增子復(fù)合時(shí)熒光標(biāo)記物的量子產(chǎn)率，在對(duì)照?qǐng)?bào)告化合物沒有與對(duì)照擴(kuò)增子復(fù)合時(shí)標(biāo)記物的量子產(chǎn)率的10%的范圍內(nèi)。
66.權(quán)利要求48的方法,其中第一和第二結(jié)合兀件被固定在同一表面上。
67.權(quán)利要求53到66任一項(xiàng)的方法，其中:擴(kuò)增混合物中靶多核苷酸的擴(kuò)增還包括在擴(kuò)增混合物中對(duì)另外N’種不同的靶多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，以形成相應(yīng)的不同的擴(kuò)增子，擴(kuò)增在存在N’種相應(yīng)的報(bào)告化合物的情況下進(jìn)行，至少一部分的每個(gè)第N’個(gè)擴(kuò)增子能夠與第N’個(gè)報(bào)告化合物形成復(fù)合物，N’至少為2，將一部分量的N’個(gè)報(bào)告化合物中的每一個(gè)與至少一部分第N’個(gè)擴(kuò)增子形成復(fù)合物；以及 檢測(cè)剩余部分的N’個(gè)報(bào)告化合物中的每一個(gè)，每個(gè)剩余部分的成員沒有與相應(yīng)的擴(kuò)增子復(fù)合。
68.權(quán)利要求67的 方法，其中N’至少為4。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103497991SQ201310055729
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2006年11月6日
【發(fā)明者】卡特林·施泰因梅策, 尤金·埃曼特勞特, 托爾斯滕·舒爾茨, 托馬斯·凱澤 申請(qǐng)人:科隆迪亞戈有限公司