專利名稱：一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，我國(guó)蔬菜種植面積已經(jīng)超過15，000萬畝，其中大棚蔬菜和設(shè)施園藝植物已超過2010萬畝。由于蔬菜溫室栽培面積的擴(kuò)大和重茬連作，為病蟲害的發(fā)生提供了有利的生態(tài)條件。蔬菜枯萎病，灰霉病，立枯病等多種真菌病害在蔬菜種植中普遍發(fā)生，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，造成大幅度減產(chǎn)，是農(nóng)民在育苗、種植過程中常遇到的棘手問題。辣椒疫病是由青椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)引起的一種土傳病害，是青椒的毀滅性病害，在青椒的整個(gè)生育期內(nèi)均可發(fā)病。青椒疫霉(Phytophthora capsiciLeonian)是鞭毛菌亞門的真菌。病菌以卵孢子在土壤中或病殘?bào)w中越冬，借風(fēng)、雨、灌水及其他農(nóng)事活動(dòng)傳播。發(fā)病后可產(chǎn)生新的孢子囊，形成游動(dòng)孢子進(jìn)行再侵染。病菌生育溫度范圍為10 - 37°C，最適宜溫度為20 - 30°C?？諝庀鄬?duì)濕度達(dá)90%以上時(shí)發(fā)病迅速；重茬、低洼地、排水不良，氮肥使用偏多、密度過大、植株衰弱均有利于該病的發(fā)生和蔓延。大水漫灌和高溫高濕的條件容易引起青椒疫病的大面積流行，常造成辣椒減產(chǎn)，甚至絕收，辣椒疫病已成為世界范圍內(nèi)青椒的毀滅性病害?；颐共≡谖覈?guó)北方菜區(qū)是一種危害性很大的病害。塑料大棚、溫室、小拱棚等保護(hù)設(shè)施栽培的番茄、辣椒、黃瓜、菜豆等蔬菜常發(fā)生灰霉病的流行，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)20-30%以上。番爺灰霉病的病原是灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.),屬于半知菌的一種真菌。分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，有分隔和分枝，灰至灰褐色，成叢從寄主表皮長(zhǎng)出，大小為280-550X12-24微米。分生孢子近球形或卵形，單細(xì)胞、淡色，大小為9-15X6.5_10微米。病菌還可產(chǎn)生黑褐色、不規(guī)則形的菌核。病菌寄主范圍較廣，除侵染茄科蔬菜外，還可侵染瓜類、甘藍(lán)、菜豆、萵苣、洋蔥、蘋果等作物。病菌主要以菌絲體或微菌核隨病殘?bào)w或遺留在土壤中越冬，成為下一個(gè)生長(zhǎng)季初侵染的菌源。在我國(guó)南方的病菌也可以在保護(hù)栽培設(shè)施內(nèi)終年存活。病菌的分生孢子可通過風(fēng)雨、昆蟲、甚至農(nóng)事操作而傳播，條件適宜時(shí)即萌發(fā)，多從傷口或衰老、壞死組織侵入。初侵染發(fā)病后又長(zhǎng)出大量新的分生孢子，通過傳播可不斷進(jìn)行再侵染。目前生產(chǎn)上多采用化學(xué)藥劑防治，但是長(zhǎng)期大量地使用農(nóng)藥致使病原菌產(chǎn)生抗性，且嚴(yán)重破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，造成對(duì)環(huán)境的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可可木霉及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的可可木霉(Trichoderma theobromicola),名稱為Gull,已于2012年12月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCN0.6994?？煽赡久?Trichoderma theobromi cola )Gu 11CGMCC N0.6994 在下文中簡(jiǎn)稱可可木霉 Gull。
所述可可木霉Gull可以分生孢子、厚垣孢子、菌絲或含有分生孢子和菌絲的菌絲體的形式存在。本發(fā)明所提供的可可木霉Gull的應(yīng)用為下述任一種:1、可可木霉Gull在防治植物病害中的應(yīng)用。2、可可木霉Gull和/或可可木霉Gull的代謝物在制備植物病原囷抑制劑中的應(yīng)用。3、可可木霉Gull和/或可可木霉Gull的代謝物在制備植物病咅抑制劑中的應(yīng)用。4、植物病原菌抑制劑或植物病害抑制劑，它的活性成分是可可木霉Gull和/或可可木霉Gull的代謝物。·5、防治蔬菜疫病的方法，包括用可可木霉菌懸浮液噴施蔬菜植株的步驟；所述可可木霉菌懸浮液是用水懸浮可可木霉Gull得到的液體，所述可可木霉菌懸浮液中可可木霉 Gull 的含量為(2.0X IO4)- (5.0XlO7) cfu/ml (如 107cfu/ml)。6、防治蔬菜真菌病害的方法，包括用可可木霉菌懸浮液噴施蔬菜植株的步驟；所述可可木霉菌懸浮液是用水懸浮可可木霉Gull得到的液體，所述可可木霉菌懸浮液中可可木霉 Gull 的含量為(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml (如 107cfu/ml)；所述蔬菜真菌病害為蔬菜灰霉病、蔬菜菌核病、蔬菜黑星病和蔬菜褐斑病中至少一種。7、防治蔬菜枯萎病的方法，包括用可可木霉菌懸浮液浸泡蔬菜胚根的步驟；所述可可木霉菌懸浮液是用水懸浮可可木霉Gull得到的液體，所述可可木霉菌懸浮液中可可木霉 Gull 的含量為(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml (如 107cfu/ml)。上文中，所述植物病害可為真菌病害。所述真菌病害可為植物疫病、植物灰霉病、植物菌核病、植物黑星病、植物枯萎病和植物褐斑病中的至少一種。所述植物疫病可由辣椒疫霉引起，所述植物灰霉病可由灰葡萄孢菌引起，所述植物菌核病可由菌核核盤菌引起，所述植物黑星病可由瓜瘡痂枝孢霉菌弓I起，所述植物枯萎病可由尖孢鐮刀菌引起，所述植物褐斑病可由瓜棒孢霉引起。所述植物疫病具體可為辣椒疫病。所述植物灰霉病具體可為番茄灰霉病。所述植物菌核病具體可為黃瓜菌核病。所述植物黑星病具體可為黃瓜黑星病。所述植物枯萎病具體可為黃瓜枯萎病。所述植物褐斑病具體可為黃瓜褐斑病。上文中，所述植物病原菌可為植物疫病致病菌、植物灰霉病致病菌、植物菌核病致病菌、植物黑星病致病菌、植物枯萎病致病菌、植物褐斑病致病菌和植物紋枯病致病菌中的至少一種。所述植物疫病致病菌具體可為辣椒疫霉，所述植物灰霉病致病菌具體可為灰葡萄孢菌，所述植物菌核病致病菌具體可為菌核核盤菌，所述植物黑星病致病菌具體可為瓜瘡痂枝孢霉菌，所述植物枯萎病致病菌具體可為尖孢鐮刀菌，所述植物褐斑病致病菌具體可為瓜棒抱霉。上文中，所述防治具體可為預(yù)防和/或治療。所述可可木霉Gull的代謝物可從可可木霉Gull的發(fā)酵液中獲得。所述可可木霉Gull的代謝物具體可按照如下方法制備，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)可可木霉Gull，除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的可可木霉Gull即得到所述可可木霉Gull的代謝物。上文中，所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑中除所述活性成分外，還含有載體。所述載體可為農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體。所述載體可為固體載體或液體載體；所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑中，所述可可木霉Gull可以分生孢子、厚垣孢子、菌絲或含有分生孢子和菌絲的菌絲體的形式存在。所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。根據(jù)需要，所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。本發(fā)明的制劑中的菌株Gull的分生孢子數(shù)量隨劑型和施用的方法而變化。固體制劑中，分生孢子的數(shù)量為(I X IO5)- (I X 108)cfu/克，如(I X IO6)- (I X IO7)個(gè)Cfu/克。對(duì)于液體制劑，稀釋后的噴灑液中分生孢子的含量通常為(2.0X IO4) - (5.0X IO7) cfu孢子/mL,如 107cfu/mL。所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑可以與其它適合的化學(xué)農(nóng)藥配合使用，從而降低化學(xué)農(nóng)藥劑的用量，減少對(duì)環(huán)境的污染。上述防治蔬菜疫病的方法中，所述蔬菜疫病可為辣椒疫病，所述蔬菜可為辣椒。上述防治蔬菜真菌病害的方法中，所述蔬菜可為黃瓜和/番茄。所述蔬菜灰霉病可為番茄灰霉病，所述蔬菜菌核病可為黃瓜菌核病，所述蔬菜黑星病可為黃瓜黑星病，所述蔬菜褐斑病可為黃瓜褐斑病。上述防治蔬菜枯萎病的方法中，`所述蔬菜枯萎病為黃瓜枯萎病，所述蔬菜為黃瓜。實(shí)驗(yàn)證明，可可木霉Gull菌劑(107cfu/mL)對(duì)褐斑病的防治效果是百菌清溶液的
0.463倍，對(duì)灰霉病的防治效果是百菌清溶液的0.931倍，對(duì)黑星病的防治效果是福星EC溶液0.752倍，對(duì)紋枯病的防治效果是井崗霉素溶液的0.568倍，對(duì)菌核病的防治效果是嘧霉胺懸浮劑溶液的0.831倍，對(duì)枯萎病的防治效果是甲基托布津溶液的0.581倍，對(duì)疫病的防治效果是烯酰嗎啉溶液的1.10倍。本發(fā)明的可可木霉Gull及其制劑對(duì)環(huán)境友好，可抑制病害病原的耐藥和抗藥性發(fā)展，有利于綠色食品和有機(jī)農(nóng)業(yè)的推廣，并且成本低、無污染、對(duì)蔬菜作物安全。在土壤中引進(jìn)拮抗微生物，通過生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善環(huán)境，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)平衡，為走可持續(xù)發(fā)展道路提供強(qiáng)勁的后盾。生物材料保藏說明分類命名:可可木霉(Trichodermatheobromicola)菌株編號(hào):Gull保藏機(jī)構(gòu):中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱:CGMCC地址:北京市朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所保藏日期:2012年12月17日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.6994下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例用于理解而不是限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。 下述實(shí)施例中所用的黑星病致病菌為瓜瘡痂枝孢霉菌(Cladosporiumcucumerinum),購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,保藏編號(hào)ACCC36060。下述實(shí)施例中所用的枯萎病致病菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)ACCC36468。下述實(shí)施例中所用的褐斑病致病菌為瓜棒孢霉(Corynespora cassiicola Wei),購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)ACCC36068。下述實(shí)施例中所用的疫病致病菌為辣椒疫霉(Phytophthora capsisi,購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)ACCC37401。下述實(shí)施例中所用的灰霉病致病菌為灰葡萄孢菌(Botrytis Cinerea),購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)ACCC36041。下述實(shí)施例中所用的菌核病致病菌為菌核核盤菌(Sclerotiniasclerotiorumm),購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,保藏編號(hào)ACCC30096。實(shí)施例1、可可木霉(Trichoderma theobromicola)GulI的獲得和保藏一、采樣

從北京、河北、新疆、山東、湖北等采集土樣。二、菌株分離采用涂布法分離菌株。每個(gè)土樣稱取10g，分別倒入加有少許吐溫80、玻璃珠以及IOOml蒸餾水無菌的500ml三角瓶中，搖勻,標(biāo)號(hào),用搖床搖30分鐘。然后用微量注射器吸5ml 土壤懸池液于加入到含45ml滅菌蒸餾水的250ml三角瓶中，搖勻，再?gòu)?50ml三角瓶中吸Iml加入到含9ml滅菌蒸餾水的試管中，進(jìn)行倍比稀釋，將樣品梯度稀釋到10_4和10_5的每個(gè)樣品吸0.1ml滴于PDA平板，涂布，28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，從中挑選出產(chǎn)綠色分生孢子的菌落，進(jìn)行斜面接種，待菌落長(zhǎng)出后，將轉(zhuǎn)接于PDA平板上分離、純化，直到獲得木霉純培養(yǎng)。置于冰箱4°C保存。三、菌株篩選1、平皿拮抗篩選在PDA平板中心接種木霉菌塊，在半徑2.5cm左右的圓周上，等距離接種3點(diǎn)等量不同病原菌，將每三種不同的病原菌作為一組，共有三組，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。用記號(hào)筆做好標(biāo)記菌株編號(hào)，以備觀察記錄。將接種好的培養(yǎng)皿放于28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d左右。隔日對(duì)所做的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行拍照，測(cè)量病原菌指向木霉的半徑R和r。記錄木霉與病原菌之間的形態(tài)特征。病菌與木霉交接后，觀察病原菌對(duì)木霉菌落的包圍、抑制、侵入和占領(lǐng)其營(yíng)養(yǎng)空間的過程。篩選木霉菌株，依據(jù)以下原則進(jìn)行:(I)生長(zhǎng)速度明顯高于病原菌的木霉，能夠與病原菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，從而顯著抑制病原菌的生長(zhǎng)；(2)與病原菌之間有0.2cm左右空隙，即產(chǎn)生了抑菌帶，說明木霉在代謝過程中產(chǎn)生了某種抗生物質(zhì)。結(jié)果見表I。
表1木霉菌株與9種病原菌之間平皿對(duì)峙記錄
權(quán)利要求
1.可可木霉(Trichodermatheobromicola),其特征在于:所述可可木霉(Trichoderma theobromicola)的菌株號(hào)為Gull,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC N0.6994。
2.權(quán)利要求1所述可可木霉在防治植物病害中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的可可木霉和/或所述可可木霉的代謝物在制備植物病原菌抑制劑或植物病害抑制劑中的應(yīng)用。
4.植物病原菌抑制劑或植物病害抑制劑，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的可可木霉和/或所述可可木霉的代謝物。
5.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用或權(quán)利要求4所述的抑制劑，其特征在于:所述植物病害為真菌病害。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用或抑制劑，其特征在于:所述真菌病害為植物疫病、植物灰霉病、植物菌核病、植物黑星病、植物枯萎病和植物褐斑病中的至少一種；或，所述植物病原菌為植物疫病致病菌、植物灰霉病致病菌、植物菌核病致病菌、植物黑星病致病菌、植物枯萎病致病菌和植物褐斑病致病菌中的至少一種。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或抑制劑，其特征在于:所述植物疫病由辣椒疫霉引起，所述植物灰霉病由灰葡萄孢菌引起，所述植物菌核病由菌核核盤菌引起，所述植物黑星病由瓜瘡痂枝孢霉菌引起，所述植物枯萎病由尖孢鐮刀菌引起，所述植物褐斑病由瓜棒孢霉引起；或，所述植物疫病致病菌為辣椒疫霉，所述植物灰霉病致病菌為灰葡萄孢菌，所述植物菌核病致病菌為菌核核盤菌，所述植物黑星病致病菌為瓜瘡痂枝孢霉菌，所述植物枯萎病致病菌為尖孢鐮刀菌，所述植物褐斑病致病菌為瓜棒孢霉。
8.防治蔬菜疫病的方法，包括用可可木霉菌懸浮液噴施蔬菜植株的步驟；所述可可木霉菌懸浮液是用水懸浮權(quán)利要求1所述的可可木霉得到的液體，所述可可木霉菌懸浮液中權(quán)利要求1所述的可可木霉 的含量為(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml。
9.防治蔬菜真菌病害的方法，包括用可可木霉菌懸浮液噴施蔬菜植株的步驟；所述可可木霉菌懸浮液是用水懸浮權(quán)利要求1所述的可可木霉得到的液體，所述可可木霉菌懸浮液中權(quán)利要求1所述的可可木霉的含量為(2.0X IO4) - (5.0X IO7) cfu/ml ；所述蔬菜真菌病害為蔬菜灰霉病、蔬菜菌核病、蔬菜黑星病和蔬菜褐斑病中至少一種。
10.防治蔬菜枯萎病的方法，包括用可可木霉菌懸浮液浸泡蔬菜胚根的步驟；所述可可木霉菌懸浮液是用水懸浮權(quán)利要求1所述的可可木霉得到的液體，所述可可木霉菌懸浮液中權(quán)利要求1所述的可可木霉的含量為(2.0XlO4)- (5.0XlO7) cfu/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的應(yīng)用。本發(fā)明的可可木霉(Trichoderma theobromicola)的菌株號(hào)為Gu11，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.6994。本發(fā)明的可可木霉Gu11及其制劑對(duì)環(huán)境友好，可抑制病害病原的耐藥和抗藥性發(fā)展，有利于綠色食品和有機(jī)農(nóng)業(yè)的推廣，并且成本低、無污染、對(duì)蔬菜作物安全。在土壤中引進(jìn)拮抗微生物，通過生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善環(huán)境，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)平衡，為走可持續(xù)發(fā)展道路提供強(qiáng)勁的后盾。
文檔編號(hào)C12R1/885GK103074237SQ201310023319
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者顧金剛, 李世貴, 劉好寶, 阮志勇, 張曉霞, 馬曉彤, 張瑞潁 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所