具有多個(gè)靶區(qū)域特異性和具有分為三部分特征的探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了用于檢測靶核苷酸序列中多態(tài)性的探針和方法，所述多態(tài)性包括短串聯(lián)重復(fù)序列。所述探針包括由接頭序列分開的第一和第二區(qū)域，所述第一和第二區(qū)域具有分離的與其各自靶序列的解鏈溫度。在第一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二區(qū)域都是報(bào)告子序列；在第二個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)區(qū)域是錨定序列，而另一個(gè)是報(bào)告子序列。
【專利說明】具有多個(gè)靶區(qū)域特異性和具有分為三部分特征的探針
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及檢測靶核酸序列的核酸探針，和更特別地涉及從基因組的或擴(kuò)增的DNA檢測變體核酸序列的探針。本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及檢測變體核酸序列的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]核酸探針經(jīng)常用于鑒別基因組的或擴(kuò)增的DNA中特定靶序列的存在。探針對靶的退火或解鏈溫度受探針和靶共有的互補(bǔ)區(qū)域的長度和另外的互補(bǔ)堿基對之間的任何錯(cuò)配的存在影響。這可以用于檢測變體，例如SNP或多重復(fù)的存在。探針可以設(shè)計(jì)為具有對野生型序列的第一解鏈溫度(Tm)，并監(jiān)測探針對靶的退火(例如通過在退火時(shí)形成熒光)。如果Tm不同于預(yù)期值，那么靶序列包括變體。
[0004]然而，用較長的探針區(qū)域?qū)嵤┰撨^程可能是困難的。尤其，長探針可能不提供野生型和變體序列之間Tm方面的足夠變化。
[0005]本發(fā)明意在解決常規(guī)探針具有的這些和其它缺點(diǎn)。
[0006]US2007/0065847描述了一組用普通序列標(biāo)記的核苷酸探針用作標(biāo)簽。所述探針用于探測化合物文庫。
[0007]W02011/027966描述了具有第一和第二區(qū)域的探針，所述第一區(qū)域包括報(bào)告子分子并且所述第二區(qū)域包括猝滅子分子。當(dāng)探針雜交于靶時(shí)，核酸外切酶可以從猝滅子切割報(bào)告子，導(dǎo)致信號檢 測。當(dāng)存在錯(cuò)配以致報(bào)告子部分未被雜交時(shí)，所述報(bào)告子不被切割，并且不存在信號檢測。
[0008]W02007/058499描述了用于呼吸道病毒的探針，所述探針具有由分離部分分開的第一和第二雜交部分。
[0009]US2007/0259347描述了用于篩選陣列的探針，所述探針具有由接頭分開的兩部分，其中選擇接頭部分以最小化與雜交相關(guān)的同源性噪聲(homology noise)。
[0010]US2003/0170711描述了包括通用堿基(包括2_脫氧肌苷)的寡核苷酸探針。
[0011]W02011/087928描述了用于在野生型序列背景中檢測KRAS和PIK3CA SNP的寡核苷酸探針，所述探針包括多脫氧肌苷接頭。
[0012]發(fā)明概述
[0013]根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種核酸探針，其包括與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一核酸序列；與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列；和連接第一和第二核酸序列的接頭核酸序列；其中所述接頭將第一和第二序列兩個(gè)分開，以致與第一靶核酸序列退火的第一序列的解鏈溫度和與第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度是分離的(discrete)。
[0014]接頭區(qū)域的存在讓探針分為具有不同雜交特征的功能性元件。這些接頭的包含產(chǎn)生’泡’結(jié)構(gòu)，從熱力學(xué)的視角分離探針的元件，以提供具有不同結(jié)合特性的區(qū)域。進(jìn)一步的，接頭核酸序列的存在讓整個(gè)探針具有單個(gè)多核苷酸分子的特性，但表現(xiàn)如由分開的更短核酸探針組成。當(dāng)?shù)谝缓偷诙蛄须s交于其各自的靶序列時(shí)，接頭區(qū)域可以折疊形成外環(huán)(loop out) ο
[0015]在一些實(shí)施方案中，探針可以進(jìn)一步被延伸以具有進(jìn)一步的由多個(gè)接頭分開的多雜交區(qū)域。
[0016]這可以以許多不同方式使用。例如，所述探針結(jié)構(gòu)允許探測鄰近的區(qū)域，其中較長的探針(例如，橫跨第一和第二靶區(qū)域二者的單個(gè)探針)通過Tm分析將不提供足夠的報(bào)告信息以區(qū)分變體。
[0017]優(yōu)選地，所述接頭是核苷接頭；更優(yōu)選地，所述接頭包括多脫氧核糖核苷酸；最優(yōu)選地，所述接頭包括多脫氧肌苷或由多脫氧肌苷組成。由于較弱的氫鍵，脫氧肌苷具有相對于天然堿基低的解鏈溫度?？梢允褂闷渌塑?。
[0018]優(yōu)選地，所述接頭長度達(dá)5，10，15，20，30，40，50個(gè)核苷酸。
[0019]第一和第二核酸序列的至少一個(gè)是報(bào)告子區(qū)域。報(bào)告子區(qū)域包括標(biāo)記的部分；優(yōu)選熒光標(biāo)記。這允許在結(jié)合靶序列時(shí)檢測探針，和在一個(gè)溫度范圍監(jiān)測退火以確定任何變體靶序列的存在。優(yōu)選地，所述探針不包括猝滅部分，也不包括意在與猝滅子一起使用的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括FAM，TET, HEX, ROX, TAMRA, Cy3，和Cy5。其它合適的標(biāo)記將是熟練技術(shù)人員已知的。盡管可以使用任何合適的核苷酸，但是優(yōu)選地所述標(biāo)記被整合在T核苷酸上。
[0020]所述報(bào)告子區(qū)域長度優(yōu)選15-200nt，長度更優(yōu)選15_150，還更優(yōu)選15_100，或20-100，30-80，40-60，或大約 50nt。
[0021]所述報(bào)告子區(qū)域設(shè)計(jì) 為具有與完全互補(bǔ)靶序列相關(guān)的第一 Tm，和改變的、優(yōu)選與變體靶序列相關(guān)的較低Tm。例如，所述變體可以表示SNP(單核苷酸多態(tài)性)，插入，缺失，倒位，或重復(fù)序列。
[0022]在該實(shí)施方案中，退火于第一靶核酸序列的第一序列的解鏈溫度可以不同于退火于第二靶核酸序列的第二序列的解鏈溫度。然而，優(yōu)選地，第一和第二核酸序列二者都選擇為具有對其各自的靶序列相似的Tm。
[0023]所述報(bào)告子區(qū)域可以進(jìn)一步包括阻斷區(qū)域(blocking region) ;8卩，用于阻止通過DNA聚合酶的核酸鏈的延伸，從而阻止在例如，PCR過程中的鏈延伸的部分。聚合酶酶阻斷基團(tuán)是應(yīng)該具有阻斷聚合物的進(jìn)一步延長功能性質(zhì)的基團(tuán)。阻斷基團(tuán)可以是任何能夠連接于核苷酸的化學(xué)基團(tuán)，其將允許修飾的核苷酸的5’端連接于DNA鏈中另一個(gè)核苷酸的3’端但將不允許核苷酸連接于修飾的核苷酸的3’羥基基團(tuán)。適當(dāng)?shù)兀?’位置OH基團(tuán)的缺失將阻止通過聚合酶活性的進(jìn)一步延伸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，阻斷基團(tuán)選自乙?；?，CH3，甘氨?；?，亮氨酰基和丙氨?；鶊F(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述阻斷基團(tuán)可以是二或三肽的形式。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二核酸序列都是報(bào)告子區(qū)域。它們可以包括不同標(biāo)記。此種探針可以用作多重報(bào)告子，允許用單個(gè)探針在擴(kuò)展的范圍內(nèi)檢測靶序列。
[0025]在該實(shí)施方案中，所述探針被分為多個(gè)分離的報(bào)告子區(qū)域。每個(gè)報(bào)告子區(qū)域具有不同退火溫度并且具有I個(gè)或更多熒光核苷酸，優(yōu)選FAM-T，或不同/多個(gè)顏色。所述報(bào)告子可以用于報(bào)告特定的序列或序列變體，SNP，插入，缺失等的存在。這將允許用單個(gè)探針在擴(kuò)展的范圍內(nèi)檢測多個(gè)序列。每個(gè)區(qū)域被調(diào)整為在野生型靶序列的情況下具有相似的Tm，但在突變的情況下具有改變的Tm ;這意味著使用者僅必須檢測改變的Tm以知曉變體存在。
[0026]作為檢測多個(gè)靶序列的備選方案，可以將探針構(gòu)造以例如提供控制結(jié)合區(qū)域和測試結(jié)合區(qū)域，用以改善測定的可信度。[0027]在本發(fā)明的一個(gè)備選實(shí)施方案中，第二核酸序列可以是報(bào)告子區(qū)域，并且第一核酸序列是錨定區(qū)域。在該實(shí)施方案中，退火于第一靶核酸序列的第一序列的解鏈溫度高于退火于第二靶核酸序列的第二序列的解鏈溫度。接頭序列可以形成外環(huán)區(qū)域或可以雜交于任何探針內(nèi)部的(inter-probe)核酸序列。錨定區(qū)域?qū)胄蛄械腡m顯著高于(高出至少
0.5，1，1.5°C，但更通常可達(dá)5°C至20°C )報(bào)告子區(qū)域與靶序列的Tm。
[0028]錨定區(qū)域長度優(yōu)選為至少50nt，更優(yōu)選至少60，70，80，90，100，125，150nt。錨定區(qū)域長度優(yōu)選為不多于200nt和長度不少于20nt。
[0029]在使用中，因?yàn)殄^定區(qū)域具有基本上更高的退火溫度，因此其用于將探針錨定于正確的區(qū)域。報(bào)告子區(qū)域具有相對于錨定區(qū)域更低的退火溫度并且具有I個(gè)或更多熒光核苷酸，優(yōu)選FAM-T。報(bào)告子是用于報(bào)告特定序列或序列變體，SNP，插入，缺失等的存在。
[0030]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針用于檢測大小/長度多態(tài)性，例如STR分布(profiling),脆性X染色體(FragileX)等。錨定區(qū)域用于退火于重復(fù)區(qū)域的下游，同時(shí)報(bào)告子區(qū)域同源于重復(fù)序列的短延伸。因?yàn)閳?bào)告子與主要的錨定區(qū)域分開，和因?yàn)闊晒鈭F(tuán)僅在報(bào)告子區(qū)域上，因此，如果報(bào)告子在不同位點(diǎn)結(jié)合而引起擴(kuò)增子中形成外環(huán)(通常這將改變產(chǎn)物的Tm，使得難以測量)，也沒有影響。在一些實(shí)施方案中，錨定區(qū)域可以設(shè)計(jì)為與重復(fù)區(qū)域以及側(cè)翼區(qū)的短延伸同源；例如，錨定區(qū)域可以包括可達(dá)50nt的重復(fù)序列和更長的側(cè)翼序列延伸，例如150nt。
[0031]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供一種核酸探針，其包括互補(bǔ)于第一靶核酸序列的第一錨定核酸序列；互補(bǔ)于第二靶核酸序列的第二報(bào)告子核酸序列；和連接第一和第二核酸序列的接頭核酸序列；其中所述接頭將第一和第二序列分開，以致雜交于其各自的靶序列的第一和第二序列的解鏈溫度是分離的，并且其中退火于第一靶核酸序列的錨定序列的解鏈溫度高于退火于第二靶核酸序列的報(bào)告子序列的解鏈溫度；并且其中每個(gè)報(bào)告子序列包括至少一個(gè)可檢測標(biāo)記。
[0032]所述報(bào)告子優(yōu)選包括多個(gè)重復(fù)的序列單元。優(yōu)選至少3，4，或5個(gè)重復(fù)的單元。
[0033]所述接頭優(yōu)選包括多脫氧肌苷。
[0034]所述錨可以包括一個(gè)或多個(gè)重復(fù)的序列單元，但優(yōu)選包括單一序列。所述錨長度優(yōu)選為從50至200nt。
[0035]所述探針優(yōu)選進(jìn)一步包括阻斷序列以阻止PCR過程中的鏈延伸。
[0036]所述探針可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)另外的接頭和報(bào)告子序列。
[0037]本發(fā)明的一個(gè)更進(jìn)一步的方面提供一種核酸探針，其包括互補(bǔ)于第一靶核酸序列的第一報(bào)告子核酸序列；互補(bǔ)于第二靶核酸序列的第二報(bào)告子核酸序列；和連接第一和第二核酸序列的接頭核酸序列；其中退火于第一靶核酸序列的第一報(bào)告子序列的解鏈溫度相似或相等于退火于第二靶核酸序列的第二報(bào)告子序列的解鏈溫度；并且其中每個(gè)報(bào)告子序列包括至少一種可檢測標(biāo)記。
[0038]所述探針優(yōu)選進(jìn)一步包括阻斷序列以阻止PCR過程中的鏈延伸。
[0039]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供一種檢測靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性的方法，所述方法包括:
[0040]提供根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的探針；
[0041] 將探針與測試核酸序列接觸，所述測試序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；
[0042]讓探針的第一核酸序列雜交于第一靶核酸序列；和讓探針的第二核酸序列雜交于第二靶核酸序列；和
[0043]確定與第一靶序列雜交的第一探針序列的Tm ;和確定與第二靶序列雜交的第二探針序列的Tm ；
[0044]其中Tm指示野生型序列或變體序列的存在。
[0045]該方法還可以用于改善解鏈溫度的效用，通過其，第一報(bào)告區(qū)域的Tm用作測量變體序列區(qū)域的Tm的參考。通常，記錄的解鏈溫度的位置(用于確定潛在(underlying)序列)，可能受反應(yīng)混合物中鹽濃度影響。通過比較作為已知序列的第一報(bào)告子區(qū)域的解鏈位置，更精確地確定第二報(bào)告子序列下的序列是可能的，因?yàn)閮蓚€(gè)區(qū)域都將同等地受干擾物質(zhì)(例如外部鹽)影響。
[0046]因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供一種檢測靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性的方法，所述方法包括:
[0047]提供根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的探針；
[0048]將探針與測試核酸序列接觸，所述測試序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；讓探針的第一核酸序列雜交于第一靶核酸序列；和讓探針的第二核酸序列雜交于第二靶核酸序列；和
[0049]確定與第一 靶序列雜交的第一探針序列的Tm ;和確定與第二靶序列雜交的第二探針序列的Tm ；
[0050]將確定的第一探針序列的Tm與預(yù)期的第一探針序列的Tm相比較；
[0051]基于確定的和預(yù)期的第一探針序列的Tm的不同，標(biāo)準(zhǔn)化確定的第二探針序列的Tm ；
[0052]其中標(biāo)準(zhǔn)化的第二探針序列的Tm指示野生型序列或變體序列的存在。
[0053]本發(fā)明的一個(gè)更進(jìn)一步的方面提供一種檢測靶核酸序列中串聯(lián)重復(fù)的方法，所述方法包括:
[0054]提供根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的探針，其中所述報(bào)告子序列包括許多串聯(lián)重復(fù)單元;
[0055]將探針與測試核酸序列接觸，所述測試序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，其中第一靶序列互補(bǔ)于探針錨定序列，并且第二靶序列包括許多互補(bǔ)于報(bào)告子序列的串聯(lián)重復(fù)單元的串聯(lián)重復(fù)；
[0056]讓探針的錨定核酸序列雜交于第一靶核酸序列；和讓探針的第二核酸序列雜交于第二靶核酸序列；和
[0057]檢測報(bào)告子序列與測試核酸序列結(jié)合與否(or otherwise)。
[0058]可以通過確定報(bào)告子序列與測試核酸序列的Tm，和/或通過檢測源自報(bào)告子序列的標(biāo)記(例如，熒光)來檢測結(jié)合。結(jié)合表明靶序列中重復(fù)的數(shù)量大于或等于報(bào)告子序列中重復(fù)的數(shù)量；如果在報(bào)告子序列中存在更多的重復(fù)，那么存在不結(jié)合或減少的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，Tm通?？梢员徽J(rèn)為是與靶序列中的重復(fù)的數(shù)量成比例的，并且可以確定Tm以確定重復(fù)的數(shù)量。備選地，或此外，探針的報(bào)告子序列在每個(gè)重復(fù)單元中可以包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的部分；這樣，檢測的標(biāo)記可以被看作是與靶序列中重復(fù)的數(shù)量成比例的。[0059]附圖簡述
[0060]現(xiàn)在將僅通過實(shí)施例和參考附圖描述本發(fā)明的這些和其它方面，其中:
[0061]圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的第一探針結(jié)構(gòu)；
[0062]圖2至5顯示通過圖1的探針結(jié)合靶序列形成的備選雙鏈體結(jié)構(gòu)；
[0063]圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)備選實(shí)施方案的第二探針結(jié)構(gòu)；
[0064]圖7顯示結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis) rpoB基因中的普通突變密碼子； [0065]圖8顯示與一些突變基因的序列一起的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)rpoB基因的部分序列和根據(jù)本發(fā)明的用于檢測此種突變體的存在的探針序列；
[0066]圖9顯示通過圖8的探針結(jié)合靶序列形成的備選雙鏈體結(jié)構(gòu)；
[0067]圖10顯示獲自圖9的雙鏈體的解鏈曲線實(shí)例；
[0068]圖11顯示痘苗基因組的部分與其它痘病毒的部分的序列比對；
[0069]圖12顯示用于檢測痘病毒的探針；
[0070]圖13比較圖12的接頭探針的靈敏度與常規(guī)痘苗探針的靈敏度；
[0071]圖14顯示圖12的接頭探針和常規(guī)探針與不同擴(kuò)增的痘病毒基因組序列的解鏈曲線分析；
[0072]圖15顯示用于擴(kuò)增用于圖14的痘病毒片段的引物序列和擴(kuò)增條件；和
[0073]圖16顯示用于人酪氨酸羥化酶基因中的短串聯(lián)重復(fù)的引物和探針序列，和解鏈曲線分析。
[0074]附圖詳述
[0075]本發(fā)明涉及一種核酸探針，其被分為由核酸接頭分開的兩個(gè)或更多功能元件。所述接頭優(yōu)選是脫氧肌苷，其具有相對天然存在的DNA堿基低的Tm?？梢允褂闷渌线m的接頭。
[0076]圖1示意性地顯示根據(jù)本發(fā)明的探針的第一個(gè)實(shí)施方案。所述探針包括通過長度為5nt的脫氧肌苷接頭從15-200nt長度的報(bào)告子區(qū)域分離的長度大約100_200nt的錨定區(qū)域。所述錨定區(qū)域被設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于第一靶區(qū)域，所述第一靶區(qū)域是靶核酸中重復(fù)序列區(qū)域下游。報(bào)告子區(qū)域互補(bǔ)于重復(fù)序列區(qū)域，并且包括已知數(shù)量的重復(fù)單元。所述報(bào)告子區(qū)域還包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的核苷酸，優(yōu)選FAM-T。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)重復(fù)單元包括標(biāo)記的核苷酸。
[0077]這樣設(shè)計(jì)探針序列，以致錨定區(qū)域?qū)Π械腡m顯著高于報(bào)告子對靶的Tm，其又顯著高于接頭對靶核酸中的任意序列的Tm。
[0078]圖2至5顯示探針結(jié)合于靶的各種不同情況。在這些情況中，所述探針被用于確定大小/長度多態(tài)性(例如STR分布，脆性X染色體等)。錨定區(qū)域用于將探針退火于重復(fù)區(qū)域的下游，而報(bào)告子區(qū)域同源于重復(fù)序列的短的延伸。因?yàn)閳?bào)告子與主要錨定區(qū)域分開，并且因?yàn)闊晒鈭F(tuán)僅在報(bào)告子區(qū)域上，因此，如果報(bào)告子在不同位點(diǎn)結(jié)合以引起擴(kuò)增子中的外環(huán)形成(通常這將改變產(chǎn)物的Tm，使得難以測量)，也沒有影響。
[0079]在靶重復(fù)序列區(qū)域的長度小于報(bào)告子區(qū)域的長度的情況下(圖2)，那么報(bào)告子區(qū)域不結(jié)合靶，并且不存在源自標(biāo)記的熒光，并且不存在由測量報(bào)告子的Tm獲得的解鏈曲線。然而，因?yàn)殄^定區(qū)域已經(jīng)結(jié)合靶，因此，這可以被測量(例如，通過確定Tm)，從而確定探針的確結(jié)合和確定重復(fù)序列區(qū)域缺失。[0080]在靶重復(fù)序列區(qū)域的長度等于或長于報(bào)告子區(qū)域的長度的情況下，那么圖3至5中的任何情況都可以發(fā)生。在圖3中，控制報(bào)告子小到1，2，3，4或5個(gè)重復(fù)長度，其限制任何外環(huán)的效果對報(bào)告子:擴(kuò)增子雙鏈體Tm的影響。應(yīng)用的實(shí)例是對于大的重復(fù)結(jié)構(gòu)(例如脆性X染色體)，其中將重復(fù)的數(shù)量’分段’是重要的；例如〈50，>100，>200。備選地，小的外環(huán)可以發(fā)生(圖4);再次，因?yàn)閳?bào)告子小，對報(bào)告子:擴(kuò)增子雙鏈體的Tm存在最小的影響，并且能夠確定探針上至少重復(fù)的數(shù)量的存在。
[0081]如果增加報(bào)告子長度以容納多個(gè)重復(fù)(圖5)，那么報(bào)告子擴(kuò)增子雙鏈體的Tm將與重復(fù)的數(shù)量成比例。報(bào)告子的未結(jié)合部分將由于標(biāo)記的自猝滅而不發(fā)熒光。標(biāo)記報(bào)告子中每個(gè)重復(fù)的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸。該方法學(xué)在STR分析中可能是重要的，在所述STR分析中，你對高達(dá)15x或20x的3，4或5bp的重復(fù)序列的數(shù)量感興趣。
[0082]圖6中顯示備選的探針結(jié)構(gòu)。該探針是多重報(bào)告子，并且包括由接頭連接的兩個(gè)分開的報(bào)告子區(qū)域。每個(gè)報(bào)告子區(qū)域具有不同的退火溫度和具有I個(gè)或更多熒光核苷酸(優(yōu)選FAM-T)或不同/多個(gè)顏色。所述報(bào)告子用于報(bào)告特定序列或序列變體(例如，SNP，插入，缺失等)的存在。這允許用單個(gè)探針在擴(kuò)展的范圍內(nèi)檢測多個(gè)序列。每個(gè)區(qū)域被調(diào)整為在野生型序列的情況下具有相似的-但不是相同的-Tm，但在突變的情況下具有改變的Tm，以便使用者僅必須檢測改變的Tm以知曉變體存在。通過〃相似的〃意為Tm相差至多 2，1.5，1,0.50C ο
[0083]所述探針還可以被排列以例如提供控制結(jié)合區(qū)域和測試結(jié)合區(qū)域。
[0084]現(xiàn)在給出使用多重報(bào)告子探針在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)rpoB基因中檢測變體的實(shí)例。結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)中的多耐藥性是復(fù)雜的。利福平(Rifampin)是一線結(jié)核 分枝桿菌(M.tuberculosis)藥物并且是在該領(lǐng)域中治療前鑒別用的主要祀點(diǎn)。利福平(Rifampin)抗性的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)在編碼RNA聚合酶的β -亞單位的rpoB基因的81_bp核心區(qū)域具有突變。96%的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)利福平(Rifampin)抗性臨床分離株在該基因中具有突變。密碼子516,526，或531中的突變導(dǎo)致高水平的利福平(Rifampin)抗性。然而，檢測橫跨81_bp基因區(qū)域的突變將典型地需要多個(gè)常規(guī)探針，所述常規(guī)探針中的一些將需要重疊，因此需要多個(gè)檢測步驟。
[0085]圖7顯示rpoB基因部分中的野生型和變體密碼子；注意，顯示9個(gè)密碼子源自21個(gè)密碼子^3nt)區(qū)域。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了探針(顯示于圖8，標(biāo)記的探針)以檢測和報(bào)告任何潛在的具有在主要抗性密碼子516，526，或531中的突變的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)基因型的存在。
[0086]圖8還顯示與三條突變序列(MUT516，MUT526，和MUT531) —起的rpoB基因的野生型(WT)序列。WT序列的方框區(qū)域是與設(shè)計(jì)的探針雜交的那些。所述探針自身包括橫跨密碼子531至525的第一報(bào)告子序列，所述第一報(bào)告子序列包括可能的突變密碼子526和531，具有五個(gè)多脫氧肌苷殘基(表示為"I")的接頭，和橫跨密碼子518至510的第二報(bào)告子序列(包括可能的突變密碼子516)。每個(gè)報(bào)告子序列包括兩個(gè)標(biāo)記的T殘基(突出顯示的)。第二報(bào)告子序列還臨近PCR阻斷基團(tuán)部分。
[0087]在兩個(gè)位置結(jié)合WT序列的探針對于每個(gè)報(bào)告子序列給出相同的60C的Tm。突變序列的存在將其改變?yōu)?2C-56C。[0088]圖9顯示探針對靶序列的可能結(jié)合模式。在兩個(gè)報(bào)告子序列都結(jié)合野生型(WT:WT)的情況下，第一報(bào)告子的Tm(Tml)等于第二報(bào)告子的Tm(Tm2)。第一報(bào)告子中的單個(gè)突變(MUT=WT)降低第一報(bào)告子的Tm至Tm3，其低于Tm2。第二報(bào)告子中的單個(gè)突變(WT:MUT)降低第二報(bào)告子的Tm至Tm4，其低于Tml。在每個(gè)報(bào)告子中的單個(gè)突變(MUT=MUT)改變各自的Tm至Tm3和Tm4。最后，在第一報(bào)告子靶中的第二突變(MUT:WT)的存在降低Tm至Tm5，其低于Tm3。
[0089]這些Tm中的每個(gè)可相互區(qū)分，并且因此單個(gè)探針可以用于確定rpoB基因中三個(gè)不同的突變的存在。圖10給出來自該實(shí)驗(yàn)中的代表性解鏈曲線。能夠明確區(qū)分突變序列中野生型的存在。因此，該探針結(jié)構(gòu)允許簡單多重檢測橫跨基因組的相對長的延伸的多個(gè)突變。
[0090]此種探針的進(jìn)一步說明性使用顯示于圖11至15中，其說明用于檢測痘苗病毒和將該病毒區(qū)別于相關(guān)痘病毒的探針的使用。圖11將痘苗基因組序列的30個(gè)核苷酸部分與猴痘(monkeypox),牛痘(cowpox),鼠痘(ectromelia),和駱5它痘(camelpox)病毒的進(jìn)行比較。將看到橫跨該序列存在八個(gè)可以不同的堿基。
[0091]圖12說明用于檢測病毒基因組的該區(qū)域和將不同病毒彼此區(qū)別的探針。所述探針包括被五個(gè)肌苷殘基的序列從第二報(bào)告子區(qū)域分開的第一報(bào)告子區(qū)域。第一報(bào)告子區(qū)域包括三甲氧基芪帽。每個(gè)報(bào)告子區(qū)域包括兩個(gè)熒光標(biāo)記的T殘基。
[0092]所述探針序列是:
[0093]5’ -GAG T * AT TTG T * CA TTT IIIII TAT ATT T * GT TGG CT * G_3’:SEQ IDNO:1
[0094]覆蓋以5’三 甲氧基芪，和3’磷酸。I =肌苷。T* =熒光標(biāo)記的T。
[0095]兩個(gè)報(bào)告子區(qū)域橫跨顯示于圖11的30個(gè)核苷酸序列，并且二者都覆蓋許多可能的變異位點(diǎn)。
[0096]圖13將探針的靈敏度與橫跨同樣的30nt序列的標(biāo)準(zhǔn)痘苗探針的靈敏度進(jìn)行比較。在同樣的拷貝數(shù)，接頭探針顯著更靈敏。為了比較靈敏度，使用表示在圖15中的引物和條件擴(kuò)增基因組的部分，并且隨后使用相關(guān)探針在擴(kuò)增子上進(jìn)行解鏈曲線測試。
[0097]圖14顯示當(dāng)雜交于不同痘病毒靶序列時(shí)，痘苗探針("接頭探針")和常規(guī)痘苗探針("標(biāo)準(zhǔn)探針")的解鏈曲線。接頭探針橫跨的Tm范圍小得多，但是接頭探針提供不同痘病毒之間改善的區(qū)分，并且允許通過單個(gè)探針明確地鑒別和區(qū)分五種病毒。與常規(guī)探針相t匕，接頭探針的使用降低了產(chǎn)物的Tm，并且降低了 Tm范圍，以使在所述范圍內(nèi)的多重使用能夠更高。本發(fā)明的探針允許在30個(gè)堿基的短區(qū)域中鑒別高達(dá)五個(gè)堿基的錯(cuò)配，因此允許鑒別痘病毒。
[0098]圖16顯示用于在人酪氨酸羥化酶基因中分析短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的引物和探針序列。
[0099]正向和反向引物是:
[0100]THOl-FffD
[0101 ] ATT CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG:SEQ ID NO: 2
[0102]TH01-REV
[0103]GTG GGC TGA AAA GCT CCC CAT TAT: SEQ ID NO: 3
[0104]TH基因包括(AATG)n的短串聯(lián)重復(fù)序列，已知其是多態(tài)的。為了確定本發(fā)明能夠區(qū)別不同長度的STR，比較了兩個(gè)探針的靈敏度和準(zhǔn)確度。兩個(gè)探針都為同樣的序列，制備探針I(yè) (無接頭)，而探針2包括在探針的兩個(gè)部分之間的用作接頭的五個(gè)肌苷的堿基序列。探針序列是:
[0105]THO1-探針 I
[0106]M ACAGACTCCAFG GFGAATGAAFGAATGAGGGAAATAAGGG AGGA P: SEQ ID NO:4
[0107]THOl-探針 2
[0108]M ACAGACTCCAFG GFGAATGAAFGAATGA ***** GGGAAATAAGGG AGGA P:SEQ ID NO:5
[0109](M =三甲氧基苗；P =磷酸;* =肌苷；F =突光標(biāo)記的T)。
[0110] 用引物擴(kuò)增靶序列之后，用探針I(yè)或探針2之一和擴(kuò)增子進(jìn)行解鏈曲線分析。曲線顯示于圖16。盡管兩個(gè)探針都能夠區(qū)別3，6，9，和12個(gè)拷貝的重復(fù)序列，但是具有接頭的探針2提供在窄得多的溫度范圍內(nèi)的不同數(shù)量的重復(fù)序列之間的區(qū)分。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸探針，其包括與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一核酸序列；與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列；和連接第一和第二核酸序列的接頭核酸序列；其中所述接頭分開所述第一和第二序列兩個(gè)，以致與所述第一靶核酸序列退火的第一序列的解鏈溫度和與所述第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度是分離的。
2.如權(quán)利要求1所述的探針，其中所述接頭包括多脫氧核糖核苷酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的探針，其中所述接頭包括多脫氧肌苷或由多脫氧肌苷組成。
4.如任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的探針，其中所述接頭的長度為多達(dá)5，10，15，20，30，40,50個(gè)核苷酸。
5.如任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的探針，其中所述第一和第二核酸序列中的至少一個(gè)是報(bào)告子區(qū)域，所述報(bào)告子區(qū)域包括標(biāo)記的部分；優(yōu)選熒光標(biāo)記。
6.如任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的探針，其中所述探針不包括猝滅部分。
7.如權(quán)利要求5所述的探針，其中所述報(bào)告子區(qū)域的長度優(yōu)選為15-200nt，長度更優(yōu)選為 15-150，還更優(yōu)選為 15-100，或 20-100，30-80，40-60，或大約 50nt。
8.如權(quán)利要求5或7所述的探針，其中所述報(bào)告子區(qū)域被設(shè)計(jì)為具有與完全互補(bǔ)靶序列相關(guān)的第一 Tm，和改變的、優(yōu)選更低的與變體靶序列相關(guān)的Tm。
9.如任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的探針，進(jìn)一步包括阻斷區(qū)域，所述阻斷區(qū)域用于阻斷通過DNA聚合酶的核酸鏈的延伸。
10.如任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的探針，其中第一和第二核酸序列二者都是報(bào)告子區(qū)域。
11.如權(quán)利要求10所述的探針，其中報(bào)告子區(qū)域二者都選擇為具有在結(jié)合野生型靶序列的情況下相似的Tm，和在結(jié)合突變靶序列的情況下降低的Tm ;優(yōu)選的，對于第一報(bào)告子區(qū)域的降低的Tm不同于第二報(bào)告子區(qū)域的降低的Tm。
12.如權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的探針，其中所述第二核酸序列是報(bào)告子區(qū)域，并且所述第一核酸序列是錨定區(qū)域，其中與所述第一靶核酸序列退火的錨定區(qū)域的解鏈溫度比與所述第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度高。
13.如權(quán)利要求12所述的探針，其中錨定區(qū)域:靶序列雙鏈體的Tm顯著高于(高出至少0.5，1，1.5，但更通常多達(dá)5至20°C )報(bào)告子區(qū)域?qū)Π行蛄械腡m。
14.如權(quán)利要求12或13所述的探針，其中所述錨定區(qū)域的長度是至少50nt，更優(yōu)選至少 60,70,80,90,100，125，150nt。
15.如權(quán)利要求12，13，或14所述的探針，其中所述錨定區(qū)域的長度為不大于200nt。
16.如權(quán)利要求12至15任一項(xiàng)所述的探針，其中所述報(bào)告子區(qū)域包括串聯(lián)重復(fù)序列。
17.如權(quán)利要求12至16任一項(xiàng)所述的探針，其中所述錨定區(qū)域包括串聯(lián)重復(fù)序列和單一序列。
18.如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的探針，其中第一和第二靶核酸序列發(fā)現(xiàn)于結(jié)核分枝桿菌(Mtuberculosis)的基因組中。
19.如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的探針，其中第一和第二靶核酸序列發(fā)現(xiàn)于痘苗痘病毒(vaccinia pox virus)的基因組中。
20.如任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的探針，其中第一和第二靶序列在基因組序列中在彼此 200，150，100，50，40，30，20，15，10,5,4,3,2,1 個(gè)核苷酸內(nèi)。
21.一種核酸探針，其包括與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一錨定核酸序列；與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二報(bào)告子核酸序列；和連接第一和第二核酸序列的接頭核酸序列；其中所述接頭分開第一和第二序列，以致與其各自的靶序列雜交的第一和第二序列的解鏈溫度是分離的，并且其中與所述第一靶核酸序列退火的錨定序列的解鏈溫度高于與所述第二靶核酸序列退火的報(bào)告子序列的解鏈溫度；并且其中每個(gè)報(bào)告子序列包括至少一種可檢測標(biāo)記。
22.一種核酸探針，包括與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一報(bào)告子核酸序列；與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二報(bào)告子核酸序列；和連接第一和第二核酸序列的接頭核酸序列；其中與第一靶核酸序列退火的第一報(bào)告子序列的解鏈溫度和與第二靶核酸序列退火的第二報(bào)告子序列的解鏈溫度相似或相等；并且其中每個(gè)報(bào)告子序列包括至少一種可檢測標(biāo)記。
23.根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的核酸探針，其進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)其他接頭序列，和用于與一個(gè)或多個(gè)其他靶序列雜交的一個(gè)或多個(gè)其他核酸序列。
24.一種檢測靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性的方法，所述方法包括: 提供根據(jù)權(quán)利要求1至23任一項(xiàng)所述的探針； 將探針與測試核酸序列接觸，所述測試序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列；讓所述探針的第一核酸序列與所述第一靶核酸序列雜交；和讓所述探針的第二核酸序列與所述第二靶核酸序列雜交；和 確定與第一靶序列雜交的第一探針序列的Tm ;和確定與第二靶序列雜交的第二探針序列的Tm ； 其中Tm指示野生型序列或變體序列的存在。
25.—種檢測靶核酸序列中的串聯(lián)重復(fù)的方法，所述方法包括: 提供根據(jù)權(quán)利要求12至17任一項(xiàng)所述的探針，所述探針包括具有許多串聯(lián)重復(fù)單元的報(bào)告子序列； 將所述探針與測試核酸序列接觸，所述測試序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列，其中所述第一靶序列與探針錨定序列互補(bǔ)，并且所述第二靶序列包括許多與所述報(bào)告子序列的串聯(lián)重復(fù)單元互補(bǔ)的串聯(lián)重復(fù)； 讓所述探針的錨定核酸序列與所述第一靶核酸序列雜交；和讓探針的第二核酸序列與所述第二靶核酸序列雜交；和 檢測所述報(bào)告子序列與所述測試核酸序列結(jié)合與否。
26.—種檢測靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性的方法，所述方法包括: 提供根據(jù)權(quán)利要求1至23任一項(xiàng)所述的探針； 將所述探針與測試核酸序列接觸，所述測試序列具有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列； 讓所述探針的第一核酸序列與第一靶核酸序列雜交；和讓探針的第二核酸序列與第二靶核酸序列雜交；和 確定與第一靶序列雜交的第一探針序列的Tm ;和確定與第二靶序列雜交的第二探針序列的Tm ； 將確定的第一探針序列的Tm與預(yù)期的第一探針序列的Tm相比較； 基于確定的和預(yù)期的第一探針序列的Tm的不同，標(biāo)準(zhǔn)化所確定的第二探針序列的Tm ；其中標(biāo)準(zhǔn)化的第二探針序列的Tm指示野生型序列或變體序列的存在。
27.如權(quán)利要求24或26任一項(xiàng)所述的方法，其中所述變體序列是缺失，重復(fù)，SNP，或插入。
【文檔編號】C12Q1/68GK103998624SQ201280056756
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月19日
【發(fā)明者】本·科布 申請人:艾皮斯托姆有限公司