一種分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法，在白鶴芋(白掌)雜交育種的過(guò)程中引入了分子標(biāo)記，且此分子標(biāo)記所標(biāo)記的為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇，特別是與色澤表型密切相關(guān)的基因或基因簇；此方法不僅僅是傳統(tǒng)雜交育種與分子標(biāo)記技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，還在整合了組培苗生產(chǎn)過(guò)程，因而不僅僅可以解決白鶴芋(白掌)雜交育種的選育周期長(zhǎng)，工作量大，有較大程度隨機(jī)性，不易選育出性狀優(yōu)良穩(wěn)定的新品種的技術(shù)問(wèn)題，使白鶴芋(白掌)育種具有定向性，大大提高了育種的方向性與效率，同時(shí)所選育出的白鶴芋(白掌)品種，能適用于規(guī)?；M織培養(yǎng)育苗。
【專利說(shuō)明】—種分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種白鶴芋(白掌)選育方法，特別是利用分子標(biāo)記進(jìn)行白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀定向選育，屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]白鶴芋(白掌)原產(chǎn)于南美熱帶雨林，現(xiàn)為歐洲和中東各國(guó)最流行的室內(nèi)觀葉植物之一，在世界各地均有栽培。白掌株高40~60厘米，具短根莖，多為叢生狀。葉長(zhǎng)圓形或近披針形，兩端漸尖，基部楔形?；榉鸢?，微香，呈葉狀，即花并無(wú)花瓣，只是由一塊白色的苞片和一條黃白色的肉穗所組成，酷似手掌，故名白掌；花大而顯著，花梗長(zhǎng)而高出葉面，白色或綠色；花期5~8月；性喜溫暖濕潤(rùn)、半陰的環(huán)境，忌強(qiáng)烈陽(yáng)光直射；不耐寒，生長(zhǎng)適溫為20~28°C，越冬溫度為10°C以上。
[0003]白鶴芋(白掌)自人工栽培以來(lái)，不斷被培育篩選出新品種，目前全世界有近30種。我國(guó)沒(méi)有成功開發(fā)白鶴芋(白掌)新品種的報(bào)道，多為引進(jìn)栽培，國(guó)內(nèi)主要的引種載培的白鶴芋(白掌)品種有5種，即綠巨人、香水白掌、神燈白掌、大葉白掌、夢(mèng)娜羅亞白掌。目前，我國(guó)對(duì)白鶴芋(白掌)人工載培的研究主要集中于利用白鶴芋(白掌)不同部位(如根的不同部位、頂芽、側(cè)芽、肉穗花序、莖尖等)作為外植體，優(yōu)化其組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)等方面，其目的為增加白掌組培的繁殖系數(shù)，研究層次僅僅局限于增加白掌組培苗生產(chǎn)數(shù)量的水平。近年也有一些學(xué)者注要到了在白鶴芋(白掌)組培苗生產(chǎn)過(guò)程中，因片面追求高增殖系數(shù)而過(guò)度使用植物激素而帶來(lái)白掌組培苗質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題，比如葉片變尖或條形，團(tuán)塊上葉片，葉柄卷曲，甚至黃化等葉片形狀表型變異問(wèn)題，提出了從溫度和培養(yǎng)基兩方面著手，探索其恢復(fù)技術(shù)，但此是一種治標(biāo)不治本的方法。白鶴芋(白掌)組培苗植株外觀表型的變異，其深層原因必然是涉及了遺傳物質(zhì)的改變或基因調(diào)控上發(fā)生了變化。要徹底解決白鶴芋(白掌)組培苗的質(zhì)量問(wèn)題，必須從育種源頭，培育篩選出優(yōu)良性狀穩(wěn)定、耐激素刺激、適用于工廠化白鶴芋(白掌)組培苗生產(chǎn)的優(yōu)良原種，并結(jié)合具體的白鶴芋(白掌)組培苗生產(chǎn)過(guò)程，研究開發(fā)出一整套技術(shù)可控的生產(chǎn)流程，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)才有可能。
[0004]白鶴芋(白掌)作為一種觀花室內(nèi)裝飾植物，其最終成品植株的花苞色澤是影響其成品價(jià)值的最要因素之一，問(wèn)題是，白掌的花苞色澤表型只有成品植株時(shí)才可見(jiàn)，在組培苗工廠化生產(chǎn)過(guò)程中只能借助植株外觀有無(wú)異常等直觀經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行淘選。白掌的花苞色澤表型，尤其是優(yōu)質(zhì)色澤白玉色系表型，和白掌的基因及基因調(diào)控過(guò)程是有關(guān)聯(lián)的，這種關(guān)聯(lián)可以在選種育種階段和組培苗生產(chǎn)的過(guò)程中進(jìn)行定性定量評(píng)估監(jiān)控。
[0005]花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類合物，是植物花瓣中的主要呈色物質(zhì)?；ㄇ嗨仄浠窘Y(jié)構(gòu)母核是2-苯基苯并吡喃，大多數(shù)花素在花色基元的3_，5_，7-碳位上有取代羥基，由于A環(huán)和B環(huán)各碳位上的取代基不同(羥基或甲氧基)，成了各種各樣的花青素。植物花青素生物合成途徑已被研究得較為清楚(詳見(jiàn)說(shuō)明書附圖圖1):苯丙氨酸是花青素及其他類黃酮生物合成的直接前體，由苯丙氨酸到花青素經(jīng)歷3個(gè)階段，第一階段由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA，這是許多次生代謝共有的，該步驟受苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因活性調(diào)控。第二階段由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫黃酮醇，是類黃酮代謝的關(guān)鍵反應(yīng)，該階段產(chǎn)生的黃烷酮和二氫黃酮醇在不同酶作用下，可轉(zhuǎn)化為花青素和其他類黃酮物質(zhì)。第三階段是各種花青素的合成，至少有3個(gè)酶:二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)和類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)能夠?qū)o(wú)色的二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化成有色的花色素。其中DFR催化二氫黃酮醇進(jìn)一步還原成無(wú)色花色素，再經(jīng)過(guò)氧化、脫水和糖基化，不同的無(wú)色花色素變成有色的花色素苷。這些花色素苷還可進(jìn)一步糖基化、甲基化和酰基化形成不同的產(chǎn)物。
[0006]同時(shí)，植物花青素的時(shí)空合成機(jī)制已有深入的研究。已有的研究表明(詳見(jiàn)說(shuō)明書附圖圖2)，不同植物中的花青素生物合成受2類基因的共同控制，一類是結(jié)構(gòu)基因，其編碼生物合成途徑中所需的酶；另一類是調(diào)芐基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)。目前已分離和鑒定了 3類花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子:(1)R2R3-MYB蛋白；(2)myc家族的bHLH蛋白；(3)WD40蛋白。玉米、矮牽牛、金魚草、紫蘇、擬南芥等多種植物的花青素合成的調(diào)控基因已被鑒定，其調(diào)控機(jī)制也被基本闡明。[0007]白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇研究罕見(jiàn)有報(bào)道。按植物通用的基因功能推測(cè)，其中與白鶴芋(白掌)色澤表型密切相關(guān)的基因或基因簇，應(yīng)包括花青素合成途徑的關(guān)鍵酶基因及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因。如花青素合成途徑中關(guān)鍵酶基因:苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮
3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因等；花青素合成途徑中的重要調(diào)控因子基因，如R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因及WD40蛋白基因等。白鶴芋(白掌)色澤表型，是這些關(guān)鍵酶基因及調(diào)控因子綜合作用的結(jié)果。換句話說(shuō)，這些關(guān)鍵酶基因及調(diào)控因子在時(shí)空中的表達(dá)量與活性的差異，是白鶴芋(白掌)色澤差異的內(nèi)在因素。具有優(yōu)良色澤表型且適用于作為原種進(jìn)行規(guī)模化組織培養(yǎng)育苗的白鶴芋(白掌)品種，花青素合成途徑中關(guān)鍵酶基因及調(diào)控因子的基因量與表達(dá)活性應(yīng)該具有合適的比例，且能消除組培育苗過(guò)程中及其后生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中激素刺激及營(yíng)養(yǎng)條件、栽培條件差異等因素帶來(lái)的波動(dòng)影響，其基因量與表達(dá)活性及互相之間的比例具有高度穩(wěn)定性，從而能最終保持色澤表型的高度穩(wěn)定。
[0008]目前白鶴芋(白掌)新品種選育方法主要為雜交育種后通過(guò)人工栽培雜交子代選育，其選育周期長(zhǎng)，至少要三至五年的時(shí)間，工作量大，有較大程度隨機(jī)性，不易選育出性狀優(yōu)良穩(wěn)定的新品種。
[0009]分子標(biāo)記與分子標(biāo)記定向育種，由于其定向選擇性，可以大大提高育種效率。分子標(biāo)記育種的核心技術(shù)是DNA分子標(biāo)記技術(shù)，其主要有兩大類:一類是基于Southern雜交的分子標(biāo)記，另一類是基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記。高密度的分子標(biāo)記技術(shù)可以用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，所構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜可為基因定位、物理圖譜構(gòu)建和以圖譜為基礎(chǔ)的目的基因克隆奠定基礎(chǔ)，是種質(zhì)資源、育種及分子克隆等許多應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。同時(shí)，分子標(biāo)記也是數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位、關(guān)聯(lián)遺傳、突變體及其特征、相關(guān)近緣物種基因組研究等遺傳育種學(xué)研究的重要技術(shù)手段。
[0010]由于白鶴芋(白掌)的基因組學(xué)及其優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因族研究很少，特別是與莖高、葉形、花色等影響觀賞性的性狀關(guān)聯(lián)基因研究基本沒(méi)有見(jiàn)諸報(bào)道，在此，借鑒其它觀賞植物基因組學(xué)的研究成果，提出了在白鶴芋(白掌)雜交育種的過(guò)程中，應(yīng)用PCR分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的保守區(qū)域，或是包含有與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的活性關(guān)鍵位點(diǎn)的區(qū)域的技術(shù)方法，從而實(shí)現(xiàn)白鶴芋(白掌)優(yōu)良品種的定向選育。
[0011]特別要說(shuō)明的是，在此提出的白鶴芋(白掌)育種方法中，不僅僅是傳統(tǒng)雜交育種與分子標(biāo)記技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，還在整合了組培苗生產(chǎn)過(guò)程，因而不僅僅可以解決白鶴芋(白掌)雜交育種的選育周期長(zhǎng)，工作量大，有較大程度隨機(jī)性，不易選育出性狀優(yōu)良穩(wěn)定的新品種的技術(shù)問(wèn)題，使白鶴芋(白掌)育種具有定向性，大大提聞了育種的方向性與效率，同時(shí)所選育出的白鶴芋(白掌)品種，能適用于規(guī)?；M織培養(yǎng)育苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]基于上述技術(shù)背景與理論，本發(fā)明提出了一種分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法，其特征在于:在白鶴芋(白掌)雜交育種的過(guò)程中引入了分子標(biāo)記，且此分子標(biāo)記所標(biāo)記的為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇，特別是與色澤表型密切相關(guān)的基因或基因族；此等所被標(biāo)記的基因或基因族包括但不限于花青素合成途徑的關(guān)鍵酶基因，如苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因；此等所被標(biāo)記的基因或基因簇包括但不限于花青素合成途徑中的3個(gè)調(diào)控因子基因，如R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因及WD40蛋白基因。
[0013]本發(fā)明的分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法包括如下程序:
[0014](I)分子標(biāo)記的選擇及檢測(cè):所選擇的分子標(biāo)記為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的保守區(qū)域，或是包含有與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的活性關(guān)鍵位點(diǎn)的 區(qū)域，并依據(jù)上述區(qū)域分別設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)；
[0015](2)親本選擇:選擇能檢測(cè)到目標(biāo)分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)作為親本；
[0016](3)雜交:將選擇的親本通過(guò)人工授粉方式進(jìn)行雜交，收集雜交所得到的種子播種萌發(fā)后得雜交后子代；
[0017](4)雜交子代分子標(biāo)記檢測(cè)與子代優(yōu)選:抽提雜交子代不同生長(zhǎng)發(fā)育階段其葉片組織中的總DNA及總RNA，以此為模板，用所設(shè)計(jì)的PCR引物，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，考察子代中所標(biāo)記的基因或基因簇的量與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄量的穩(wěn)定性，以此為依據(jù)，優(yōu)選出雜交子代；
[0018](5)優(yōu)選子代組織培養(yǎng)擴(kuò)繁:將優(yōu)選出的雜交子代通過(guò)組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁，得到優(yōu)選子代的組培苗；
[0019](6)優(yōu)選子代組培苗培育與淘選:將優(yōu)選子代組培苗進(jìn)行壯苗培育，培育過(guò)程中分階段檢測(cè)所標(biāo)記的基因或基因簇的量與轉(zhuǎn)錄量，考察其穩(wěn)定性，淘汰穩(wěn)定性量較差的子代，得到適合用于通過(guò)組織培養(yǎng)方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁育苗的雜交子代；
[0020](7)選育子代的新品種性狀驗(yàn)證:對(duì)(6)中所得到的優(yōu)選雜交子代及其無(wú)性擴(kuò)繁得到的組培苗進(jìn)行新品種性狀驗(yàn)證試驗(yàn)，選取能通過(guò)新品種驗(yàn)證試驗(yàn)的選育子代，得到白鶴芋(白掌)新品種。
[0021]所用分子標(biāo)記為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的任意組合(如單個(gè)基因、兩兩組合、三三組合等)；所用分子標(biāo)記分別為所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
[0022]在選育優(yōu)良穩(wěn)定色澤表型的白鶴芋(白掌)方面，所用分子標(biāo)記為花青素合成途徑中的4個(gè)已經(jīng)研究得較為清楚的關(guān)鍵酶基因(苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇
4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因)與花青素合成途徑中的3個(gè)調(diào)控因子基因(R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因、WD40蛋白基因)共7個(gè)基因中的任意組合(如單個(gè)基因、兩兩組合、三三組合等)；所用分子標(biāo)記分別為所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
[0023]如:所標(biāo)記為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因等2個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
[0024]如:所標(biāo)記為二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因等3個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
[0025]如:所用分子標(biāo)記為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因等4個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
[0026]如:所用分子標(biāo)記為R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因等3個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
[0027]依據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
中提出的技術(shù)方案，可以解決白鶴芋(白掌)雜交育種的選育周期長(zhǎng)，工作量大，有較大程度隨機(jī)性，不易選育出性狀優(yōu)良穩(wěn)定的新品種的技術(shù)問(wèn)題，使白鶴芋(白掌)育種具有定向性，大大提高了育種的方向性與效率，同時(shí)所選育出的白鶴芋(白掌)品種，能適用于規(guī)?；M織培養(yǎng)育苗。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1花青素生物合成途徑(引自郭鳳丹，王效忠，劉學(xué)英等.植物花青素生物代謝調(diào)控.[J].生命科學(xué).2011，V23(10):939)，技術(shù)背境中提及，此圖說(shuō)明了當(dāng)前最新研究進(jìn)展中花青素生物合成途徑中關(guān)鍵酶的種類及其作用。
[0029] 圖2花青素生物合成途徑調(diào)控模型(引自張寧，胡宗利，陳緒清等.植物花青素代謝途徑分析及調(diào)控模型建立.[J].中國(guó)生物工程雜志.2008，28 (I):101)，技術(shù)背境中提及，此圖說(shuō)明了當(dāng)前最新研究進(jìn)展中花青素生物合成途徑中調(diào)控因子的種類及其作用?！揪唧w實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1:分子標(biāo)記苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因進(jìn)行白鶴芋(白掌)優(yōu)良色澤體系品種的定向選育
[0031](I)分子標(biāo)記的選擇及檢測(cè):選擇與白鶴芋(白掌)花苞色澤性狀密切相關(guān)的花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因的保守區(qū)域作為分子標(biāo)記，并依據(jù)上述區(qū)域分別設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。[0032]依據(jù)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因保守區(qū)域生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)的一對(duì)PCR檢測(cè)引物(5，-TGTCGACCAGCGTCAACGG-3’、5’ -TACTCTTCGTCGTCGTCGCTGA-3’)，預(yù)期所擴(kuò)增的區(qū)域長(zhǎng)度約為Ikb左右。
[0033]依據(jù)二氫黃酮醇4 一還原酶(DFR)基因保守區(qū)域生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)的一對(duì) PCR 簡(jiǎn)并檢測(cè)引物(5，-GGNTTCATCGGNTCDTGGCT-3’、5’ -AARTACATCCADCCDGTCAT-3’ )，預(yù)期所擴(kuò)增的區(qū)域長(zhǎng)度約為430bp左右。
[0034]以白鶴芋(白掌)葉片總DNA抽提物為模板的分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法為:
[0035]①檢測(cè)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因
[0036]PCR體系體積為 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一對(duì)PAL 基因 PCR檢測(cè)引物各2 μ L，白鶴芋(白掌)葉片總DNA I μ L，Taq酶0.2 μ L，滅菌蒸餾水15.3 μ L。PCR程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 50s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0037]②檢測(cè)二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因
[0038]PCR體系體積為 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一對(duì)DFR基因 PCR檢測(cè)引物各2 μ L，白鶴芋(白掌)葉片總DNA I μ L，Taq酶0.2 μ L，滅菌蒸餾水15.3 μ L。PCR程序?yàn)?94°C 3min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 50s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0039]以白鶴芋(白掌)葉片總RNA抽提物為模板的分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法為:
[0040]①檢測(cè)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因
[0041 ] 一步法 RT-PCR 體系體積為 50 μ L: 10 X One Step RT-PCR Buffer (含有 dNTP、鎂離子等)5μ L，一對(duì) PAL 基因 PCR檢測(cè)引物(10ymol/L)各 2μ L，AMV RT 0.5 μ L, RNaseinhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5μL,白鶴芋(白掌)葉片總 RNA IuL, RNasefree ddH20 38.5 μ L。RT-PCR程序?yàn)?45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 50s,30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0042]②檢測(cè)二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因
[0043]一步法 RT-PCR 體系體積為 50 μ L: 10 X One Step RT-PCR Buffer (含有 dNTP、鎂離子等)5μ L，一對(duì) DFR基因 PCR檢測(cè)引物(10ymol/L)各 2μ L，AMV RT 0.5 μ L, RNaseinhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5μL,白鶴芋(白掌)葉片總 RNA IuL, RNasefree ddH20 38.5 μ L。RT-PCR程序?yàn)?45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 50s,30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0044](2)親本選擇:選擇能檢測(cè)到目標(biāo)分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)作為親本。用(I)中所建立的分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法，對(duì)擬做雜交育種的多株母本探戈白掌(Spathiphyllum iTango')和父本碧綠白掌(Spathiphyllum iPicolino')分別進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，選擇苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因的量與表達(dá)量均穩(wěn)定(PAL與DFR基因量約1:1，PAL與DFR的表達(dá)量比例約為1: 2)的植株作為親本。
[0045](3)雜交:將選擇的母本探戈白掌(Spathiphyllum iTango1 )和父本碧綠白掌(Spathiphyllum iPicolino;)通過(guò)人工授粉方式進(jìn)行雜交,收集雜交所得到的種子播種萌發(fā)后得雜交后子代。
[0046](4)雜交子代分子標(biāo)記檢測(cè)與子代優(yōu)選:抽提雜交子代不同生長(zhǎng)發(fā)育階段其葉片組織中的總DNA及總RNA，以此為模板，用所設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)引物，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，考察子代中丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因的量與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄量的穩(wěn)定性(PAL與DFR基因量約1:1 ;PAL與DFR的表達(dá)量比例約為1: 2)，優(yōu)選出雜交子代。
[0047](5)優(yōu)選子代組織培養(yǎng)擴(kuò)繁:將優(yōu)選出的雜交子代通過(guò)組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁，得到優(yōu)選子代的組培苗。
[0048](6)優(yōu)選子代組培苗培育與淘選:將優(yōu)選子代組培苗進(jìn)行壯苗培育，培育過(guò)程中分階段檢測(cè)所標(biāo)記的丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因的量與轉(zhuǎn)錄量，考察其穩(wěn)定性(PAL與DFR基因量約1:1 ;PAL與DFR的表達(dá)量比例約為1: 2)，淘汰穩(wěn)定性量較差的子代，得到適合用于通過(guò)組織培養(yǎng)方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁育苗的雜交子代。
[0049](7)選育子代的新品種性狀驗(yàn)證:對(duì)(6)中所得到的優(yōu)選雜交子代及其無(wú)性擴(kuò)繁得到的組培苗進(jìn)行 新品種性狀驗(yàn)證試驗(yàn)，選取能通過(guò)新品種驗(yàn)證試驗(yàn)的選育子代，得到白鶴芋(白掌)新品種。
[0050]實(shí)施例2:分子標(biāo)記R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因進(jìn)行白鶴芋(白掌)優(yōu)良色澤體系品種的定向選育
[0051](I)分子標(biāo)記的選擇及檢測(cè):選擇與白鶴芋(白掌)花苞色澤性狀密切相關(guān)的花青素生物合成途徑中的3個(gè)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子——R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的保守區(qū)域作為分子標(biāo)記，并依據(jù)上述區(qū)域分別設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0052]依據(jù)R2R3-MYB蛋白基因保守區(qū)域生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)的一對(duì)PCR檢測(cè)引物(5，-CAGGTGGCTAGTCATGCTCA-3’、5’ -AGATTCGGATTGTGGTGGAG-3’)，預(yù)期所擴(kuò)增的區(qū)域長(zhǎng)度約為1.1kb左右。
[0053]依據(jù)myc家族的bHLH蛋白基因保守區(qū)域生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)的一對(duì)PCR檢測(cè)引物(5，-GACAAGAAGGTGAAAGGC-3’、5’ -TATCACAGCCTGGGACCAG-3’)，預(yù)期所擴(kuò)增的區(qū)域長(zhǎng)度約為500bp左右。
[0054]依據(jù)WD40蛋白基因保守區(qū)域生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)的一對(duì)PCR檢測(cè)引物(5，-TGAATAYTGTGCTCCTTTGAC-3’、5’ -CCAAGCAATAGCATTCA-3’)，預(yù)期所擴(kuò)增的區(qū)域長(zhǎng)度約為430bp左右。
[0055]以白鶴芋(白掌)葉片總DNA抽提物為模板的上述分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法為:
[0056]①檢測(cè)R2R3-MYB蛋白基因
[0057]PCR 體系體積為 25 μ L: 10 X PCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L, 一對(duì) R2R3-MYB 蛋白基因PCR檢測(cè)引物各2 μ L，白鶴芋(白掌)葉片總DNA IyL, Taq酶0.2 μ L，滅菌蒸餾水15.3 μ L。PCR 程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 70s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0058]②檢測(cè)myc家族的bHLH蛋白基因
[0059]PCR體系體積為 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一對(duì)myc家族的bHLH蛋白基因PCR檢測(cè)引物各2 μ L，白鶴芋(白掌)葉片總DNA I μ L，Taq酶0.2 μ L，滅菌蒸餾水 15.3 μ L。PCR 程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 50s, 32 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0060]③檢測(cè)WD40蛋白基因
[0061]PCR 體系體積為 25μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一對(duì) WD40 蛋白基因PCR檢測(cè)引物各2 μ L，白鶴芋(白掌)葉片總DNA IyL, Taq酶0.2 μ L，滅菌蒸餾水
15.3 μ L。PCR 程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 50s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0062]以白鶴芋(白掌)葉片總RNA抽提物為模板的分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法為:
[0063]①檢測(cè)R2R3-MYB蛋白基因
[0064]一步法RT-PCR體系體積為 50μ L:10X0ne Step RT-PCR Buffer (含有dNTP、鎂離子等)5μ L，一對(duì) R2R3-MYB 蛋白基因 PCR檢測(cè)引物(10ymol/L)各 2 μ L，AMV RT 0.5 μ L,RNase inhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5 μ L,白鶴芋(白掌)葉片總 RNA I μ L，RNase free ddH20 38.5 μ L0 RT-PCR 程序?yàn)?45°C 20min ;94°C 5min ;94°C 30s，62°C 30s，72°C 50s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0065]②檢測(cè)myc家族的bHLH蛋白基因
[0066]一步法 RT-PCR 體系體積為 50 μ L: 10 X One Step RT-PCR Buffer (含有 dNTP、鎂離子等)5 μ L，一對(duì)myc家族的bHLH蛋白基因PCR檢測(cè)引物(ΙΟμ mol/L)各2 μ L，AMV RT
0.5 μ L, RNase inhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5 μ L,白鶴芋(白掌)葉片總RNA I μ L, RNase free ddH20 38.5 μ L。RT-PCR 程序?yàn)?45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s,56°C 30s, 72°C 50s，32 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0067]③檢測(cè)WD40蛋白基因
[0068]一步法RT-PCR體系體積為 50μ L:10X0ne Step RT-PCR Buffer (含有dNTP、鎂離子等)5yL，一對(duì) WD40 蛋白基因 PCR 檢測(cè)引物(lOymol/L)各 2yL，AMV RT 0.5 μ LjRNaseinhibitor0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5 μ L,白鶴芋(白掌)葉片總 RNA I μ L, RNasefree ddH20 38.5 μ L。RT-PCR程序?yàn)?45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 50s,30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0069](2)親本選擇:選擇能檢測(cè)到目標(biāo)分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)作為親本。用(I)中所建立的分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法，對(duì)擬做雜交育種的多株母本探戈白掌(Spathiphyllum ‘Tango,)和父本碧綠白掌(Spathiphyllum iPicolino')分別進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，選擇R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的量與表達(dá)量均穩(wěn)定(R2R3-MYB、bHLH與WD40基因量約1:1:1 ;R2R3_MYB、bHLH與WD40的表達(dá)量比例約為1:1:1)的植 株作為親本。
[0070](3)雜交:將選擇的母本探戈白掌(Spathiphyllum ‘Tango')和父本碧綠白掌(Spathiphyllum iPicolino;)通過(guò)人工授粉方式進(jìn)行雜交,收集雜交所得到的種子播種萌發(fā)后得雜交后子代。
[0071](4)雜交子代分子標(biāo)記檢測(cè)與子代優(yōu)選:抽提雜交子代不同生長(zhǎng)發(fā)育階段其葉片組織中的總DNA及總RNA，以此為模板，用所設(shè)計(jì)的PCR引物，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，考察子代中R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的量與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄量的穩(wěn)定性(R2R3-MYB、bHLH與WD40基因量約1:1:1;R2R3-MYB、bHLH與WD40的表達(dá)量比例約為1:1:1)，優(yōu)選出雜交子代。
[0072](5)優(yōu)選子代組織培養(yǎng)擴(kuò)繁:將優(yōu)選出的雜交子代通過(guò)組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁，得到優(yōu)選子代的組培苗。
[0073](6)優(yōu)選子代組培苗培育與淘選:將優(yōu)選子代組培苗進(jìn)行壯苗培育，培育過(guò)程中分階段檢測(cè)所標(biāo)記的R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的量與轉(zhuǎn)錄量，考察其穩(wěn)定性(R2R3-MYB、bHLH與WD40基因量約1:1:1 ;R2R3_MYB、bHLH與WD40的表達(dá)量比例約為1:1:1)，淘汰穩(wěn)定性量較差的子代，得到適合用于通過(guò)組織培養(yǎng)方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁育苗的雜交子代。
[0074](7)選育子代的新品種性狀驗(yàn)證:對(duì)(6)中所得到的優(yōu)選雜交子代及其無(wú)性擴(kuò)繁得到的組培苗 進(jìn)行新品種性狀驗(yàn)證試驗(yàn)，選取能通過(guò)新品種驗(yàn)證試驗(yàn)的選育子代，得到白鶴芋(白掌)新品種。
【權(quán)利要求】
1.一種分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法，其特征在于:在白鶴芋(白掌)雜交育種的過(guò)程中引入了分子標(biāo)記，且此分子標(biāo)記所標(biāo)記的為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇，特別是與色澤表型密切相關(guān)的基因或基因簇；此等所被標(biāo)記的基因或基因簇包括但不限于花青素合成途徑的關(guān)鍵酶基因，如苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因；此等所被標(biāo)記的基因或基因簇包括但不限于花青素合成途徑中的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，如R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因及WD40蛋白基因。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的選育方法，其特征在于分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)定向選育方法包括如下程序: (1)分子標(biāo)記的選擇及檢測(cè):所選擇的分子標(biāo)記為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的保守區(qū)域，或是包含有與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的活性關(guān)鍵位點(diǎn)的區(qū)域，并依據(jù)上述區(qū)域分別設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)； (2)親本選擇:選擇能檢測(cè)到目標(biāo)分子標(biāo)記的白鶴芋(白掌)作為親本； (3)雜交:將選擇的親本通過(guò)人工授粉方式進(jìn)行雜交,收集雜交所得到的種子播種萌發(fā)后得雜交后子代； (4)雜交子代分子標(biāo)記檢測(cè)與子代優(yōu)選:抽提雜交子代不同生長(zhǎng)發(fā)育階段其葉片組織中的總DNA及總RNA，以此為模板，用所設(shè)計(jì)的PCR引物，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，考察子代中所標(biāo)記的基因或基因簇的量與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄量的穩(wěn)定性，以此為依據(jù)，優(yōu)選出雜交子代； (5)優(yōu)選子代組織培養(yǎng)擴(kuò)繁:將優(yōu)選出的雜交子代通過(guò)組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁，得到優(yōu)選子代的組培苗； (6)優(yōu)選子代組培苗培育與淘選:將優(yōu)選子代組培苗進(jìn)行壯苗培育，培育過(guò)程中分階段檢測(cè)所標(biāo)記的基因或基因簇的量與轉(zhuǎn)錄量，考察其穩(wěn)定性，淘汰穩(wěn)定性量較差的子代，得到適合用于通過(guò)組織培養(yǎng)方式進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁育苗的雜交子代； (7)選育子代的新品種性狀驗(yàn)證:對(duì)(6)中所得到的優(yōu)選雜交子代及其無(wú)性擴(kuò)繁得到的組培苗進(jìn)行新品種性狀驗(yàn)證試驗(yàn)，選取能通過(guò)新品種驗(yàn)證試驗(yàn)的選育子代，得到白鶴芋(白掌)新品種。
3.根據(jù)權(quán)利I與權(quán)利2所述的選育方法，其特征在于:所用分子標(biāo)記為與白鶴芋(白掌)優(yōu)良性狀相關(guān)的基因或基因簇的任意組合(如單個(gè)基因、兩兩組合、三三組合等)；所用分子標(biāo)記分別為所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
4.根據(jù)權(quán)利I與權(quán)利2所述的選育方法，其特征在于:所用分子標(biāo)記為花青素合成途徑中的4個(gè)關(guān)鍵酶基因(苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因)與花青素合成途徑中的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因(R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因、WD40蛋白基因)共7個(gè)基因中的任意組合(如單個(gè)基因、兩兩組合、三三組合等)；所用分子標(biāo)記分別為所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)所選定標(biāo)記基因組合中各個(gè)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
5.根據(jù)權(quán)利I與權(quán)利2所述的選育方法，其特征在于:所標(biāo)記為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因等2個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
6.根據(jù)權(quán)利I與權(quán)利2所述的選育方法，其特征在于:所標(biāo)記為二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因等3個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
7.根據(jù)權(quán)利I與權(quán)利2所述的選育方法，其特征在于:所用分子標(biāo)記為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因等4個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
8.根據(jù)權(quán)利I與權(quán)利2所述的選育方法，其特征在于:所用分子標(biāo)記為R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因等3個(gè)基因組合；所用分子標(biāo)記分別為R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的保守區(qū)域；所用的分子標(biāo)記檢測(cè)PCR引物分別依據(jù)R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因與WD40蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103923970SQ201310011032
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】蔣雄輝, 詹啟成, 周英彪, 王奎 申請(qǐng)人:佛山市三水陽(yáng)特園藝有限公司