專利名稱：Men1基因及其編碼蛋白的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，涉及MENl基因及其編碼蛋白在制備篩選治療肝纖維化和脂肪肝藥物方面的應用。
背景技術：
1997年Chandrasekharappa等首次在人類11號染色體長臂第I區(qū)第三條帶(llql3)鑒定并克隆出一種全新的抑癌基因——MEN1。該基因所編碼的蛋白menin是存在于多種組織和細胞中的內(nèi)分泌抑癌因子。其缺失或突變會誘發(fā)一種相對罕見的常染色體顯性遺傳病一多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病I型，引發(fā)包括甲狀旁腺瘤、胰腺胰島細胞腫瘤和垂體瘤在內(nèi)的多種內(nèi)分泌腫瘤2。目前已鑒定出上千種MENl基因突變位點，遍布于MENl基因的編碼區(qū)和啟動子內(nèi)，使蛋白的表達缺失或翻譯錯誤，導致menin抑癌功能的喪失和腫瘤的發(fā)生。然而menin結構相對特殊,并沒有發(fā)現(xiàn)與任何已知蛋白一致或類似的模體(mortif)。因此，目前對menin作為抑癌基因調(diào)節(jié)基因轉錄的具體分子機制的了解仍停留在初級階段，menin是否具有除抑癌外的其他重要生物學功能更是有待挖掘。各種研究表明 ，menin在各種系間序列高度保守，其C末端有兩個核定位序列(Nuclear Localization Signal, NLS)介導menin入核轉運并與DNA雙鏈結合6 ;另一方面，menin也具有支架蛋白和轉接蛋白的屬性，通過與多種不同的轉錄因子結合以對下游基因發(fā)揮多樣的轉錄調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)控細胞增殖、凋亡和基因組的修復。例如，menin能與組蛋白甲基轉移酶(HMT)相互作用，通過增強基因啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾來激活p27，P18等靶基因的表達，調(diào)節(jié)細胞周期。與之相反，menin也可募集組蛋白去乙?；?HDAC)至轉錄因子JunD的啟動子區(qū)，通過去除組蛋白的乙酰基團來沉默基因表達，影響細胞的增殖和凋亡。因此，menin是基因轉錄的重要調(diào)節(jié)子，通過多種機制廣泛參與多基因調(diào)控，維持細胞的正常功能。可以預見，menin由于遺傳因素所致的缺失或突變，以及病理狀態(tài)下異常的升高或降低，將導致正常分子調(diào)節(jié)機制的紊亂和組織細胞功能的異常。近年的研究表明，在肝臟慢性炎癥和腫瘤發(fā)生的病理過程中，常伴有肝細胞的上皮-間質樣轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。肝細胞是來源于內(nèi)胚層的多角形腺上皮細胞，占肝臟總細胞數(shù)的70-80%，承擔肝臟蛋白合成，糖和脂肪代謝，膽汁分泌等重要生物功能。肝細胞具備上皮細胞的各種特征，具有細胞極性，在細胞-細胞間和細胞-細胞外基質間存在緊密連接，排列規(guī)則。然而，在肝臟損傷、慢性炎癥或者腫瘤發(fā)生等病理情況下，肝細胞會逐步失去上皮細胞的特征，表現(xiàn)出間質細胞的表型，例如失去細胞極性和細胞間通訊、細胞骨架重排呈長梭狀、不規(guī)則排列、細胞遷移和運動增加等。如果肝臟損傷或者慢性炎癥持續(xù)存在，肝細胞可能通過EMT最終轉分化為成纖維細胞，通過分泌膠原蛋白促進肝纖維化的發(fā)展，最終導致肝功能的損傷和肝臟組織的重構。另一方面，肝癌時肝細胞EMT的發(fā)生，能增強癌細胞的遷移運動能力，并可通過增強金屬蛋白酶的分泌破壞細胞外基質，促進腫瘤轉移。在上皮細胞EMT的諸多影響因素中，上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達的改變占有主導地位。E-cadherin是上皮細胞表達的單次跨膜蛋白，介導Ca2+離子依賴的上皮細胞間緊密粘附，是上皮細胞的特異性標志之一，也具有抑制纖維化和腫瘤發(fā)生的重要功能。多個研究表明，肝臟腫瘤或纖維化等病理過程中，均伴有E-cadherin表達丟失或顯著下調(diào)；而過表達E-cadherin則能抑制肝細胞EMT的發(fā)生，減緩病程的進展。具體而言，E-cadherin的正常表達能維持上皮細胞間的緊密連接和正常的胞間通訊，阻斷細胞的游離和遷移，防止正常組織結構的破壞；另一方面，E-cadherin的胞內(nèi)部分能與β-catenin結合并相互作用，而β-catenin則是Wnt通路的關鍵信號分子。Wnt信號通路是介導纖維化和癌癥病變發(fā)生和發(fā)展的重要通路，在fct蛋白缺失情況下，β -catenin在Axin蛋白復合體(由Axin，APC和GSK3 0組成)作用下，磷酸化而降解失活，不能轉導進入核內(nèi)發(fā)揮作用。Wnt與受體Fzd結合后,偶聯(lián)LRP受體,使Axin蛋白復合體解聚，β -catenin不被磷酸化降解失活，從而轉導進入核內(nèi)作用于靶基因發(fā)揮轉錄激活作用。而與此同時，β-catenin也是錨鏈E-cadherin與細胞骨架的重要轉接蛋白，調(diào)節(jié)細胞-細胞間粘附。因此,E-cadherin的正常表達能夠將部分β -catenin錨定在細胞膜上，阻斷其入核轉運和Wnt通路的激活；而E-cadherin的下調(diào)能釋放更多的β -catenin入核激活下游基因的表達,促進纖維化和癌癥病變的進展。E-cadherin 啟動子區(qū)有近轉錄起始點(Transcription start site, TSS)區(qū)序列高度保守，有多個順式作用元件，能被多種轉錄因子所調(diào)節(jié)。例如，Slug29、Snail30、ZEB131和ZEB228等能與啟動子區(qū)的E-box等元件相結合,抑制E-cadherin啟動子活性；與之相反，AP-2，c-Myc32和WT133等轉錄因子能結合并激活E-cadherin —段富含GC的特異性序列，上調(diào)蛋白表達。因此，炎癥、損傷或各種致癌因素通過影響各種轉錄因子的表達或活性阻斷E-cadherin轉錄,而E-cadherin的缺失進一步改變上皮細胞表型,破壞組織結構,激活多種促炎和癌基因的表達，進一步推進組織的重構和病變的發(fā)展。作為抑癌基因的Menin和E-Cadherin之間是否存在某種聯(lián)系？肝細胞內(nèi)Menin的表達變化是否會影響肝細胞EMT，肝臟的慢性炎癥和纖維化病變的進展？本發(fā)明通過研究Menin在肝臟細胞中的作用，發(fā)現(xiàn)了缺失MeNl基因會發(fā)生肝臟一系列病變，與肝纖維化及肝纖維化發(fā)生有密切聯(lián)系。
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隨著近年來人們飲食結構和行為方式的改變，代謝綜合征的發(fā)病率和患病人數(shù)正在迅速增長，已成為世界性嚴重威脅健康的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計，我國18歲以上人群代謝綜合征的患病人數(shù)已超6000萬，發(fā)病率達到6.6%，并有繼續(xù)增長的趨勢。因此，對此領域的深入研究具有十分重要的意義。代謝綜合征是指包括2型糖尿病，血脂異常，肥胖，脂肪肝等多種代謝異常同時存在的一種疾病狀態(tài)，與心血管疾病密切相關，其中糖脂代謝異常及能量代謝失衡是導致一系列疾病發(fā)生的根源。因此，糖脂代謝的調(diào)控過程和精確機制是目前全球代謝研究領域的核心和熱點，對其中關鍵調(diào)控基因和信號通路的研究將揭示新的治療途徑和靶點。在人體中，肝臟是維持糖脂和能量代謝穩(wěn)態(tài)的核心器官，肝臟的代謝異常是導致脂肪肝，胰島素抵抗，動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生的關鍵因素43。因此，對于肝細胞中調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵基因一直是代謝研究和相關藥物研發(fā)的關注聚焦點。本發(fā)明通過建立肝細胞特異性Menl基因敲除小鼠模型，全面細致觀察了敲除小鼠在糖脂代謝方面的表型，并在體外具體探討了 Menl對肝細胞脂代謝相關基因的調(diào)控作用，為臨床上脂肪肝的治療提供了有意義的新方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供MENl基因及其編碼蛋白的應用。MENl基因及其編碼的蛋白menin可用于制備和篩選治療脂肪肝和肝纖維化的藥物。本發(fā)明通過建立肝特異的MENl基因敲除小鼠模型，研究Menin在肝細胞內(nèi)所扮演的重要角色，并利用多種技術研究Menin調(diào)節(jié)E-cadherin基因表達，抑制EMT發(fā)生的具體分子機制，研究MENl和Menin在糖脂代謝調(diào)控中的作用，為臨床靶向治療提供有價值的線索和方向。對研究和治療肝纖維化和脂肪肝提供有價值的線索和方向。MENl敲除后肝臟TGF/Smad通路也被激活，磷酸化的Smad水平明顯高于對照組野生型小鼠，提示了 MENl可能通過多種途徑調(diào)節(jié)EMT和纖維化的病理發(fā)生。ENl基因的正常表達有助于維持肝細胞的上皮樣表型；MEN1缺失可促進肝細胞發(fā)生上皮樣-間質樣細胞轉化(EMT)。MENl缺失所誘導的肝細胞EMT促使細胞轉變?yōu)樗鬆睿g連接消失，遷移能力增強，TGFii刺激下這一差異更為明顯。MENl缺失所誘導的肝細胞EMT促使上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達下降,而間質細胞標志蛋白Collal、Col5a2等則明顯上升，TGFii刺激下這一差異更為明顯。menin可能通過類似的機制來影響E-cadherin啟動子區(qū)H3K4的甲基化從而調(diào)控其基因表達。染色質免疫共沉淀技術(ChIP)顯示,menin蛋白可與E-cadherin啟動子區(qū)相結合，提示menin可能作為協(xié)轉錄因子調(diào)節(jié)E-cadherin表達9_11。進一步研究發(fā)現(xiàn),menin缺失后E-cadherin啟動子區(qū)H3K4的甲基化水平顯著降低，與MENl基因敲除小鼠肝臟中E-cadherin表達下降的結果相一致。這一發(fā)現(xiàn)很好的驗證了我們的假設，即menin缺失后，E-cadherin轉錄水平隨即下調(diào)，進而促進肝細胞EMT的發(fā)生和肝臟纖維化的病理過程。綜上所述，本研究通過體內(nèi)外實驗全面探討Menin在肝細胞內(nèi)所扮演的重要角色，并利用多種技術研究Menin調(diào)節(jié)E-cadherin基因表達，抑制EMT發(fā)生的具體分子機制，為臨床靶向治療提供有價值的線索和方向。在2型糖尿病db/db小鼠模型肝臟和脂肪組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)menin表達顯著降低。肝細胞MENl基因缺失不影響普通飲食下全身和肝臟局部的脂質代謝；但是會加重高脂飲食下全身和肝臟局部的脂質代謝紊亂，利用腺病毒過表達menin則使脂代謝明顯改善。肝細胞MENl基因缺失促進肝細胞吞脂受體⑶36的表達。普通和高脂飲食下，肝細胞menin對糖代謝均無影響。Menin缺失后，肝臟蛋白乙?；矫黠@升高。本發(fā)明首次在體內(nèi)外證實肝細胞Menin對穩(wěn)定全身和肝臟脂質代謝的重要作用，并嘗試探討了內(nèi)在的分子機制，拓寬了以往對menin蛋白功能的傳統(tǒng)認識，為脂肪肝機制的研究和臨床靶向治療提供有價值的線索和方向。


圖1為實施例1肝臟特異性MENl基因敲除小鼠模型(LMKO)的鑒定。 圖2實施例 2肝臟特異性MENl基因敲除小鼠模型(LMK0)與對照組(C0N)原代肝細胞的細胞骨架F-actin熒光染色圖。圖3為實施例2肝臟特異性MENl基因敲除小鼠模型(LMKO)與對照組小鼠(CON)間肝臟膠原蛋白家族各成員的表達差異(* p〈0.05)。圖4為實施例2肝臟特異性MENl基因敲除小鼠模型(LMKO)與對照組小鼠(CON)肝原代細胞遷移能力及MENl過表達時肝細胞遷移愈合能力。A為利用劃痕試驗并用TGF3刺激比較LMKO和對照組小鼠原代肝細胞遷移愈合能力，B為細胞遷移速度(*P〈0.05) ；C-E為MENl基因過度表達恢復LMKO小鼠原代肝細胞，利用腺病毒將MENl-GFP或GFP對照轉導LMKO小鼠原代肝細胞，C為熒光顯微鏡檢測結果，顯示一致的轉導效率，D為劃痕試驗并用TGF^刺激比較MENl基因過度表達如何影響MENlvi肝細胞的遷移愈合能力，E為細胞遷移速度的定量統(tǒng)計(*Ρ〈0.05)。圖5為實施例2中，注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型，造模4周和8周時，肝臟特異性MENl基因敲除小鼠模型(LMKO)與正常對照組小鼠(CON)細胞凋亡數(shù)量，A為原位檢測細胞凋亡的TUNEL試驗分析結果，B為利用Image-Pro Plus6.0定量分析兩組動物肝臟內(nèi)
凋亡細胞數(shù)量。圖6為實施例2中，MENl基因缺失對肝細胞多種纖維化相關基因表達量的影響。圖7為實施例2中，MENl基因缺失對肝組織內(nèi)上皮樣和間質樣細胞分子標志表達的影響，A-D為利用real-time PCR比較普通CON和CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中(8周)，對照組CON與LMKO小鼠肝臟組織中E-cadherin、Collal和Col5a2等基因mRNA的表達情況，E和F為利用Western Blot技術分析上述小鼠肝臟中E-cadherin的蛋白表達情況。*Ρ〈0.05。圖8為實施例3中，2型糖尿病db/db小鼠模型的肝臟和脂肪組織中menin蛋白水平。圖9為實施例3普通飲食下野生型WT和MENl基因敲除小鼠(LMKO)脂質代謝水平，A、B和C為普通飲食下野生型和LMKO血清中甘油三酯TG、膽固醇和游離脂肪酸FFA的水平，D和E為兩組小鼠肝臟組織內(nèi)甘油三酯和膽固醇水平，F(xiàn)為兩組小鼠的肝臟體重比。圖10為實施例3高脂肪飲食下野生型WT和MENl基因敲除小鼠(LMKO)脂肪肝病變。6-8周齡野生型和LMKO小鼠喂養(yǎng)高脂飼料12周誘導脂肪肝形，A為兩組小鼠肝臟照片，B為組織切片進行H&E及油紅染色顯示肝組織內(nèi)脂滴的照片，C和D為兩組小鼠體重及肝臟體重比(**P〈0.01)。圖11為實施例3高脂肪飲食下野生型WT和MENl基因敲除小鼠(LMKO)血清和肝組織中甘油三酯和膽固醇、游離脂肪酸水平。A、B和C為高脂飲食下野生型和LMKO血清中甘油三酯TG、膽固醇和游離脂肪酸FFA的水平，D和E為兩組小鼠肝臟組織內(nèi)甘油三酯和膽固醇水平圖12為實施例3高脂肪飲食下野生型WT和MENl基因敲除小鼠(LMKO)肝功能，A為小鼠血清中ALT含量，B為AST，** Ρ〈0.01。圖13為實施例3利用腺病毒過表達MENl改善小鼠脂質代謝紊亂的效果，左側柱狀圖為WT，右側柱狀圖為LMKO ；Α為MENl過表達電泳圖，B和C為WT和LMKO小鼠血清中甘油三酯和游離脂肪酸FFA含量，C和D為肝臟組織內(nèi)甘油三酯和膽固醇水平，F(xiàn)為兩組小鼠肝臟體重比，* Ρ〈0.05，* * Ρ〈0.0I。
具體實施方 式
動物:Menl/oxP/loxP小鼠購自美國Jackson實驗室；Alb_Cre小鼠購自南京大學模式動物研究所；小鼠普通飲食飼料購自上海斯萊克實驗動物有限公司，高脂飲食(含60%脂肪)購自美國Research Diet公司。抗體:GAPDH、總Smad2、Smad3,憐酸化 Smad2 和 Smad3 抗體購自 CellSignalingTechnology 公司；menin 抗體購自 BETHYL 公司；E_cadherin 抗體購自 BD BiosciencesPharmingen 公司；Collagenl 抗體購自 Millipore 公司；Methyl_H3K4 抗體購自 ABcam 公司。各種限制性內(nèi)切酶，DNA連接試劑盒購自Promega公司。肝臟原代細胞為本實驗室自行分離得到。實施例1肝臟特異性MENl基因敲除小鼠模型(LMKO)建立利用Cre/LoxP策略通過以下步驟建立肝臟特異性MENl基因敲除(Liver-Specific Menin Knockout, LMKO)小鼠模型1)從南京模式動物中心獲得由白蛋白(Albumin)基因啟動子驅動的Cre重組酶轉基因小鼠(Alb-Cre+)。2)從Jackson Lab獲得在MENl基因座(Locus)兩端構建有LoxP位點的轉基因小鼠(MENlloxP/loxP)。3)將雄性Alb-Cre+與雌性MENlloxP/loxP小鼠雜交，篩選獲得Fl代的雜合子小鼠(Alb-Cre+ ；MENl1xP/-)。4)將雄性雜合子小鼠(Alb-Cre+ ；MENl1xP/-)與雌性 MENlloxP/loxP 雜交，最終篩選獲得純和的LMKO小鼠(Alb-Cre+ ；ΜΕΝ11οχΡ/1οχΡ)與相應的正常對照(Alb-Cre-；MENlloxP/loxP)。通過PCR基因型鑒定和肝組織切片的免疫組織化學分析，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組WT相比，LMKO小鼠肝臟中Menin蛋白表達缺失，如圖1所示。實施例2( 1)小鼠肝纖維化模型建立選取8 — 10周齡的成年小鼠，按每組10只分為4組，分別為:野生型對照組、敲除型對照組、野生型肝臟纖維化實驗組、敲除型肝臟纖維化實驗組、野生型肝硬化實驗組、敲除型肝硬化實驗組。實驗組使用CC14按0.5mL/kg(以1: 7的比例溶于橄欖油中，然后根據(jù)小鼠體重，每克體重注射IOuL藥物)腹腔注射，對照組使用橄欖油等量腹腔注射，一周2次，共注射4周和8周，分別建立小鼠肝臟纖維化以及肝硬化的動物模型。

(2) MENl基因在肝臟中的作用為了探尋MENl基因在肝臟中所扮演的角色，我們分別收獲LMKO和WT小鼠肝臟RNA，并利用基因芯片(miCToarray)分析兩組動物臟內(nèi)基因表達譜差異。通過采用P值〈0.05%，且變化差異> 1.5的標準，一共得到208個變化差異顯著且具有統(tǒng)計學意義的基因。為了更好的分析差異表達基因所涉及的生物學過程(P)、分子功能(F)以及細胞成分(C)，應用MAPPFinder (GenMAPP2.1軟件包的一部分)將表達譜數(shù)據(jù)行Gene Ontology分層分析，在P〈0. 05的基礎上，得到了 GO生物學分類的基因列表，每個分類下至少包含2個差異表達的基因，一共發(fā)現(xiàn)26個上調(diào)的基因分類和57個下調(diào)基因分類。發(fā)現(xiàn)參與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)分泌的基因在LMKO和WT小鼠肝臟中有較大程度的改變。通過利用火山圖(volcano plot)對基因芯片數(shù)據(jù)進一步分析,也發(fā)現(xiàn)ECM的主要組成成分之一的膠原蛋白成員5a (Col5a2)在LMKO小鼠肝臟中有顯著上調(diào)(23倍，p〈0.01)。為了進一步明確menin是否影響ECM的形成，篩選出芯片中膠原蛋白家族各亞型相關數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計其表達差異(圖3)，發(fā)現(xiàn)Colla2、Col5a2、Col5a3和ColHal在LMKO小鼠肝臟中均明顯升高，具有顯著的統(tǒng)計學意義，提示肝細胞內(nèi)menin蛋白表達缺失可以誘導肝細胞合成多種膠原蛋白，促進肝纖維化的病理發(fā)生過程。傳統(tǒng)的觀點認為，肝細胞并不參與合成膠原纖維；在病理條件下，肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)被激活,其表型由靜止型轉化為肌成纖維細胞樣細胞,促進膠原的合成和分泌和肝纖維化的進展。然而近年的研究發(fā)現(xiàn)，在肝組織損傷或癌變等病理條件下，肝細胞本身亦能發(fā)生EMT，表現(xiàn)出間質樣細胞的表型，例如細胞-細胞間連接和細胞極性消失，遷移能力增強，合成和分泌細胞外基質等，成為肝臟纖維化病變和癌灶轉移的重要潛在致病因素。因此，我們進一步觀察MENl基因的表達是否會介導肝細胞的表型轉換和EMT的發(fā)生，從而導致上述基因芯片檢測到的多種基因的表達變化。通過原代分離LMKO和對照組CON小鼠原代肝細胞并對細胞骨架F-actin進行熒光染色分析，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MENl基因敲除的肝 細胞呈現(xiàn)出間質細胞形態(tài)，具體表現(xiàn)為細胞-細胞間連接明顯減少，細胞形態(tài)由多角形轉變?yōu)殚L梭形等；在轉化生長因子TGFii的刺激下，差別更為明顯(如圖2)。說明MENl敲除促進原發(fā)生EMT。細胞EMT的一個重要特征是細胞遷移能力增加，增強細胞的活動性(motility)和癌變細胞的侵襲能力(metastasis)。我們通過劃痕試驗(wound-healing assay)發(fā)現(xiàn),MENl基因的表達缺失顯著增強肝原代細胞遷移能力(圖4A和B)，進一步證實MENl的正常表達能維持肝細胞的上皮細胞表型，抑制EMT的發(fā)生。MENl基因的過表達恢復LMKO小鼠原代肝細胞的上皮細胞樣表型:為了進一步確定MENl基因對肝細胞表型的調(diào)控作用，我們利用腺病毒表達系統(tǒng)在LMKO小鼠原代肝細胞中導入MENl-GFP重組基因或GFP對照(圖4C)，熒光顯微鏡下檢測，兩者轉導效率一致。劃痕試驗提示，MENl基因的過表達能在一定程度上抑制MENl基因缺失所致的增強的肝細胞遷移能力，恢復上皮細胞樣表型(圖4D)，遷移速度的定量統(tǒng)計見圖4E (*P<0.05)。MENl基因分別對上皮樣和間質樣細胞分子標志表達的影響:上皮細胞 丐粘蛋白(E-cadherin)是一種在上皮細胞胞膜表面特異性表達的單次跨膜蛋白，介導Ca2+離子依賴的上皮細胞間緊密粘附，是上皮細胞的特異性標志之一，也具有抑制纖維化和腫瘤發(fā)生的重要功能。在EMT的發(fā)生過程中，總是伴有E-cadherin表達水平的下調(diào)；另一方面，在病理條件下，上皮細胞經(jīng)EMT可最終轉變?yōu)槌衫w維細胞樣細胞，表達和分泌多種纖維蛋白，促進纖維化的發(fā)生和組織的重構。通過實時突光多聚酶鏈式反應(real-time polymerase chainreaction, real-time PCR),我們發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，LMKO小鼠原代肝細胞E-cadherin表達明顯下降(0.29±0.02倍，P<0.05)刺激下，E-cadherin表達進一步下調(diào)(CON:0.32±0.06vs.LMKO: 0.07±0.01，Ρ〈0.05)，與 Western 蛋白免疫印跡和免疫熒光染色結果相符。與此同時，膠原蛋白家族成員Collal (CON:56.68±4.61vs.LMKO: 93.97±5.51，Ρ〈0.05)，Col5al (CON:4.83±0.40vs.LMKO: 7.10± L 46，Ρ〈0.05)和 Col5a2(C0N:9.12±0.76vs.LMKO: 47.11± 1.76，Ρ〈0.05)的表達明顯上升。以上結果提示MENl基因的正常表達能在分子水平維持E-cadherin的正常表達并抑制膠原蛋白的合成，MENl基因的異常缺失則會誘導肝細胞EMT的發(fā)生。(3)肝細胞MENl基因缺失加劇肝臟纖維化病變進展上述體外實驗結果均提示MENl基因的正常表達能夠抑制肝細胞EMT的發(fā)生和轉變?yōu)殚g質樣細胞后的膠原蛋白合成。那么MENl基因缺失是否會促進肝臟的纖維化病變的進展呢？為了驗證這一假設，我們通過腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立小鼠肝纖維化模型，分別在造模第4周和第8周比較兩組動物肝臟纖維化的進展情況。H&E染色和特異性顯示膠原纖維的Sirius Red染色提示，與正常對照相比LMKO小鼠肝臟纖維化程度明顯上升；進一步利用Image-Pro Plus軟件定量分析，結果顯示，在造模4周和8周LMKO小鼠纖維化嚴重程度較WT組(CON)均高2倍以上。另一方面，TUNEL試驗顯示CCl4造模后兩組小鼠肝臟細胞凋亡數(shù)量無明顯差異，表明MENl基因缺失并不通過誘發(fā)肝細胞的凋亡以增強肝臟纖維化病變(圖5)。(4)肝細胞MENl基因缺失對肝組織內(nèi)上皮樣和間質樣細胞分子標志表達的影響:我們進一步通過real-time PCR和western blot比較在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中，LMKO組和WT組的肝臟組織中細胞表型相關分子的表達差異(圖6，圖7)。與體外原代細胞實驗結果相一致，LMKO造模小鼠肝臟中E-cadherin的mRNA (圖7B ；C0N:1.05±0.1lvs.LMKO:0.57±0.06，P〈0.05)和蛋白水平(圖7E、F)顯著降低；與之相應，膠原蛋白家族的Collal (圖 7C ；C0N:15.93±3.05vs.LMKO:29.47±6.51，Ρ〈0.05)和 Col5a2 (圖 7D ；C0N:
4.57 ± 0.94vs.LMKO:13.08 ±3.89，P〈0.05)的mRNA表達水平則明顯上升，具有顯著的統(tǒng)計學意義。綜上所述，MENl基因的正常表 達有助于維持肝細胞的上皮樣表型；MENl缺失可促進肝細胞發(fā)生上皮樣-間質樣細胞轉化(EMT)。MENl缺失所誘導的肝細胞EMT促使細胞轉變?yōu)樗鬆?，胞間連接消失，遷移能力增強，TGFii刺激下這一差異更為明顯。MENl缺失所誘導的肝細胞EMT促使上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達下降,而間質細胞標志蛋白Collal、Col5a2等則明顯上升，TGF^刺激下這一差異更為明顯。給予小鼠CCL4注射4周后，小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化病變；注射8周后，小鼠肝臟呈現(xiàn)程度不同的肝硬化病變。而肝臟特異性MENl敲除的小鼠病變程度更為嚴重。與細胞實驗結果相一致，CCl4刺激下肝臟特異性MENl敲除小鼠較對照組相比，肝臟組織中E-cadherin表達進一步下降，Collal、Col5a2等膠原蛋白表達則進一步上升。小鼠注射CC I4后，體內(nèi)TGFP通路激活，磷酸化smad2/3的水平增高，MENl基因敲除小鼠則更為明顯。在肝臟原代細胞中，ChIP實驗驗證menin與E-cadherin啟動子相結合,并通過促進啟動子區(qū)H3K4甲基化來激活E-cadherin的轉錄和表達。本發(fā)明研究結果顯示，MENl是維持肝細胞上皮樣表型的重要基因，MENl的表達缺失將誘導肝細胞轉分化，出現(xiàn)間質樣細胞表型，并通過上調(diào)纖維蛋白表達加劇肝纖維化病變的發(fā)展。近年的研究發(fā)現(xiàn)，在肝組織損傷或癌變等病理條件下，肝細胞本身能發(fā)生EMT，表現(xiàn)出間質樣細胞的表型，成為肝臟纖維化病變和癌灶轉移的重要潛在致病因素15。在本研究中，我們分離出肝臟Menl敲除小鼠的肝臟原代細胞。與對照組相比，MENl敲除的肝細胞出現(xiàn)了明顯的EMT現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為E-cadherin的下調(diào)和細胞間連接的消失，細胞形態(tài)的梭狀改變和遷移能力增強，以及纖維蛋白家族中Collal和Col5a2等基因表達上調(diào)等；而這一現(xiàn)象在加入外源性TGFii刺激之后變得更為顯著。為了進一步在動物體內(nèi)驗證MENl對肝細胞EMT的影響，我們通過Cre/LoxP策略建立了肝細胞特異性MENl基因敲除小鼠模型，并利用CCl4腹腔注射誘導肝纖維化的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，MENl敲除小鼠肝臟組織內(nèi)的E-cadherin表達下調(diào)明顯，膠原蛋白家族的Colla和Col5a2則顯著上升，與體外細胞實驗的結果相一致。更為重要的是，天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)，MENl敲除小鼠肝纖維化病變較對照組野生型小鼠明顯加重，提示MENl缺失所致的EMT直接或間接促進了肝纖維化的發(fā)生。而肝臟星狀細胞參與纖維化病理過程所上調(diào)的基因如MMP家族等，與對照組野生型小鼠相比則無明顯差別。此外，MENl敲除后肝臟TGF/Smad通路也被激活，磷酸化的Smad水平明顯高于對照組野生型小鼠，提示了 MENl可能通過多種途徑調(diào)節(jié)EMT和纖維化的病理發(fā)生。因此，MENl基因及其編碼的蛋白可以用作制備和篩選治療肝纖維化的藥物。實施例3( I)小鼠高脂模型的建立選取6-8周齡小鼠，對照組和敲除型每組各12只，給予高脂飼料(含60%脂肪)喂養(yǎng)12周后建立高脂肥胖小鼠模型。(2) Menin在 db/db小鼠肝臟和脂肪中表達下調(diào)與對照組野生型小鼠相比，2型糖尿病db/db小鼠模型的肝臟和脂肪組織中，menin蛋白水平顯著下調(diào)。而在肌肉組織中的menin表達則無明顯改變。如圖8所示。(3)肝細胞MENl表達缺失不影響普通飲食下的脂質代謝水平為了研究MENl基因對脂質代謝的影響，我們首先建立肝細胞特異性MENl基因敲除(Alb-Cre+ ；ΜΕΝ11οχΡ/1οχΡ,即 LMK0)和正常對照組(Alb-Cre- ；ΜΕΝ11οχΡ/1οχΡ,即 WT)小鼠模型，予普通飲食喂養(yǎng)至12周齡，分別比較普通狀態(tài)兩組動物血清和肝臟組織內(nèi)脂質水平，結果如圖9。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和游離脂肪酸(FFA)水平的測定顯示，兩組動物血清(圖9A-C)和肝組織(圖9D-E)中各種脂質成分均無差異，提示menin的缺失并不影響基礎條件下脂質代謝水平。(4) MENl敲除小鼠在高脂飲食條件下表現(xiàn)出更加嚴重的脂肪肝為了進一步分析menin在高脂環(huán)境中對肝臟脂質代謝影響，我們給予6_8周齡的LMKO及對照組WT小鼠高脂飼料(購于美國Research Diet公司)喂養(yǎng)12周，成功建立小鼠脂肪肝模型。兩組小鼠肝臟外形如圖1OA ;肝臟組織切片的H&E和油紅染色如圖10B，顯示肝組織內(nèi)脂滴的大小及分布；體重和肝體重之比如圖1OC和D，up〈0.01。血清(圖1IA-C)和肝組織(圖11D-E)中甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸的測定顯示，MENl基因敲除小鼠在高脂飲食條件下出現(xiàn)更為嚴重的脂肪肝；同時肝功能指標ALT也高于對照組野生型小鼠WT(圖 12)。(5) MENl敲除小鼠中過表達menin減輕脂肪肝病變?yōu)榱嗣鞔_menin對脂肪肝形成的抑制作用，我們給6_8周齡的LMKO小鼠高脂飼料喂養(yǎng)13周建立脂肪肝動物模型，并在造模第10周利用腺病毒表達系統(tǒng)通過尾靜脈注射將GFP-MENl或GEP對照導入MENl敲除小鼠體內(nèi)，觀察對脂肪肝形成影響。我們發(fā)現(xiàn)過表達MENl (圖13A)可明顯降低血清中游離脂肪酸(圖13C，F(xiàn)FA)和肝組織內(nèi)甘油三酯水平(圖13D)，但不影響血清甘油三酯(圖13B)和肝組織內(nèi)膽固醇(圖13E)水平，在一定程度上減輕了高脂飲食后全身和肝組織局部的脂代謝紊亂。(6)肝細胞MENl表達缺失不影響糖代謝水平肝細胞MENl在影響脂質代謝的同時是否對糖代謝亦有調(diào)控作用呢？我們進一步測定普通飲食及高脂喂養(yǎng)小鼠的空腹血糖、重新進食(refed) 4小時后血糖水平，并行胰島素耐量試驗、葡萄糖耐量試驗和丙酮酸耐量試驗全面評價兩組小鼠糖代謝水平。結果均提示，肝臟特異性MENl基因敲除后，并不影響小鼠糖代謝水平。利用Real-time PCR技術分析高脂模型下兩組小鼠肝臟內(nèi)脂代謝相關基因的表達差異。實驗顯示調(diào)節(jié)肝臟脂質攝取的⑶36在敲除組明顯上調(diào)。將LMKO小鼠肝組織切片行泛乙?；拿庖呓M化染色后發(fā)現(xiàn)，LMKO小鼠肝臟蛋白乙?；脚c對照組野生型相比明顯增 加。前的工作已經(jīng)證實了 menin能夠與重要的去乙酰化酶SIRTl相互作用，而SIRTl可以通過抑制靶基因上組蛋白的乙?；絹碚{(diào)節(jié)其轉錄與表達。因此我們假設，MENl基因缺失后促進肝臟脂肪變性的分子機制為，細胞核中的menin通過與SIRTl相互作用，影響組蛋白或功能蛋白質的乙?；?，繼而直接或間接調(diào)節(jié)CD36等脂代謝相關基因的轉錄和表達，最終影響脂肪肝的發(fā)生與發(fā)展。上述結果顯示，在2型糖尿病db/db小鼠模型肝臟和脂肪組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)menin表達顯著降低。肝細胞MENl基因缺失不影響普通飲食下全身和肝臟局部的脂質代謝；但是會加重高脂飲食下全身和肝臟局部的脂質代謝紊亂，利用腺病毒過表達menin則使脂代謝明顯改善。肝細胞MENl基因缺失促進肝細胞吞脂受體CD36的表達。普通和高脂飲食下，肝細胞menin對糖代謝均無影響。Menin缺失后,肝臟蛋白乙?；矫黠@升高。因此可以確定，肝細胞MENl基因與脂質代謝密切相關，menin表達的缺失促進高脂飲食下肝內(nèi)甘油三酯的蓄積和脂肪肝進展。menin作為支架蛋白能與SIRTl相互作用，通過調(diào)節(jié)肝臟蛋白的乙?；絹碛绊懜渭毎x相關基因的轉錄和表達。menin和MENl基因可作為靶向基因用來研究和篩選制備治療脂肪肝和肝纖維化的藥物。
權利要求
1.MENl基因在制備和篩選治療肝臟纖維化的藥物方面的應用。
2.MENl基因在制備和篩選治療脂肪肝的藥物方面的應用。
3.MENl基因所編碼的蛋白menin在制備和篩選治療肝臟纖維化的藥物方面的應用。
4.MENl基因所編碼的蛋白menin在制備和篩選治療脂肪肝的藥物方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領域，通過建立肝特異的MEN1基因敲除小鼠模型，研究menin在肝細胞內(nèi)所扮演的角色，發(fā)現(xiàn)MEN1基因在抑制EMT(肝細胞的上皮-間質樣轉化)和糖脂代謝調(diào)控中具有重要的作用。MEN1基因可用作制備篩選抗肝纖維化和脂肪肝藥物，為臨床靶向治療提供有價值的線索和方向。
文檔編號C12Q1/68GK103251958SQ20131002417
公開日2013年8月21日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權日2013年1月22日
發(fā)明者寧光, 薛璐, 李小英, 劉瑞欣, 姜秀麗, 曹亞南 申請人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所