用于生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7,7和聚酯的生物轉(zhuǎn)化工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明實(shí)施方案涉及用于在存在分離的酶或存在表達(dá)那些酶的重組宿主細(xì)胞的情況下生物合成雙官能或三官能C7烷的方法。所述雙官能或三官能C7烷可用作生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7,x、尼龍-x,7和聚酯的中間物。
【專利說明】用于生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7, 7和聚酯的生物轉(zhuǎn)化工藝
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年6月30日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)Ser.N0.61/503，043和均為2011 年 12 月 21 日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng) Ser.N0.61/578，265 ;61/578，272 ;和 61/578，289的權(quán)益，其完整內(nèi)容均通過提述如在本文中完整列出的并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于在存在一種或多種分離的酶或存在表達(dá)一種或多種酶的重組宿主細(xì)胞的情況下生物合成產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷的方法。所述雙官能或三官能C7烷可用作生產(chǎn)例如尼龍_7、尼龍-7，X和/或尼龍-X，7的中間物。
[0004]發(fā)明背景
[0005]化學(xué)工業(yè)對(duì)可持續(xù)實(shí)踐的推動(dòng)聚焦于降低能量使用、再生原材料和減少貨物生產(chǎn)期間產(chǎn)生的副產(chǎn)物。然而，化學(xué)工業(yè)極其依賴于將石油和天然氣作為基礎(chǔ)原料。鑒于與主要石油化學(xué)品工藝有關(guān)的優(yōu)化狀態(tài)，將需要在原料使用和制造設(shè)計(jì)中的重大轉(zhuǎn)變以將能量、散發(fā)和成本降低至其目前水平之下。生物技術(shù)提供了一種用于從可再生糖類如植物源的糖或其他可再生原料如脂肪酸生產(chǎn)工業(yè)化學(xué)中間物和終產(chǎn)物的新辦法。另外，生物技術(shù)還提供了一種利用廢物或低價(jià)值流如來自生物柴油生產(chǎn)的甘油，或在比現(xiàn)有化學(xué)工藝更有益于環(huán)境的生物工藝中將基于石油化學(xué)品的原料如苯、甲苯和多環(huán)芳香烴(PAH)轉(zhuǎn)化成可用產(chǎn)物的方式。
[0006]US2010/020360 0和W02011/031147通過提述完整并入本文。本領(lǐng)域中需要對(duì)尼龍_7、尼龍-7，X、尼龍-X, 7和聚酯的化學(xué)中間物和終產(chǎn)物尼龍_7、尼龍-7，X、尼龍-X, 7和聚酯的經(jīng)濟(jì)的生物合成途徑，尤其是從多種可再生和不可再生原料進(jìn)行。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本公開至少部分基于用于生物合成二或三官能C7烷的酶系統(tǒng)和重組宿主的開發(fā)，所述二或三官能C7烷是用于生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-X，7、尼龍-7，X和聚酯的可用中間物(單體)。具體地，如本文中描述的，可用于生產(chǎn)尼龍-7和尼龍-7，X、尼龍-X，7和聚酯的中間物可從可再生原料如植物源的糖和甘油，或從基于石油化學(xué)品的原料如苯或環(huán)己烷羧酸酯生物合成產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，二官能或三官能C7烷的產(chǎn)生最終經(jīng)由一種通用的中間體庚二酸半醛(亦稱為7-氧庚酸)進(jìn)行，盡管有許多可使用的不同原料和許多產(chǎn)生庚二酸半醛的方式。圖1是描繪了庚二酸半醛到各種雙官能C7烷的生物轉(zhuǎn)化的示意圖。
[0009]例如，庚二酸半醛可源自庚二酰-輔酶A (CoA)、庚二酰-[?；d體蛋白(acp)]、庚二酸(亦稱為庚烷1，7-二酸)、或α-酮辛二酸酯。如本文中描述的，庚二酰-CoA和庚二酰_[acp]可源自許多來源，包括許多不同的天然存在的代謝途徑，其中形成庚二酰-CoA或庚二酰_[acp]作為中間物。
[0010]另外，庚二酰-CoA和庚二酸還可源自相應(yīng)的烯酸(enoate)2_庚烯-二元酸或其相應(yīng)的CoA酯。在一些實(shí)施方案中，這些C72-烯酸源自D，L-二氨基庚二酸鹽。在一些實(shí)施方案中，雙官能C7烷(例如7氨基庚酸)的產(chǎn)生經(jīng)由α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸(可源自D，L-二氨基庚二酸)進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸源自α-酮庚二酸。
[0011]更具體地，本發(fā)明提供多種轉(zhuǎn)化化合物以產(chǎn)生可用于制造尼龍-7、尼龍-7，7和聚酯的中間物的方法。不需要實(shí)施任一種方法的所有可能步驟，且當(dāng)獲得期望的化合物時(shí)，可終止任一種方法。如此，在產(chǎn)生例如庚二酸、7-氨基-庚酸、庚內(nèi)酰胺、1，7- 二氨基庚烷、或7-羥基-庚酸后，可終止任一種方法。
[0012]轉(zhuǎn)化化合物的第一種方法可包括使選自2，6 二氨基庚二酸鹽(2，6DAP)和α -氨基-庚二酸鹽(AAP)的化合物與催化2，6DAP到6-氨基-2-庚烯二酸(6Α2ΗΑ)的還原性脫氨基化或AAP到2-庚烯二酸(2HDA)的還原性脫氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生6Α2ΗΑ或2HDA。
[0013]所述化合物可以是2，6DAP且所述第一種方法還可包括使6Α2ΗΑ與催化6Α2ΗΑ到AAP的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生ΑΑΡ。
[0014]所述AAP可與催化AAP到2HDA的還原性脫氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA。
[0015]所述2HDA可與催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0016]所述PA可與催化PA到庚二酸半醛(PAS)的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0017]所述PAS可與催化PAS到7-氨基-庚酸(7ΑΗΑ)的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生 7ΑΗΑ。
[0018]所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到庚內(nèi)酰胺(ENTL)的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0019]轉(zhuǎn)化化合物的第二種方法可包括，在實(shí)施第一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7ΑΗΑ后，使7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7-氨基-庚醛(7ΑΗΤ)的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生ΑΗΤ。
[0020]所述7ΑΗΤ可與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7_ 二氨基庚烷(1，7DAH)的酶接觸，從而產(chǎn)生1，7DAH。
[0021]轉(zhuǎn)化化合物的第三種方法可包括，在實(shí)施第一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生2HDA后，使所述2HDA與催化輔酶A (CoA)到2HDA轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2-庚烯二酸-CoA(2HDA-CoA)的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA-CoA。
[0022]所述2HDA_CoA可與催化2HDA_CoA到庚二酰-CoA (PCoA)的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PCoA。
[0023]所述PcoA可與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0024]所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0025]所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0026]所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0027]轉(zhuǎn)化化合物的第四種方法可包括，在實(shí)施第三種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0028]所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0029]轉(zhuǎn)化化合物的第五種方法可包括，在實(shí)施第一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生AAP后，使所述AAP與催化氨基基團(tuán)到AAP轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α-酮-庚二酸鹽(AKP)的酶接觸，從而產(chǎn)生ΑΚΡ。
[0030] 所述AKP可與催化AKP到α -羥基-庚二酸鹽(AHP)的酮還原的一種或多種酶接觸，從而產(chǎn)生ΑΗΡ。
[0031 ] 所述AHP可與催化CoA到AHP轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α -羥基-庚二酸鹽(AHP-CoA)的酶接觸，從而產(chǎn)生AHP-CoA。
[0032]所述AHP-CoA可與催化AHP-CoA到2HDA_CoA的脫水的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA-CoA。
[0033]所述2HDA_CoA可與催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PCoA。
[0034]所述PcoA可與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0035]所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0036]所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0037]所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0038]轉(zhuǎn)化化合物的第六種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0039]所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0040]轉(zhuǎn)化化合物的第七種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生AHP后，使AHP與催化AHP到2HDA的脫水的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA。
[0041]所述2HDA可與催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0042]所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0043]所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0044]所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0045]轉(zhuǎn)化化合物的第八種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0046]所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0047]轉(zhuǎn)化化合物的第九種方法可包括，在實(shí)施第七種方法的所有步驟直至產(chǎn)生2HDA后，使2HDA與催化CoA到2HDA轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2HDA_CoA的酶接觸，從而產(chǎn)生2HDA_CoA。
[0048]所述2HDA_CoA與催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PCoA。
[0049]所述PcoA可與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0050]所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0051]所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0052]所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0053]轉(zhuǎn)化化合物的第十種方法可包括，在實(shí)施第九種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA后，使7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0054]所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0055]轉(zhuǎn)化化合物的第十一種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生AKP后，使AKP與催化AKP到α-酮-辛二酸鹽(AKS)的α -酮酸鏈延伸的酶接觸，從而產(chǎn)生AKS。
[0056]所述AKS可與催化氨基基團(tuán)到AKS轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α -氨基辛二酸鹽(AAS)的酶接觸，從而產(chǎn)生AAS。所述AAS可與催化AAS到7AHA的α -酮酸脫羧的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0057]所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0058]轉(zhuǎn)化化合物的第十二種方法可包括，在實(shí)施第十一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7ΑΗΑ后，使7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΤ。
[0059]所述7ΑΗΤ可與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0060]轉(zhuǎn)化化合物的第十三種方法可包括，在實(shí)施第十一種方法的所有步驟直至產(chǎn)生AKS后，使AKS與催化AKS到PAS的α -酮酸脫羧的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0061]所述PAS可與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0062]所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0063]轉(zhuǎn)化化合物的第十四種方法可包括，在實(shí)施第十三種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7ΑΗΑ后，使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΤ。
[0064]所述7ΑΗΤ可與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0065]轉(zhuǎn)化化合物 的第十五種方法可包括，在實(shí)施第五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生PCoA后，使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0066]所述PAS可與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0067]所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0068]轉(zhuǎn)化化合物的第十六種方法可包括，在實(shí)施第十五種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7ΑΗΑ后，使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΤ。
[0069]所述7ΑΗΤ可與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0070]轉(zhuǎn)化化合物的第十七種方法可包括，在實(shí)施第九種方法的所有步驟直至產(chǎn)生PCoA后，使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0071]所述PAS可與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。
[0072]所述7ΑΗΑ可與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0073]轉(zhuǎn)化化合物的第十八種方法可包括，在實(shí)施第十七種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7ΑΗΑ后，使所述7ΑΗΤ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΤ。
[0074]所述7ΑΗΤ可與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0075]轉(zhuǎn)化化合物的第十九種方法可包括使選自6Α2ΗΑ和2HDA的化合物與催化6Α2ΗΑ到AAP的烯酸還原或2HDA到PA的烯酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生AAP或PA。理解在產(chǎn)生AAP或PA后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生AAP或PA之后的任意步驟。
[0076]轉(zhuǎn)化化合物的第二十種方法可包括使選自PCoA和庚二酰[acp] (PACP)的化合物與催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接觸，從而產(chǎn)生PA。
[0077]所述PA可與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。
[0078]所述PAS可與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHA。
[0079]所述7AHA可與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，從而產(chǎn)生ENTL。
[0080]轉(zhuǎn)化化合物的第二十一種方法可包括，在實(shí)施第二十種方法的所有步驟直至產(chǎn)生7AHA后，使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7AHT。
[0081]所述7AHT可與催化氨基基團(tuán)到7AHT轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7DAH的酶接觸，從而產(chǎn)生I, 7DAH。
[0082]轉(zhuǎn)化化合物的第二十二種方法可包括，使AKP與催化AKP到AHP的酮還原的一種或多種酶接觸，從而產(chǎn)生AHP。AKP可通過α-酮己二酸或α -酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn)生。然后，AHP可轉(zhuǎn)化成PA或PcoA。理解在產(chǎn)生PA或PCoA后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生PA或PCoA之后的任意步驟。
[0083]轉(zhuǎn)化化合物的第二十三種方法可包括通過α -酮酸鏈延伸將AKP轉(zhuǎn)化成AKS。AKP可通過α-酮己二酸或α-酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn)生。理解在產(chǎn)生AKS后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生AKS之后的任意步驟。
[0084]轉(zhuǎn)化化合物的第 二十四種方法可包括使PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，從而產(chǎn)生7ΑΗΑ。PAS可通過從2，6DAP、AKG、PCoA、或PACP轉(zhuǎn)化獲得。理解在產(chǎn)生AHA后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生AM之后的任意步驟。
[0085]轉(zhuǎn)化化合物的第二十五種方法可包括使選自PCoA和PACP的化合物與催化該化合物到PAS還原的酶接觸，從而產(chǎn)生PAS。理解在產(chǎn)生PAS后，可實(shí)施在上文第一至第十八種方法中描述的產(chǎn)生PAS之后的任意步驟。此外，上文第一至第十八種方法和第二十二種方法中描述的導(dǎo)致PcoA產(chǎn)生的任意步驟可在第二十五種方法之前實(shí)施。
[0086]轉(zhuǎn)化化合物的第二十六種方法可包括使PAS與催化PAS到7_羥基-庚酸(7HHA)的醇脫氫的酶接觸，從而產(chǎn)生7HHA。理解上文第一至第十八種方法和第二十、二十二、二十三和二十五種方法中描述的導(dǎo)致PAS產(chǎn)生的任意步驟可在第二十六種方法之前實(shí)施。
[0087]在所述任一種方法中，所述酶可以純化形式使用?；蛘?，所述酶可以細(xì)胞裂解物或部分純化的細(xì)胞裂解物的形式使用。另外，所述酶可在重組表達(dá)其的細(xì)胞中。
[0088]在所述方法中，催化還原性脫氨基化的酶可包括氨裂合酶。所述氨裂合酶可以是 EC4.3.1 中的，例如 EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;或EC4.3.1.24。
[0089]在所述方法中，催化烯酸還原的酶可包括烯酸還原酶。所述烯酸還原酶可以是ECl.3.1 中的，例如 ECl.3.1.31。
[0090]在所述方法中，催化羧酸還原的酶可包括羧酸還原酶。所述羧酸還原酶可以是ECl.2.99 中的，例如 ECl.2.99.6。
[0091]在所述方法中，催化半醛氨基化的酶可包括ω轉(zhuǎn)氨酶。所述ω轉(zhuǎn)氨酶可以是 EC2.6.1 中的，例如 EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ;或 EC2.6.1.68。
[0092]在所述方法中，催化硫酯水解的酶可包括硫酯酶、酸-硫醇連接酶或CoA轉(zhuǎn)移酶。所述硫酯酶可以是EC3.1.2中的，例如EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 ;或EC3.1.2.20。所述酸-硫醇連接酶可以是EC6.2.1中的，例如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 jEC6.2.1.23。所述CoA轉(zhuǎn)移酶可以是EC2.8.3中的，例如EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
[0093]在所述方法中，催化氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶可包括氨基轉(zhuǎn)移酶。所述氨基轉(zhuǎn)移酶可以是 EC2.6.1 中的，例如 EC2.6.1.67。
[0094]在所述方法中，催化酮還原的酶可以是羰基還原酶。所述羰基還原酶可包括EC.1.1.1.184。
[0095]在所述方法中，催化α-酮酸脫羧的酶可以是α-酮酸脫羧酶。
[0096]在所述方法中，催化還原(例如，PcoA到PAS)的酶可以是脂肪-酰基-CoA還原酶。所述脂肪-酰基-CoA還原酶可以是ECl.2.1中的，例如ECl.2.1.50。
[0097]在所述方法中，催化醛脫氫的酶可以是醛脫氫酶。所述醛脫氫酶可以是ECl.2.1中的，例如 ECl.2.1.4 或 ECl.2.1.63。
[0098]在所述方法中，催化CoA轉(zhuǎn)移的酶可包括CoA轉(zhuǎn)移酶。所述CoA轉(zhuǎn)移酶可以是EC2.8.3 中的，例如 EC2.8.3.12 或 EC2.8.3.13。
[0099]在所述方法中，催化酰胺水解的酶可以是氨基水解酶。
[0100]在所述方法中，催化脫水(例如，AHP或AHP-CoA)的酶可以是水裂合酶(hydro-lyase)。所述水裂合酶可以是 EC4.2.1 中的，例如 EC4.2.1.2 ；EC4.2.1.59 ；
4.2.1.61 ；4.1.2.17 或 4.1.2.18。
[0101]在所述方法中，催化α-酮酸鏈延伸的酶可包括包含以下的酶組中的一種或多種:AksA、AksD, AksE 和 AksF0 所述 AksA 可以是 EC2.3.3 中的，例如 EC2.3.3.13 或2.3.3.14。所述 AksD 可以是 EC4.2.1 中的，例如 EC4.2.1.33。所述 AksF 可以是 ECl.1.1中的，例如ECl.1.1.85。I種或多種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更 多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、12種或更多種、14種或更多種、18種或更多種、或20種或更多種)α-酮酸鏈延伸酶可來自產(chǎn)甲烷菌細(xì)菌。
[0102]在所述方法中，催化醇脫氫的酶可包括醇脫氫酶。所述醇脫氫酶可包括EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。它還可以是例如,來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的丁醇脫氫酶、酵母屬ADHIV、和來自釀酒酵母(S.cerevisiae)的ADH6。
[0103]用在本文方法中的PCoA或PACP可源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA。乙酰-CoA可源自可再生原料，其包括纖維素原料、糖、甘油或脂肪酸。此外，乙酰-CoA可源自合成氣、甲烷或甲醇。苯甲酰-CoA可源自多環(huán)芳香烴。
[0104]用在本文方法中的2，6DAP可由缺乏二氨基庚二酸脫羧酶的產(chǎn)賴氨酸生物體產(chǎn)生。2，6DAP源自可再生原料，其可含有糖。
[0105]本文特征為生物衍生的尼龍-7、尼龍-7，X、尼龍-X，7和聚酯。它還包括通過包括聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍_7，其中所述7AHA源自PAS或AAS。本文還提供通過包括聚合PA和1，7DHA的工藝產(chǎn)生的尼龍_7，7，其中所述PA源自PCoA ；PACP ;或2HDA而1，7DHA源自7AM。本文還包括通過包括聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍_7，其中7AHA由上述任一種導(dǎo)致7AHA產(chǎn)生的方法制備。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過包括聚合1，7DHA和PA的工藝產(chǎn)生的尼龍7，7，其中1，7DHA由上述任一種導(dǎo)致1，7DHA產(chǎn)生的方法制備，而PA由上述任一種導(dǎo)致PA產(chǎn)生的方法制備。
[0106]本文還提供一種基本純的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中以實(shí)質(zhì)的量包含并表達(dá)一種或多種編碼涉及生物合成選自以下的一種或多種聚合物單體的一種或多種酶的外源核酸:7AHA ；PA ；1, 7DAH ；ENTL ;和7HHA。這些酶包括?；?CoA還原酶、?；鵢[acp]還原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、羧酸還原酶、脂肪-?；鵆oA還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、α-酮酸脫羧酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶、和催化α-酮酸鏈延伸的酶。如本文中使用的，“實(shí)質(zhì)的量”為培養(yǎng)物中至少10%(例如至少:20% ；30% ；40% ；50% ；60% ；70% ；75% ；80% ；85% ；90% ；95% ；97% ；98% ；99% ;或甚至100%)的細(xì)胞。
[0107]所述培養(yǎng)物的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如且無限制地，大腸桿菌(Escherichiacoli)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘氨醇單胞菌(sphingomonads)、假單胞菌(pseudomonad)、產(chǎn)甲燒菌細(xì)菌(例如Methanobacterium autotrophicum)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、沙門氏菌屬(Salmonella)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacteria)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、短桿菌屬(Brevibacterium)、鏈球菌屬(streptococci)、乳桿菌屬(Iactobacilli)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、梭菌屬(Clostridium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和節(jié)桿菌屬(Arthobacter)。
[0108]或者，所述培養(yǎng)物的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞可以使如且無限制地，解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iipolytica)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、絲抱酵母屬(Trichosporon)、伊薩酵母屬(Issatchenka)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)。假絲酵母細(xì)胞可以是酵母如且無限制地,熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、白色假絲酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.gui I lermondi 1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis和C.zeylenoides的。其他真菌細(xì)胞可以是真菌如且無限制地，曲霉屬(Aspergillus)、外瓶霉屬(Exophiala)、毛霉屬(Mucor)、木霉屬(Trichoderma)、枝抱屬(Cladosporium)、平革菌屬(Phanerochaete)、Cladophialophora、擬青霉屬(Paecilomyces)、Scedosporium 和 Ophiostoma 的。
[0109]可由所述細(xì)胞表達(dá)的外源酶如下。所述氨裂合酶可包括EC4.3.1中的氨裂合酶，例如 EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ；或 EC4.3.1.24。所述烯酸還原酶可包括ECl.3.1中的烯酸還原酶，例如ECl.3.1.31。所述羧酸還原酶包括ECl.2.99中的羧酸還原酶，例如ECl.2.99.6。所述ω -轉(zhuǎn)氨酶可包括EC2.6.1中的轉(zhuǎn)氨酶，例如 EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 jEC2.6.1.68。所述硫酯酶可包括EC3.1.2中的硫酯酶，例如EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 ;*EC3.1.2.20。所述酸-硫醇連接酶可包括EC6.2.1中的酸-硫醇連接酶，例如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 jEC6.2.1.23。所述CoA轉(zhuǎn)移酶可包括EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶，例如EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。所述氨基轉(zhuǎn)移酶可包括EC2.6.1中的氨基轉(zhuǎn)移酶，例如EC2.6.1.67。所述羰基還原酶可包括EC.1.1.1.184。所述脂肪-酰基-CoA還原酶可包括ECl.2.1中的脂肪-?；?CoA還原酶，例如ECl.2.1.50。所述醛脫氫酶可包括ECl.2.1中的醛脫氫酶，例如ECl.2.1.4或ECl.2.1.63。所述水裂合酶包括EC4.2.1中的水裂合酶， 例如EC4.2.1.2 ；EC4.2.1.59 ；4.2.1.61 ；4.1.2.17 或4.1.2.18。所述催化 α -酮酸鏈延伸的酶可包括包含AksA、AksD、AksE和AksF酶的組中的一種或多種酶。所述AksA可包括EC2.3.3中的AksA酶，例如EC2.3.3.13或2.3.3.14。所述AksD可包括EC4.2.1中的AksD 酶，例如 EC4.2.1.33。所述 AksF 可包括 ECl.1.1 中的 AksF 酶，例如 ECl.1.1.85。所述醇脫氫酶可包括，例如EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。另外，所述醇脫氫酶可包括例如，來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌的丁醇脫氫酶、酵母屬ADHIV和來自釀酒酵母的ADH6。
[0110]本文的另一個(gè)方面是分離的宿主細(xì)胞，其包含并表達(dá)一種或多種編碼涉及選自7AHA ；PA ;1，7DAH ；ENTL ;和7HHA的一種或多種聚合物單體的生物合成的一種或多種酶的外源核酸。所述酶包括酰基CoA還原酶、?；?[acp]還原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、羧酸還原酶、脂肪-酰基CoA還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、α-酮酸脫羧酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶、和催化α-酮酸鏈延伸的酶。所述細(xì)胞和酶可以是上文對(duì)基本純的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物所描述的那些中的任一種。
[0111]從本文中列出的下文詳細(xì)說明考慮，其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。
[0112]附圖簡述
[0113]圖1是顯示庚二酸半醛到可用于尼龍7、尼龍7，7和尼龍7，χ生產(chǎn)以及聚酯的各種雙官能C7烷的生物轉(zhuǎn)化的示意圖。 [0114]圖2是從庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]或α -酮辛二酸(均為如指示的天然存在途徑中的中間物)形成庚二酸半醛的示意圖。
[0115]圖3是α-酮酸鏈延伸中的系列反應(yīng)的示意圖。牽涉3種基本反應(yīng):α-酮二酸與乙酰-CoA之間縮合以形成檸檬酸同源物，檸檬酸同源物異構(gòu)化為異檸檬酸同系物，和異檸檬酸同系物氧化脫羧為ct -酮二酸，其含有另外的亞甲基基團(tuán)[Howel 198:HowelIDM, Harich K, Xu H, White RH (1998).Alpha-keto acid chain elongation reactionsinvolved in the biosynthesis of coenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threoninephosphate) in methanogenic Archaea.^Biochemistry 1998; 37 (28) ; 10108-17]。
[0116]這些反應(yīng)類似于在TCA循環(huán)I (原核)循環(huán)中由檸檬酸合酶、順烏頭酸酶(aconitase)和異檸檬酸脫氫酶催化的反應(yīng)，以及在賴氨酸生物合成V中由(R)-高檸檬酸合酶、高順烏頭酸酶(homoaconitase)和(_)_蘇型-異高檸檬酸脫氫酶催化的反應(yīng)[Howell, 1998，見上]。
[0117]圖4是經(jīng)由3個(gè)丙二酰-CoA的縮合形成庚二酰-CoA的示意圖。
[0118]圖5是在生物素生物合成途徑II中從庚二酸或7-酮-8-氨基壬酸酯生物合成中的其他前體形成庚二酰-CoA的示意圖。7-酮-8-氨基壬酸酯是生物素生物合成的關(guān)鍵中間物。庚二酰-CoA在宿主生物中的降解可由BioF的缺失或失活阻止，該基因編碼7-酮-8-氨基壬酸合成酶(E.C.2.3.1.47)。
[0119]圖6是生物素生物合成途徑I中7-酮-8-氨基壬酸生物合成中庚二酰-[acp]或其甲基酯形成的示意圖。生物素生物合成中的關(guān)鍵中間物。庚二酸或庚二酸半醛可從這些前體制備，其通過aaaS (?；鵄CP合成酶)、FatA (脂肪?；鵄CP硫酯酶A) ,FatB (脂肪?；鵄CP硫酯酶B)或?；?[acp]還原酶的作用，如粗體顯示的。[0120]圖7是顯示從苯甲酸形成庚二酰-Cok或環(huán)己烷羧酸降解的示意圖。
[0121]圖8是顯示鞘氨醇單胞菌和棒狀桿菌菌種中萘滿降解途徑中庚二選半醛形成的示意圖。
[0122]圖9是顯示通過產(chǎn)甲烷菌在環(huán)己烷羧酸途徑中從巴豆酸酯形成庚二酰-CoA的示意圖。參見 Mouttaki 等,Applied and Environmental Microbiology, 930-938 頁(2001)。
[0123]圖10是顯示從作為起點(diǎn)的D，L- 二氨基庚二酸經(jīng)由2-氨基庚二酸到庚二酸半醛和7-氨基庚酸的工程化途徑例子的示意圖。從2-氨基庚二酸到庚二酸半醛有兩條路徑，經(jīng)由通過氨裂合酶的還原性脫氨基化到2-庚烯二酸，或經(jīng)由α-酮酸的形成，其可隨后轉(zhuǎn)化成庚二酸或其CoA酯?；蛘?，源自2-氨基庚二酸的α-酮-庚二酸可進(jìn)行一輪鏈延伸為α-酮-辛二酸，其可脫羧以形成庚二酸半醛或轉(zhuǎn)化成α-氨基辛二酸，α-氨基辛二酸在脫羧時(shí)直接產(chǎn)生7-氨基庚酸。α-酮-庚二酸還可源自α-酮-己二酸，其相應(yīng)地可源自α-酮-戊二酸，經(jīng)由兩輪連續(xù)的α-酮酸鏈延伸。
[0124]圖1lA顯示對(duì)來自無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)氨裂合酶蛋白表達(dá)的可溶和不可溶級(jí)分的SDS-PAGE分析。
[0125]圖1lB顯不對(duì)來自假破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum) (15)和米曲霉(Aspergillus oryzae) (16)氨裂合酶蛋白表達(dá)的可溶和不可溶級(jí)分的SDS-PAGE分析。
[0126]圖12顯示對(duì)來自諾卡氏菌屬菌種羧酸還原酶基因表達(dá)的可溶和不可溶級(jí)分的SDS-PAGE 分析。
[0127]圖13顯示由于 通過諾卡氏菌CAR還原酶活性庚二酸到庚二酸半醛的還原在吸光度中隨時(shí)間的變化。
[0128]圖14顯示對(duì)來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) YciA硫酯酶蛋白(18)表達(dá)的可溶和不可溶級(jí)分的SDS-PAGE分析。
[0129]圖15顯示對(duì)氨基轉(zhuǎn)移酶IlvE-Omega Vf融合物(pING2022)和IlvE-Ad優(yōu)化的omega融合物(pING2030)蛋白的SDS-PAGE分析。
[0130]圖16顯示丙酮酸鈉和7-氨基庚酸生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果，連同7-氨基庚酸底物和L-丙氨酸產(chǎn)物的測(cè)量濃度。
[0131]圖17顯示在48和96小時(shí)后6種生物轉(zhuǎn)化中L-和D_2_氨基辛二酸對(duì)映異構(gòu)體濃度的HPLC結(jié)果匯總。
[0132]圖18顯不對(duì)來自大腸桿菌GadA(129)、大腸桿菌LysA(130)、大腸桿菌GadAilvE(I31)和大腸桿菌LysA ilvE(I32)蛋白表達(dá)的珠裂解的可溶和不可溶級(jí)分的SDS-PAGE分析。
[0133]圖19顯示來自2-氨基辛二酸脫羧的7-氨基庚酸的形成。
[0134]圖20顯示使用ClustalW算法的蛋白質(zhì)比對(duì)，其顯示MJ0277與comD(SEQ ID41)/comE(SEQ ID42)蛋白之間的顯著同源性。
[0135]圖21顯不MJ0277對(duì)來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的LACLA乙酸乳酸合酶(SEQ ID43)的同源性。
[0136]圖22 顯不對(duì) LACLA 乙酸乳酸合酶、來自 Methanocella paludicola 的 comD/comE和假定的乙酰乳酸合酶MJ0277中功能域的分析顯示其均具有含硫胺磷酸結(jié)合位點(diǎn)的類似結(jié)構(gòu)。[0137]圖23繪出pING2022載體圖譜，其含有IlvE-Omega Vf融合基因。
[0138]圖24繪出pING2030載體圖譜，其含有IlvE-Ad優(yōu)化的omega融合基因。
[0139]圖25 列出 SEQ.1D1-40。
[0140]發(fā)明詳述
[0141]一般地，本公開涉及用于生物合成性產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷的方法和材料，所述雙官能或三官能C7烷可用作生產(chǎn)尼龍-7、尼龍-7，X和尼龍-X，7以及生產(chǎn)聚酯中的中間物。
[0142]在一些實(shí)施方案中，I種或多種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、 13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種)分離的酶(例如氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、硫酯酶、羧酸還原酶、脂肪-?；鵆oA還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、α-酮酸脫羧酶、催化α -酮酸鏈延伸的酶、?；鵄CP合成酶、FatA(脂肪?；鵄CP硫酯酶A)、FatB(脂肪?；鵄CP硫酯酶B)、或?；鵢[acp]還原酶)可用于生物合成性產(chǎn)生所述雙官能或三官能C7烷。這類酶可自表達(dá)編碼所述酶的外源核酸的重組細(xì)胞或天然表達(dá)所述酶的非重組細(xì)胞分離。
[0143]在一些實(shí)施方案中，包含I種或多種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種；或甚至更多種)編碼I種或多種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種；或甚至更多種)酶(例如一種或多種(如上文)的氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、硫酯酶、羧酸還原酶、脂肪-?；鵆oA還原酶、ω -轉(zhuǎn)氨酶、α -酮酸脫羧酶、催化α -酮酸鏈延伸的酶、?；?ACP合成酶、FatA, FatB、或?；鵢[acp]還原酶)的外源核酸的重組宿主，或從這類重組宿主或天然表達(dá)所述酶的非重組細(xì)胞制備的裂解物可用于生物合成性產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷。重組宿主還可在一種或多種內(nèi)源性酶中具有缺陷以使代謝中間物轉(zhuǎn)向雙官能或三官能C7烷的產(chǎn)生。
[0144]如本文中描述的，生物合成性產(chǎn)生的雙官能或三官能C7烷可用于生產(chǎn)尼龍_7、尼龍_7，X、或尼龍-X，7、以及聚酯。術(shù)語“尼龍-7”是通過單體7-氨基庚酸的聚合作用或通過庚內(nèi)酰胺的開環(huán)縮合產(chǎn)生的聚酰胺。尼龍-7也稱為“聚庚酰胺(polyenanthamide) ”或“聚庚酰胺(polyheptanamide) ”。
[0145]術(shù)語“尼龍-X，7”指通過庚烷-1，7- 二元酸(亦稱為庚二酸或庚二酸酯)與二胺的聚合作用產(chǎn)生的聚酰胺家族。整數(shù)X指示庚烷-1，7- 二元酸與之反應(yīng)的二胺中的碳原子數(shù)。在一些實(shí)施方案中，整數(shù)X是大于3的整數(shù)，例如大于5、大于7、或大于9。例如，尼龍_5，7通過將庚烷-1，7- 二元酸與1，5-戊二胺反應(yīng)產(chǎn)生。尼龍7，7通過將庚烷-1，7- 二元酸與1，7 二氨基庚烷反應(yīng)產(chǎn)生。
[0146]術(shù)語“尼龍_7，X”指通過七亞甲基二胺與二羧酸的聚合反應(yīng)產(chǎn)生的聚酰胺家族。整數(shù)χ指示七亞甲基二胺與之反應(yīng)的二羧酸中的碳原子數(shù)。例如，尼龍_7，5通過七亞甲基二胺(亦稱為1，7- 二氨基庚烷或1，7-庚二胺)與戊烷-1，5- 二元酸的反應(yīng)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，整數(shù)χ是大于3的整數(shù),例如大于5、大于7、或大于9。
[0147]術(shù)語“聚酯”指在其主鏈中含有酯官能團(tuán)的聚合物種類。聚酯可以是同型聚合物，例如通過己內(nèi)酯的開環(huán)縮合產(chǎn)生的聚己內(nèi)酯。共聚物聚酯通過多官能醇和酸的酯化縮合形成。例如，己二酸和乙二醇用于產(chǎn)生聚乙烯己二酸。庚二酸在這類共聚物中可替換己二酸使用。或者，7-羥基庚酸可用于產(chǎn)生聚庚醇內(nèi)酯(polyenantholactone)。
[0148]現(xiàn)將以更多關(guān)于本文中描述的所述方案的細(xì)節(jié)來描述本發(fā)明的前述方面和其他方面。應(yīng)領(lǐng)會(huì)本發(fā)明可以不同形式實(shí)施且不應(yīng)解釋為限制本文中列出的實(shí)施方案。更確切地，這些實(shí)施方案的提供使得本公開為全面且完整的，并將向本領(lǐng)域技術(shù)人員告知本發(fā)明的范圍。
[0149]1.1 定義
[0150]本文發(fā)明描述中使用的術(shù)語學(xué)僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，且不意圖限制本發(fā)明。如在本發(fā)明實(shí)施方案的描述和所附權(quán)利要求中使用的，除非上下文另外清楚地指示，單數(shù)形式“一 / 一個(gè)/ 一種”和“該”還意圖包括復(fù)數(shù)形式。而且，如本文中使用的，“和/或”意指并涵蓋一種或多種所列關(guān)聯(lián)項(xiàng)的任意和所有可能組合。除非另外定義，描述中使用的所有術(shù)語，包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。
[0151]如本文中使用的，術(shù)語“酶”指能夠催化反應(yīng)的蛋白質(zhì)催化劑。本文中該術(shù)語不僅指分離的酶，而且還包括表達(dá)該酶的宿主細(xì)胞。因此，通過酶C的A到B的轉(zhuǎn)化還應(yīng)理解為涵蓋通過表達(dá)酶C的宿主細(xì)胞的A到B的轉(zhuǎn)化。
[0152]如本文中使用的，術(shù)語“雙官能C7烷”指直鏈或支鏈、飽和或不飽和的具有7個(gè)碳原子和兩個(gè)官能團(tuán)的烴。所述官能團(tuán)可置于沿?zé)N鏈的任何點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)位于烴鏈的末端(例如在每個(gè)末端各一個(gè)官能團(tuán))。該術(shù)語還意圖涵蓋環(huán)狀化合物如庚內(nèi)酰胺。例示性雙官能C7烷包括但不限于，庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]、庚烷-1，7- 二元酸(庚二酸或庚二酸鹽)、7_氨基庚酸、7-羥基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醇、7-氨基庚醛、庚內(nèi)酰胺、庚二酸半醛(亦稱為7-氧庚酸)、2_庚烯二酸和2-庚烯二酸-CoA0
[0153]如本文中使用的，術(shù)語酸酯(-oate) ”和酸(_oic acid) ”例如庚酸酯和庚酸可交換使用。此外，應(yīng)理解“鹽/酯(-ate)，，、“_酸酯(-oate) ”和酸(-oic acid) ”可貫穿交換使用以指示處于其中性或離子化形式和所謂的“兩性離子”形式中任一種的化合物。
[0154]如本文中使用的，術(shù)語“三官能C7烷”指直鏈或支鏈、飽和或不飽和的具有7個(gè)碳原子和三個(gè)官能團(tuán)的烴。所述官能團(tuán)可置于沿?zé)N鏈的任何點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，3個(gè)官能團(tuán)中有兩個(gè)位于烴的末端(例如在每個(gè)末端各一個(gè)官能團(tuán))。例示性三官能C7烷包括但不限于，2-氧庚二酸鹽(α -酮庚二酸鹽)、2_氨基庚二酸鹽(α -氨基庚二酸鹽)、2_羥基庚二酸鹽(α -羥基庚二酸鹽)和2-羥基庚二酸鹽-CoA ( α -羥基庚二酸鹽-CoA)。
[0155]如本文中使用的，術(shù)語“官能團(tuán)”指胺基團(tuán)、羧酸基團(tuán)、醛基團(tuán)、醇基團(tuán)、輔酶A基團(tuán)或酮基團(tuán)。術(shù)語“胺基團(tuán)”指-NH2基。術(shù)語“羧酸基團(tuán)”指-COOH基。術(shù)語“醛基團(tuán)”指-C(O)H基。術(shù)語“醇基團(tuán)”指-OH基。術(shù)語“酮基團(tuán)”指C(O)基。
[0156]術(shù)語“輔酶A基團(tuán)”指有機(jī)輔因子或輔基(酶的非蛋白部分)，其存在是形成活性酶系統(tǒng)的許多酶(脫輔基酶蛋白)的活性所需要的。輔酶A在特定濃縮酶中有功能，作用于乙酰或其他?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移和脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和其他乙?；?br> [0157]術(shù)語“acp”或“?；d體蛋白”指從乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A挑出乙酰和丙二?；鶊F(tuán)且通過縮合將其連接以形成β_酮酸酰基載體蛋白，并釋放二氧化碳和該?；d體蛋白的巰基形式的蛋白質(zhì)(其通常在脂肪酸合成中有活性)。
[0158]雙官能或三官能C7烷上的官能團(tuán)可以是相同或不同的:例如，在雙官能C7烷的一些實(shí)施方案中，兩個(gè)官能團(tuán)可以均為胺基團(tuán)，兩個(gè)官能團(tuán)可以均為羧酸基團(tuán)，或兩個(gè)官能團(tuán)可以均為醇基團(tuán)。
[0159]在一些實(shí)施方案中，雙官能C7烷上的一個(gè)官能團(tuán)是胺基團(tuán)而另一個(gè)是羧酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，雙官能C7烷上的一個(gè)官能團(tuán)是醇基團(tuán)而另一個(gè)是羧酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，雙官能C7烷上的一個(gè)官能團(tuán)是醇基團(tuán)而另一個(gè)是胺基團(tuán)。
[0160]在三官能C7烷的一些實(shí)施方案中，兩個(gè)官能團(tuán)是羧酸基團(tuán)而一個(gè)官能團(tuán)是酮基團(tuán)或羥基基團(tuán)或氨基基團(tuán)。
[0161]術(shù)語“異源”用于本文指并非源自與宿主細(xì)胞相同物種的細(xì)胞的任何核酸或多肽。因此，如本文中使用的， “同源”核酸或蛋白質(zhì)是那些存在于與宿主細(xì)胞相同物種的細(xì)胞中或由其產(chǎn)生的核酸或蛋白質(zhì)。
[0162]如本文中關(guān)于核酸和具體宿主細(xì)胞使用的，術(shù)語“外源”指不像自然界中發(fā)現(xiàn)的存在于具體細(xì)胞中(且不能從中獲得)的任何核酸。如此，非天然存在的核酸一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞即視為對(duì)該宿主細(xì)胞外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸序列的核酸子序列或片段，只要該核酸作為整體不存在于自然界中。例如，表達(dá)載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞即視為對(duì)該宿主細(xì)胞為外源的，因?yàn)樵摵怂岱肿幼鳛檎w(基因組DNA加載體DNA)不存在于自然界中。如此，作為整體不存在于自然界中的任何載體、自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或皰疹病毒)視為非天然存在的核酸。由此通過PCR或限制內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段以及cDNA也視為非天然存在的核酸，因?yàn)樗鼈冏鳛槲匆娪谧匀唤绲姆珠_的分子存在。亦由此任何以未見于自然界中的排布含有啟動(dòng)子序列和多肽編碼序列(例如cDNA或基因組DNA)的核酸分子也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是對(duì)具體細(xì)胞外源性的。例如，從酵母X的細(xì)胞分離的完整染色體一旦將該染色體導(dǎo)入酵母y的細(xì)胞中時(shí)即為酵母I細(xì)胞的外源性核酸。
[0163]從上文來看，“外源性”核酸可以是“同源”或“異源”核酸將是清楚的。相反，如本文中關(guān)于核酸或基因(或由核酸或基因編碼的蛋白質(zhì))和具體細(xì)胞使用的術(shù)語“內(nèi)源性”指如在自然界中發(fā)現(xiàn)的確實(shí)存在于具體細(xì)胞中(且可從中獲得)的任何核酸或基因。
[0164]如本文中使用的，術(shù)語“重組宿主”指其基因組已通過至少外源性核酸序列擴(kuò)大的宿主。這類核酸序列包括但不限于，不天然存在于宿主中的核酸(即異源核酸)、不正常轉(zhuǎn)錄成RNA或翻譯成蛋白質(zhì)(“表達(dá)”)的DNA序列、和期望導(dǎo)入非重組宿主中的其他核酸序列(例如改變具體核酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))。會(huì)領(lǐng)會(huì)本文中描述的重組宿主的基因組通常經(jīng)由一種或多種外源核酸的穩(wěn)定導(dǎo)入得到擴(kuò)大。一般地，所述外源核酸原始不存在于作為DNA受體的宿主中(即它是異源核酸)，但從給定宿主分離核酸然后將該核酸的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝導(dǎo)入相同宿主中，例如以增強(qiáng)編碼產(chǎn)物的產(chǎn)生或改變核酸的表達(dá)模式，是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。在一些情況下，外源核酸將修改或甚至替換內(nèi)源基因或DNA序列，其通過例如同源重組或定點(diǎn)誘變。內(nèi)源基因的修改或替換可導(dǎo)致特定編碼產(chǎn)物例如酶的缺陷。合適的重組宿主記載于下文。重組宿主還可含有不包含在宿主細(xì)胞基因組中但附加存在(并復(fù)制，優(yōu)選地)于細(xì)胞中的核酸。
[0165]如本文中使用的，“啟動(dòng)子”指使得基因能轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動(dòng)子被RNA聚合酶識(shí)別，然后該酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。如此，啟動(dòng)子含有由RNA聚合酶直接結(jié)合或涉及RNA聚合酶招募的DNA序列。啟動(dòng)子序列還可包含“增強(qiáng)子區(qū)”，其為可由蛋白質(zhì)(即反式作用因子，很大程度上像一組轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合以增強(qiáng)基因簇中基因轉(zhuǎn)錄水平(得名由來)的一個(gè)或多個(gè)DNA區(qū)。通常在編碼區(qū)5’端的增強(qiáng)子也可與啟動(dòng)子序列分開，且可以例如位于基因的內(nèi)含子區(qū)中或在基因編碼區(qū)的3’。
[0166]如本文中使用的，“可操作連接”意指摻入遺傳構(gòu)建體中從而使得表達(dá)控制序列有效控制感興趣編碼序列的表達(dá)。
[0167]1.2 原料
[0168]多種不同原料可用于產(chǎn)生二或三官能烷。在一些實(shí)施方案中，使重組宿主細(xì)胞或從細(xì)胞(例如重組宿主細(xì)胞)制備的裂解物與可再生原料接觸以產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷如7-氨基庚酸?？捎米魈荚吹目稍偕系睦影ǖ幌抻?，纖維素原料、植物源的糖類和脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞接觸的原料是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸或甘油。
[0169]除了如上文所列那些的可再生原料以外，可將重組宿主細(xì)胞修飾為在作為碳源的合成氣(亦稱為SynGas)上生長。在這一具體的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞工程化以提供用于利用合成氣或其他氣體碳源來產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷的有效代謝途徑。
[0170]另外，可以使本文中描述的重組宿主或從重組宿主細(xì)胞制備的裂解物與芳香烴原料接觸。芳香烴原料代替可再生原料的使用提供了一種將這類石油源材料轉(zhuǎn)化成對(duì)環(huán)境更有益的化合物的方式，從而降低環(huán)境影響。合適的芳香烴原料的例子包括但不限于，甲苯、苯、苯酸和莽草酸(shikimate)。
[0171]1.3.包括酶催化步驟的到雙官能C7烷的路徑
[0172] 如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于在存在一種或多種分離的酶、存在表達(dá)該酶/那些酶的重組宿主細(xì)胞、或存在表達(dá)該酶的細(xì)胞(例如重組細(xì)胞)的細(xì)胞裂解物(或部分純化的裂解物)的情況下產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷的方法。在一些實(shí)施方案中，雙官能或三官能C7烷的產(chǎn)生開始于庚二酸鹽或庚二酰-CoA，且經(jīng)由通用中間物即庚二酸半醛進(jìn)行。具體地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生雙官能C7烷7-氨基庚酸的方法，其通過使用催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶。見圖1?？梢允褂冒肴┌被D(zhuǎn)移酶如ω-轉(zhuǎn)氨酶。例示性轉(zhuǎn)氨酶包括但不限于分類在EC2.6.1下的轉(zhuǎn)氨酶，如EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 JPEC2.6.1.68。在一些實(shí)施方案中，所述氨基轉(zhuǎn)移酶是分類在EC2.6.1.18中的β -丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其來自V.fluvialis、B.weihenstephanensis、銅綠假單胞菌(P.aureginosa)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、或丁香假單胞菌(P.syringae)。參見W02011/031147，其通過提述完整并入本文。
[0173]在一些實(shí)施方案中，7-氨基庚醛可使用催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脫氫的酶產(chǎn)生。見圖1?？墒褂梅诸愒贓Cl.2.1下的醛脫氫酶，如ECl.2.1.4或ECl.2.1.63從
7-氨基庚酸產(chǎn)生7-氨基庚醛。
[0174]在一些實(shí)施方案中，七亞甲基二胺(亦稱為1，7-二氨基庚烷)可從7-氨基庚醛產(chǎn)生，其使用催化氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶。見圖1。合適的氨基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于，EC2.6.1中的氨基轉(zhuǎn)移酶如EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ;和EC2.6.1.68。在一些實(shí)施方案中，所述氨基轉(zhuǎn)移酶是分類在EC2.6.1.18 中的 β -丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其來自 V.f luvialis、B.weihenstephanensis、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、或丁香假單胞菌。參見W02011/031147，其通過提述完整并入本文。
[0175]在一些實(shí)施方案中，庚內(nèi)酰胺可使用催化7-氨基庚酸的酰胺水解的酶從7-氨基庚酸產(chǎn)生。見圖1。可使用合適的酰胺水解酶包括分類在EC3.5.2如EC3.5.2.12或EC3.5.2.1下的酰胺轉(zhuǎn)移酶。
[0176]在一些實(shí)施方案中，7-羥基庚酸自庚二酸半醛產(chǎn)生或7-氨基庚醇自7-氨基庚醛產(chǎn)生，其使用催化醛還原的酶。見圖1。例如，可使用分類在ECl.1.1如ECl.1.1.21下的醇脫氫酶。 [0177]在一些實(shí)施方案中，1，7庚二醇可自7-羥基庚酸產(chǎn)生，其使用醛脫氫酶和醇脫氫酶。合適的醛脫氫酶可以使分類在ECl.2.1 (例如ECl.2.1.4)下的。見圖1。合適的醇脫氫酶可以使分類在E.C.1.1.1.如ECl.1.1.1下的。
[0178]在其中C7 二或三官能烷可能對(duì)宿主有毒性(例如半醛如7-氧庚酸或7-氨基庚醛)的實(shí)施方案中，對(duì)毒性化合物的轉(zhuǎn)化可以在體外實(shí)施，其使用分離的酶或來自重組宿主的裂解物。在一些實(shí)施方案中，毒性化合物由宿主產(chǎn)生，然后轉(zhuǎn)化(使用分離的酶、表達(dá)酶的重組宿主、或化學(xué)轉(zhuǎn)化)成庚內(nèi)酰胺。
[0179]1.5庚二酸和/或庚二酰-CoA的生物合成途徑
[0180]庚二酸和/或庚二酰-CoA可經(jīng)由許多不同的方式獲得，包括:(i)從α-酮酸鏈延伸途徑產(chǎn)生的α-酮辛二酸，或(ii)生物素生物合成途徑I ; (iii)生物素生物合成途徑II ； (iv)三個(gè)丙二酰-CoA分子到單個(gè)庚二酰-CoA分子的縮合；(V)苯甲酸降解途徑；(vi)環(huán)己烷羧酸酯途徑，(vi)D，L-二氨基庚二酸途徑；和(vii)其中起始碳源是巴豆酸酯(crotonate)的生物合成途徑。見圖2。這些到庚二酸和/或庚二酰-CoA的途徑在下文以更多細(xì)節(jié)描述。
[0181]在其中任一種途徑中，庚二酸可從庚二酰-CoA產(chǎn)生，其使用催化硫酯水解的酶。例如，能水解硫酯的酶包括但不限于，硫酯酶、酸-硫醇連接酶和CoA轉(zhuǎn)移酶。合適的硫酯酶包括分類在EC3.1.2中的硫酯酶，如EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 jEC3.1.2.20。例如，可使用以下一種酶:分類在EC3.1.2中的硫酯水解酶/?；?CoA硫酯酶如EC3.1.2.19和
3.1.2.18中的ADP依賴性中等鏈?；?CoA水解酶、EC3.1.2.20中的?；鵆oA水解酶；或EC3.1.2.3.中的水解酶。合適的酸-硫醇連接酶包括分類在EC6.2.1中的酸-硫醇連接酶，如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 ;和EC6.2.1.23。合適的CoA轉(zhuǎn)移酶包括分類在EC2.8.3下的 CoA 轉(zhuǎn)移酶如 EC2.8.3.6、EC2.8.3.8、EC2.8.3.12 或 EC2.8.3.13。
[0182]庚烷-1，7-二元酸可從庚二酰-[acp]獲得,其通過使用作用于[acp]-硫酯的酶，如EC2.3.1.38 ([酰基載體蛋白]S-乙酰轉(zhuǎn)移酶)或EC3.1.2.14中的水解酶，如fatA和fatBo或者,庚二酸可從庚二酰_[acp]甲基酯獲得,其通過由AaasaS (?；?ACP合成酶)水解酯鍵，接著通過脂肪酶/酯酶除去甲基基團(tuán)。
[0183]庚二酸可轉(zhuǎn)化成庚二酸半醛，其使用催化羧酸還原的酶。合適的還原酶包括但不限于，分類在ECl.2.99中的羧酸還原酶或分類在ECl.2.1如ECl.2.1.50中的脂肪酰基CoA還原酶。在一些實(shí)施方案中，脂肪-?；?CoA還原酶可直接將庚二酰-CoA或庚二酰_[acp]轉(zhuǎn)化成庚二酸半醛。ECl.2.99中的例示性羰基還原酶包括但不限于來自諾卡氏菌菌種(Aimin 等,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881 (2004)，通過提述并入)或灰色鏈霉菌(S.griseus) (Suzuki 等，J.Antibiot.(Tokyo) 60:380—387 (2007),通過提述并入)的ECl.2.99.6。ECl.2.1中的例示性羰基還原酶包括但不限于來自例如C.aurantiacus (Hugler, M,等，J.Bacteriology 184:2404-2410 (2002),通過提述并入)、M.sedula (Kockelkorn, D.和 Fuchs, G., J.Bacteriologyl91:6352-6362 (2009)，通過提述并入)、或S.tokodai (Alber, B.等，J.Bacteriologyl88:8551-8559 (2006)，通過提述并入)的ECl.2.1.75 ;和來自以下的 1.2.1.50:例如不動(dòng)桿菌屬菌種 A.platyrhynchos (Ishige, T.,等,Appl.Envtl Microbiology68:1192-1195 (2002)，通過提述并入)、擬南芥(A.thaliana)(Doan, T.T.,等，Journal Plant Physiologyl66:787-796 (2009)和 Hooks, Μ.A.,等，PlantJ.20:1-13 (1999)，兩者均通過提述并入);人(Homo sapiens) (McAndrew, R.P.等，J.Biol.Chem.283:9435-9443 (2008)，通過提述并入)、小家鼠(M.Musculis)、P.1eiognath1、明亮發(fā)光桿菌(P.phosphoreum)、豌豆(P.sativum)、或 S.chinesis 的 1.2.1.50。
[0184]1.5.1 α - 酮酸鏈延伸
[0185]二官能烷可從α-酮戊二酸產(chǎn)生，其經(jīng)由本領(lǐng)域中已知的到0-酮己二酸、0-酮庚二酸或α-酮辛二酸的連續(xù)鏈延伸反應(yīng)。參見例如圖3和W02010/068944。α-酮二元酸(Cn，n=5-8)或相應(yīng)2-氨基二元酸的脫羧然后提供Cn-1例如C4-7的α，ω-雙官能烷的前體。這些連續(xù)的alpha-酮酸鏈延伸反應(yīng)發(fā)生在輔酶B生物合成途徑中，如在產(chǎn)甲烷細(xì)菌如詹氏甲燒球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、沃氏甲燒球菌(Methanococcus voltae)和嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcinathermophila)中闡明的。
[0186]從a-酮戊二酸(C5)到α -酮辛二酸的3輪連續(xù)的鏈延伸由在底物上作用3次的3個(gè)相同酶催化(且在EC4.2.1.114 (AksD (3-異丙基蘋果酸脫水酶大亞基)/AksE (3-異丙基蘋果酸脫水酶小亞基))的情況中6次)，每次增加鏈長度。見圖3。這些酶包括但不限于:EC2.3.3.14:高檸檬酸合酶/AksA(alpha-異丙基蘋果酸合酶)，其作用于α -酮戊二酸、α-酮己二酸和α -酮庚二酸；EC4.2.1.114:高順烏頭酸酶或AksD/AksE，其催化(R)-高檸檬酸、二高檸檬酸和三高檸檬酸的脫水反應(yīng)，以及順式-高烏頭酸、順式_(高)2烏頭酸和順式_(高)3烏頭酸的水合反應(yīng)；和ECl.1.1.87:高異檸檬酸脫氫酶或AksF (多功能3-異丙基蘋果酸脫氫酶/D-蘋果酸脫氫酶)，其催化高異檸檬酸、蘇型-異(高)2檸檬酸和蘇型-異(高)3檸檬酸的NAD (P) +依賴性氧化性脫羧。
[0187]例示性AksA酶包括但不限于，EC2.3.3中的那些，如EC2.3.13或2.3.3.14。例示性AksD酶包括EC4.2.1中的那些，如EC4.2.1.33。例示性AksF酶包括但不限于ECl.1.1中的酶，如ECl.1.1.85。
[0188]在一些實(shí)施方案中，所述鏈延伸酶是AksA MTH1630、AksD MTH1631、AksE MTH0829或AksF MTH1388。參見，例如W02010/104391，其通過提述并入本文。
[0189]該途徑的優(yōu)點(diǎn)在于其僅需要這3種異源蛋白質(zhì)在宿主中的重組表達(dá)。從α-酮戍二酸到α -酮己二酸的鏈延伸還發(fā)生在古細(xì)菌，包括Aeropyrum pernix、Deinococcusradiodurans、Pyrococcus abyss1、Pyrococcus horikoshi1、硫石黃礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、Sulfolobus tokodaii 和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的賴氨酸生物合成V途徑中；以及酵母和真菌包括Euglena gracilis、曲霉屬、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)和釀酒酵母的賴氨酸生物合成IV途徑中。
[0190]在賴氨酸生物合成IV和V途徑中，從α -酮戊二酸到α -酮己二酸的反應(yīng)由4種酶的連續(xù)作用催化，即:EC2.3.3.14:高檸檬酸合酶(hcs/LYS20/LYS21/nifV)；EC4.2.1.114:產(chǎn)甲烷菌HACN ；EC4.2.1.36:高順烏頭酸酶水合酶；和ECl.1.1.87-高異檸檬酸脫氫酶(hicDH或LYS12)。
[0191]1.5.3丙二酰-CoA縮合途徑
[0192]在一些實(shí)施方案中，丙二酰-CoA可用作庚二酰-CoA的來源，因?yàn)槟承┥锬軐?個(gè)丙二酰-CoA分子縮合成單個(gè)庚二酰-CoA分子。見圖4。亦參見Lin, S.和Cronan, J.E.,Molecular Biosystems7:1811-21 (2011)，其通過提述并入本文。因此，可產(chǎn)生一種其中從丙二酰-CoA生成庚二酰-CoA的重組宿主。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是無色桿菌屬(Achromobacter)以外的生物體。在一些實(shí)施方案中，庚二酰-CoA可隨后轉(zhuǎn)化成庚二酸或其他雙官能C7烷。
[0193]1.5.4生物素生物合成途徑I (革蘭氏陰性細(xì)菌)和II (革蘭氏陽性細(xì)菌)
[0194]在一個(gè)實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞從源自甘油和/或脂肪酸的乙酰-CoA產(chǎn)生庚二酸和 / 或庚二酰- [acp]。參見，例如 Lin, S.，Nature Chem.Biol.6:682-688 (2010);和Cronan, J.E.和 Lin, S., Current Opinion in Chem.Biologyl5:1-7 (2011)，兩者均通過提述并入本文。圖5顯示在生物素生物合成II (革蘭氏陽性細(xì)菌)中從庚二酸或其他前體形成庚二酰-CoA。圖6顯示在生物素生物合成I (革蘭氏陰性細(xì)菌)中形成庚二酰_[acp]或其甲基酯。圖6還顯示用于將庚二酰-[acp]甲基酯轉(zhuǎn)化成庚二酸單甲基酯的途徑。然后，庚二酸單甲基酯在存在例如EC3.1.1.中的脂肪酶的情況下轉(zhuǎn)化成庚二酸(庚烷-1，7- 二元酸)。圖6還顯示在存在酯酶(例如EC3.1.1如EC3.1.1.85中的酶，BioH)的情況下庚二酰-[acp]甲基酯到庚二酰_[acp]的轉(zhuǎn)化。庚二酰-[acp]然后在存在硫酯酶，例如EC3.1.2.14中的酶如FatA或FatB的情況下被轉(zhuǎn)化成庚二酸(庚烷_1，7- 二元酸)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋能產(chǎn)生庚二酸(庚烷-1，7-二元酸)的重組宿主細(xì)胞，其包含圖6中顯示的一種或所有酶。在一些實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中確實(shí)具有缺陷，該酶是一種能將6-羧基己?；?Cok (庚二酰-CoA)轉(zhuǎn)化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)的酶，且由具有天然生物素生物合成途徑的宿主生物中的BioF基因編碼，從而使得庚二酰-CoA不能穿梭到生物素生物合成中。
[0195]庚二酰-[acp]甲基酯還可作為長鏈酰基_[acp]和/或游離脂肪酸通過BioI (例如來自枯草芽孢桿菌的BioI)的代謝的結(jié)果產(chǎn)生。
[0196]1.5.5真核生物合成途徑[0197]庚二酸和/或庚二酰-CoA還可從真核的生物素生物合成途徑獲得。參見，例如Roje, S., Phytochemistry68:1904-1921(2007)；和 Charles R.Hall, The Contribution ofHorizontal Gene Transfer to the Evolution of Fungi (MaylO, 2007)(未公開出版的博士論文，Duke University)(存檔在Duke University Libraries),兩者均通過提述并入本文。在真核途徑中，乙酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰CoA，其使用分類在EC2.3.1.9下的酶；乙酰乙酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成(S)-3-羥基丁酰-CoA，其使用分類在E.C.1.1.1.157下的酶；(S)-3-羥基丁酰-CoA被生物轉(zhuǎn)化成巴豆酰-CoA，其使用分類在EC4.2.1.17下的酶；巴豆酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成戊烯二酰-Ι-CoA，其使用分類在EC4.1.1.70下的酶；戊烯二酰-1-CoA被生物轉(zhuǎn)化成戊二酰-CoA，其使用分類在ECl.3.99.7下的酶；戊二酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成3-酮庚二酰-CoA，其使用分類在EC2.3.1.43下的酶；3_酮庚二酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成3-羥基庚二酰-CoA，其使用分類在ECl.1.1.4259下的酶；3_羥基庚二酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成2，3- 二脫氫-庚二酰-CoA，其使用分類在EC4.2.1.-下的酶，而2，3- 二脫氫-庚二酰-Cok被生物轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，其使用分類在ECl.3.1.62下的酶。庚二酰-Cok隨后轉(zhuǎn)化成庚二酸。
[0198]在一些實(shí)施方案中，乙酰-CoA可供給到三羧酸(TCA)循環(huán)中，其中乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成琥珀酸(1，4-丁二酸)。然后，琥珀酸從TCA循環(huán)轉(zhuǎn)移到用于合成庚二酸的途徑中，其開始于2-氧戊二酸到2-羥基-1，2，4- 丁烷三羧酸(高檸檬酸)(例如通過EC2.3.3.14中的酶)的生物轉(zhuǎn)化；高檸檬酸到高順式烏頭酸和高順式烏頭酸到高異檸檬酸的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在EC4.2.1.36下的酶；高異檸檬酸到草酰戊二酸的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在ECl.1.1.87下的酶；草酰戊二酸到2-氧己二酸的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在ECl.1.1.87下的酶；和2-氧己二酸到戊二酰-CoA的生物轉(zhuǎn)化，其使用分類在ECl.2.4.2下的酶。戊二酰-CoA可轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，如上文論述的。最后，高檸檬酸轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，然后轉(zhuǎn)化成庚二酸，如本文中描述的。 [0199]如此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其包含用于將乙酰CoA轉(zhuǎn)化成庚烷-1，7- 二元酸的酶。在一些實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中具有缺陷，該酶是一種能將6-羧基己?；?CoA(庚二酰-CoA)轉(zhuǎn)化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)的酶，且由宿主(如果宿主生物具有天然生物素生物合成途徑)中的BioF基因編碼，從而使得庚二酰-CoA不能穿梭到生物素生物合成中。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供一種產(chǎn)生庚烷-1，7- 二元酸的方法，其包括使用這類重組宿主細(xì)胞。
[0200]1.5.6苯甲酰-CoA降解途徑
[0201]本文中涵蓋的庚二酰-CoA和/或庚二酸的一個(gè)另外的來源是圖7中顯示的苯甲酸降解途徑。參見，例如 Bernsteinb, J.R.，等，Metabolic Eng’glO: 131-140 (2008)；Harwood, C.S.,等，F(xiàn)EMS Microbiology Reviews22:439-458 (1999)；和 Harrison, F.H.和Harwood, C.S.，Microbiologyl51:727-736 (2005)，其均通過提述并入本文。許多轉(zhuǎn)化例示在圖7中，其中苯甲酸使用分類在EC6.2.1.25下的酶轉(zhuǎn)化成苯甲酰-CoA，并最后轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA。苯甲酰-CoA轉(zhuǎn)化成環(huán)己-1，5- 二烯羰基CoA，其使用分類在ECl.3.99.15下的酶。在一些實(shí)施方案中，環(huán)己-1，5- 二烯羰基CoA生物轉(zhuǎn)化成6-羥基環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA，其使用分類在EC4.2.1.100下的酶；6_羥基環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA生物轉(zhuǎn)化成6-酮氧基環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA，其使用分類在ECl.1.1-下的酶；6_酮氧基環(huán)己-1-烯-1-羧基-Cok生物轉(zhuǎn)化成3-羥基庚二酰-Cok,其使用分類在EC3.7.1.-下的酶；3-羥基庚二酰-CoA生物轉(zhuǎn)化成6-羧基己-2-烯酰-CoA，其使用分類在EC4.2.1.-下的酶；3-羥基庚二酰-CoA生物轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，其使用分類在ECl.3.1.62下的酶。相應(yīng)地，庚二酰-CoA轉(zhuǎn)化成庚二酸(庚烷-1,7-二元酸)。在一些實(shí)施方案中，環(huán)己-1,5-二烯羰基Cok生物轉(zhuǎn)化成環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA，環(huán)己-1-烯-1-羧基-Cok生物轉(zhuǎn)化成2-羥基環(huán)己烷-1-羧基CoA，其使用分類在EC4.2.1.-下的酶；2-羥基環(huán)己烷_1_羧基Cok生物轉(zhuǎn)化成2-酮環(huán)己烷-1-羧基-CoA，其使用分類在E.C.1.1.1.-下的酶，而2-酮環(huán)己烷羧基-CoA生物轉(zhuǎn)化成庚二酰-CoA，其使用分類在EC3.1.2.-下的酶(例如一種酮環(huán)己烷羧基-CoA水解酶Rp-badl，分類在EC3.1.2.-下的酶)。
[0202]在一些實(shí)施方案中，所述能產(chǎn)生庚烷-1，7- 二元酸的重組宿主細(xì)胞包含一種或多種在圖7或本部分中列出的酶。
[0203]1.5.72，6- 二氨基庚二酸途徑
[0204]庚二酸的又一種來源是D，L 二氨基庚二酸，亦稱為2，6- 二氨基庚二酸。D, L- 二氨基庚二酸是賴氨酸產(chǎn)生中的中間物。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源性賴氨酸途徑可修改為優(yōu)先產(chǎn)生庚二酸，其通過創(chuàng)造 出在二氨基庚二酸脫羧酶中具有缺陷的重組宿主細(xì)胞。見例如圖
10。D，L 二氨基庚二酸可生物轉(zhuǎn)化成不飽和的單氨基庚二酸，其通過催化D，L 二氨基庚二酸到6-氨基-2-庚烯二元酸的還原性脫氨基化的酶。催化D，L 二氨基庚二酸的還原性脫氨基化的酶例子包括分類在EC4.3.1中的氨裂合酶，如EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 JPEC4.3.1.24。在一些實(shí)施方案中，所述氨裂合酶是分類在EC4.3.1.2下的甲基天冬氨酸氨裂合酶,其來自無丙二酸檸檬酸桿菌、C.tetanomorphiim或米曲霉(A.0ryzae)。參見，例如 Botting, Biochemistry27:2953-2955 (1988)；和Kato, Appl Microbiol.BiotechnoL50:468-474 (1998),其通過提述完整并入本文。
[0205]6-氨基-2-庚烯二酸可生物轉(zhuǎn)化成2-氨基-2-庚烯二酸，其使用催化6_氨基-2-庚烯二酸到2-氨基-2-庚二酸(亦稱為2-氨基庚二酸或alpha氨基庚二酸鹽)的烯酸還原的酶。催化6-氨基-2-庚烯二酸的烯酸還原的酶例子包括分類在ECl.3.1如ECl.3.1.31中的烯酸還原酶。在一些實(shí)施方案中，所述烯酸還原酶是ECl.3.1.31中的YqjM或0PR1/3,其分別來自枯草芽孢桿菌或L.esculentum。參見，例如Stueckler, Org.Lett.9:5409-5411 (2007) ；Kitzing,J.Biol.Chem.280:27904-27913 (2005)；Hall, Angew.Chem.1nt.Ed.46:3934-3937 (2007)；和 Breithaupt, Proc.Natl.Acad.SciUSA103:14337-14342 (2006)，其通過提述完整并入本文。
[0206]2-氨基庚二酸可轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的2-庚烯二酸(亦稱為2，3-二脫氫庚二酸)，其通過催化2-氨基庚二酸的還原性脫氨基化的酶。催化2-氨基庚二酸的還原性脫氨基化的酶例子包括分類在 EC4.3.1 中的氨裂合酶，如 EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;*EC4.3.1.24，如上文描述的。2-庚烯二酸可轉(zhuǎn)化成2-庚烯二酸CoA，其使用CoA轉(zhuǎn)移酶(例如，分類在EC2.8.3如EC2.8.3.12或EC2.8.3.13中的CoA轉(zhuǎn)移酶)和酸硫醇連接酶(例如分類在EC6.2.1如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 ;或EC6.2.1.23中的酸-硫醇連接酶)。
[0207]然后，將2-庚烯二酸CoA轉(zhuǎn)化成庚二酸-CoA，其通過催化2_庚烯二酸的烯酸還原的酶，如分類在ECl.3.1.中的烯酸還原酶。庚二酸-CoA可如上文所述轉(zhuǎn)化成庚二酸。[0208]如圖10和圖3中顯示的，α酮庚二酸還可進(jìn)行I輪鏈延伸成為α -酮-辛二酸，其可被脫羧以形成庚二酸半醛或轉(zhuǎn)化成α-氨基辛二酸(在脫羧時(shí)將直接產(chǎn)生7-氨基庚酸)。例示性脫羧酶包括EC4.1.1中的那些，如EC4.1.1.11 ；EC4.1.1.15 ；EC4.1.1.17 ；EC4.1.1.18 ；EC4.1.1.19 ；EC4.1.1.20 和 EC4.1.1.86。在一些實(shí)施方案中，所述脫羧酶包括EC4.1.1.1中的來自乳酸乳球菌的酮異戊酸脫羧酶kivD ；EC4.1.1.7中的來自惡臭假單胞菌(P.putida)的苯甲酰甲酸脫羧酶mdIC A460I或BFD ；EC4.1.1.1中的來自釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶同工酶I和2Pdcl ;來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶Pdc(I472A);或EC4.1.1.72中的來自乳酸乳球菌的支鏈alpha-酮酸脫羧酶kdcA，如記載于W02011/031147的，其通過提述完整并入本文。
[0209]α -氨基辛二酸可轉(zhuǎn)化成7-氨基庚酸，其使用鏈延伸酶如存在于產(chǎn)甲烷細(xì)菌(例如Methanobacterium autotrophicum)中的那些。這類鏈延伸酶包括但不限于AksA、AksD和AksE或F，如上文論述的。例示性AksA酶包括但不限于EC2.3.3.中的那些。EC2.3.3中的例示性酶包括但不限于EC2.3.13或2.3.3.14。例示性AksD酶包括EC4.2.1.中的那些。EC4.2.1中的例示性酶包括但不限于EC4.2.1.33。例示性AksF酶包括但不限于ECl.1.1.中的酶。ECl.1.1中的例示性酶包括但不限于ECl.1.1.85。而且在此情況下，第四組酶包括脫羧酶。例示性脫羧酶包括EC4.1.1.中的那些。EC4.1.1中的例示性脫羧酶包括但不限于 EC4.1.1.11 ；EC4.1.1.15 ；EC4.1.1.17 ；EC4.1.1.18 ；EC4.1.1.19 ；EC4.1.1.20和 EC4.1.1.86。
[0210]在一個(gè)實(shí)施方案中，可使α酮庚二酸與一種或多種催化到α羥基庚二酸的酮還原的酶(例如羰基還原酶如ECl.1.1.184)接觸，其相應(yīng)地可使用催化CoA轉(zhuǎn)移的酶(例如上述CoA轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化成α -羥基庚二酸CoA。α -羥基庚二酸CoA可轉(zhuǎn)化成2_庚烯二酸CoA，其使用催化α -羥基庚二酸-CoA脫水的酶(例如分類在EC4.2.1下的水裂合酶如EC4.2.1.2.EC4.2.1.5 9、EC4.2.1.61)。2-庚烯二酸 CoA 可轉(zhuǎn)化成庚二酸 CoA，其使用催化2-庚烯二酸CoA的烯酸還原的酶。在上文描述了合適的烯酸還原酶。
[0211 ] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其包含將D，L- 二氨基庚二酸優(yōu)先轉(zhuǎn)化成庚二酸所需的一種或多種酶。
[0212]1.5.8巴豆酸酯途徑
[0213]庚二酰-CoA的來源以及最終的庚二酸的來源是其中起始碳源是巴豆酸酯的生物合成途徑。該生物合成途徑例示于圖9。參見，例如Mouttaki, H.,等,Applied Envtl.Microbiology73:930-938 (2001)。巴豆酸酯分解成乙酰-CoA。已報(bào)告圖9所示生物合成途徑中產(chǎn)生的2/3的乙酰-CoA被轉(zhuǎn)化成乙酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其在會(huì)將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酸的酶(例如磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酸激酶)中有缺陷，從而使得乙酰-CoA在圖9所示許多代謝步驟中被轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰-CoA，然后轉(zhuǎn)化成戊烯二酰-CoA。然后戊烯二酰-CoA被轉(zhuǎn)化成戊二酰-CoA。戊二酰-CoA經(jīng)過鏈延伸以形成3-氧庚二酰-CoA。在還原、脫水和第二次還原后，獲得庚二酰-CoA。
[0214]在圖9所示生物合成途徑中，庚二酰-CoA最終被轉(zhuǎn)化成環(huán)己烷羧酸。這類生物合成途徑已在S.aciditrophicus中觀察到。如此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其中編碼會(huì)將庚二酰-Cok轉(zhuǎn)化成環(huán)己-1-烯-1-羧基-Cok并最終轉(zhuǎn)化成環(huán)己烷羧酸的酶被“敲除”，從而使得代謝途徑在庚二酰-CoA終止。[0215]1.5.9 萘滿(Tetralin)降解途徑
[0216]在一些實(shí)施方案中，使用來自鞘氨醇單胞菌和棒狀桿菌菌種的萘滿(苯環(huán)己烷)降解途徑產(chǎn)生庚二酸半醒。7-氧庚酸作為Sphingomonas macrogolitabid中萘滿降解途徑的中間物產(chǎn)生。Lopez-Sanchez, A.,等，Appl.Environ.Microbiol.76:110-118 (2010)。萘滿通過切割兩個(gè)芳香環(huán)代謝，得到丙酮酸和庚二酸半醛。萘滿(一種有機(jī)溶劑)是源自萘的復(fù)雜起始材料。萘目前自煤焦油產(chǎn)生，但已知用于萘合成的生物合成途徑發(fā)生在白蟻、真菌和一些植物類型中。Chen, J.等，Nature392:558-559 (1998) ；Daisy, B.H.,等，Microbiologyl48:3737-3741 (2002) jPAzuma，H.，等，Phytochemistry42:999-1004 (1996)。庚二酸半醛可轉(zhuǎn)化成7-氨基庚酸或7-羥基庚酸，如上文論述的。
[0217]1.11來自2-氧庚二酸的六亞甲基二胺
[0218]本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供一種從2-氧庚二酸產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法，包括使用重組的宿主細(xì)胞。2-氧庚二酸是產(chǎn)甲烷古細(xì)菌中輔酶B生物合成途徑中的已知中間物。
[0219]如此，本發(fā)明提供包含以下的重組宿主細(xì)胞:能將2-氧庚二酸轉(zhuǎn)化成2-氨基庚二酸的酶(例如EC2.6.1.67中的氨基轉(zhuǎn)移酶)、能將2-氨基庚二酸轉(zhuǎn)化成2-氨基-7-氧庚酸的酶(例如ECl.4.1中的還原酶)、能將2-氨基-7-氧庚酸轉(zhuǎn)化成2，7-二氨基庚酸的酶(例如EC2.6.1中的1-氨基轉(zhuǎn)移酶)、能將2，7- 二氨基庚酸轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺的酶(例如EC4.1.1中的脫羧酶)。在一些實(shí)施方案中，所述能產(chǎn)生六亞甲基二胺的重組宿主細(xì)胞包含任意或所有的這些酶。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供一種產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法，其包括使用這些重組宿主細(xì)胞。
[0220]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于從可再生原料如糖、脂肪酸、甘油和合成氣產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法。在一些實(shí)施方案中，能產(chǎn)生六亞甲基二胺的非天然存在的宿主細(xì)胞包含將可再生原料轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺所需的任意或所有酶。
[0221]2.2重組宿主細(xì)胞
[0222] 本公開特征是重組表達(dá)I種或多種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種、或甚至更多種)用于在本文所述的一種途徑中產(chǎn)生化合物的酶的重組宿主細(xì)胞，以及使用這類宿主細(xì)胞來產(chǎn)生二和三官能C7烷的方法。例如，宿主細(xì)胞可包含一種或多種(如上文)外源性核酸，其編碼一種或多種(如上文)以下酶:催化D，L 二氨基庚二酸或alpha-氨基庚二酸的還原性脫氨基化的酶；催化2-庚烯二酸到庚二酸的烯酸還原的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸還原的酶，催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶，催化7-氨基庚酸到庚內(nèi)酰胺的酰胺水解的酶，催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脫氫的酶；催化氨基基團(tuán)到7-氨基庚醛的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7-二氨基庚烷的酶；催化CoA到2-庚烯二酸轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2-庚烯二酸-CoA的酶；催化2-庚烯二酸-CoA到庚二酰-CoA的烯酸還原的酶；催化庚二酰-CoA以產(chǎn)生庚二酸的硫酯水解的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸還原的酶；催化alpha氨基庚二酸的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生alpha酮庚二酸的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha羥基庚二酸的羰基還原的酶；催化CoA到alpha羥基庚二酸轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生alpha羥基庚二酸CoA的酶；催化alpha羥基庚二酸到2_庚烯二酸的還原的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha酮辛二酸的alpha酮酸鏈延伸的酶,催化氨基基團(tuán)到alpha酮辛二酸轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生alpha-氨基辛二酸酯的酶，催化alpha氨基辛二酸到7_氨基庚酸的alpha酮酸脫羧的酶；催化alpha酮辛二酸的alpha酮酸脫羧以產(chǎn)生庚二酸半醛的脫羧的酶；催化6-氨基_2_庚烯二酸的烯酸還原以產(chǎn)生庚二酸的酶；或催化庚二酰[acp]到庚二酸的硫酯水解的酶。重組宿主細(xì)胞可含有由編碼一種或多種上文所列酶的一種或多種(如上文)核酸組成的任意亞組。
[0223]使用的宿主細(xì)胞通常具有許多特性:它們可容易地進(jìn)行遺傳修飾、對(duì)本發(fā)明方法中使用的條件耐受、且生長至工業(yè)有用的細(xì)胞密度。
[0224]任選地，所述宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，或可以是細(xì)胞系的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以具有野生基因型。在此情況中，用于催化本發(fā)明方法中一個(gè)或多個(gè)步驟的酶天然存在于宿主細(xì)胞中且以在本發(fā)明方法中具有工業(yè)用途的水平表達(dá)。在一個(gè)備選方案中，宿主細(xì)胞已經(jīng)過遺傳修飾從而以在本發(fā)明實(shí)施方案的方法中具有工業(yè)用途的水平表達(dá)酶。所述酶可源自表達(dá)其的細(xì)胞。在一個(gè)備選方案中，所述酶源自不同的菌株或物種的細(xì)胞。
[0225]在一個(gè)備選方案中，所述宿主細(xì)胞是原核生物的。在另一個(gè)備選中，其為真核生物的。通常使用單細(xì)胞微生物。
[0226]術(shù)語原核細(xì)胞包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。合適的革蘭氏陰性細(xì)菌的例子包括:大腸桿菌、沼澤紅假單胞菌、鞘氨醇單胞菌、假單胞菌、和屬于以下屬的其他細(xì)菌:棒狀桿菌屬、沙門氏菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、莫拉氏菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、嗜冷桿菌屬、棲熱袍菌屬、不動(dòng)桿菌屬、紅細(xì)菌屬、固氮弧菌屬和紅螺菌屬。合適的革蘭氏陽性細(xì)菌的例子包括鏈球菌屬、乳桿菌屬、和屬于以下屬的其他細(xì)菌:諾卡氏菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬、梭菌屬、鏈霉囷屬和節(jié)桿囷屬。
[0227]真核宿主細(xì)胞包括來自酵母和其他真菌的那些細(xì)胞，以及例如昆蟲、小鼠、大鼠、靈長類或人的細(xì)胞。合適的真核宿主細(xì)胞的例子包括酵母解脂西洋蓍霉、假絲酵母屬如熱帶假絲酵母、白色假絲酵母、C.cloacae、C.guiIlermondii> C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides、屬于以下屬的酵母:紅酵母屬、根霉屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬，以及屬于以下屬的其他真菌:曲霉屬、外瓶霉屬、毛霉屬、木霉屬、枝孢屬、平革菌屬、Cladophialophora、擬青霉屬、Scedosporium 和 Ophiostoma0
[0228]可以以多種不同形式提供宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是靜息細(xì)胞。即，在培養(yǎng)物中生長細(xì)胞并在用作生物催化劑之前從培養(yǎng)基取出。所述細(xì)胞可在生長后直接使用，或者可在使用前將其儲(chǔ)存。儲(chǔ)存的典型方法包括冷凍。在一個(gè)備選方案中，所述細(xì)胞在使用前凍干。在一個(gè)別的備選方案中，所述細(xì)胞是生長的細(xì)胞。即，細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)實(shí)施其生物催化作用。如果特定生物催化反應(yīng)的底物不能跨越細(xì)胞膜由宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，那么在一個(gè)備選方案中，可使用粗裂解物。粗裂解物是在裂解細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞組分的初始懸液。細(xì)胞的裂解可通過任何手段實(shí)施，包括化學(xué)或機(jī)械手段。根據(jù)其一般知識(shí)和本文中教導(dǎo)，其他裂解方法對(duì)于技術(shù)人員來說將是明顯的。在另一個(gè)備選方案中，可使用澄清的裂解物。澄清的裂解物可通過將粗裂解物離心以使未裂解細(xì)胞和其他細(xì)胞殘片形成團(tuán)粒來制備。
[0229]在一些實(shí)施 方案中，提供基本純的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文中使用的,重組細(xì)胞的“基本純的培養(yǎng)物”是其中低于約40%(即，低于約:35% ；30% ；25% ；20% ；15%；10% ；5% ；2% ；1% ；0.5% ；0.25% ；0.1% ；0.01% ；0.001% ；0.0001% ;或甚至更低)的培養(yǎng)物中活細(xì)胞總數(shù)是重組細(xì)胞(例如細(xì)菌、真菌(包括酵母)、支原體或原生動(dòng)物細(xì)胞)以外的活細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語“約”在此背景中意指相關(guān)百分?jǐn)?shù)可以在所指示百分?jǐn)?shù)之上或之下15%。如此，例如，約20%可以是17%到23%。這類重組細(xì)胞的培養(yǎng)物包含細(xì)胞和生長、儲(chǔ)存或運(yùn)輸培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、半固體(例如凝膠狀介質(zhì))或冷凍的。培養(yǎng)物包括液體中或半固體培養(yǎng)基中/上生長或在儲(chǔ)存或運(yùn)輸培養(yǎng)基(包括冷凍儲(chǔ)存或運(yùn)輸培養(yǎng)基)中儲(chǔ)存或運(yùn)輸?shù)募?xì)胞。培養(yǎng)物在培養(yǎng)容器或儲(chǔ)存容器或基質(zhì)中(例如培養(yǎng)皿、燒瓶或管或儲(chǔ)存小瓶或管)。
[0230]在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的重組細(xì)胞可從發(fā)酵工藝收獲，其通過常規(guī)方法如過濾或離心，并在維持高活性的同時(shí)配制成干團(tuán)?；蚋煞勰┡渲莆?。用于產(chǎn)生展現(xiàn)出本文中公開的一種或多種活性的干粉末全重組細(xì)胞組合物的工藝包括噴干、凍干、流化床干燥、真空轉(zhuǎn)鼓干燥或團(tuán)聚等。所述組合物可以是貨架穩(wěn)定的、干生物催化劑組合物，其適用于本文中描述的生物合成方法。干燥方法如凍干、流化床干燥或采用擠壓(extrusion)/球團(tuán)團(tuán)?；?spheronisation pelleting)繼之以流化床干燥的方法可尤其有用。這些工藝的溫度可為<100°C，但通常<70°C以維持高殘余活性和立體選擇性。干粉末配制物應(yīng)具有0-10%w/w，通常2-5%w/w的水含量?？珊蟹€(wěn)定化添加劑如鹽(例如KCl)、糖、蛋白質(zhì)等以改進(jìn)重組細(xì)胞在干燥過程期間的熱耐受性或改進(jìn)干燥屬性。
[0231]在一些實(shí)施方案中，可代替重組宿主或重組或非重組細(xì)胞的裂解物，或與其組合來使用部分或完全純化的酶。完全或部分純化的酶可以是本文所述任意重組細(xì)胞的或非重組細(xì)胞的完全或部分純化的裂解物。純化方法是本領(lǐng)域中公知的。部分或完全純化具有的優(yōu)點(diǎn)在于，感興趣的酶與可能干擾(通過也與底物反應(yīng)或通過將中間物或期望產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為不想要的化合物)由該酶催化的反應(yīng)的其他細(xì)胞組分分開。純化確實(shí)向任何生物催化劑制備加入了別的步驟，然而且因此并非在所有情況中均為合適的。對(duì)使用部分或完全純化的酶的適宜性的確定將完全在遵循本文教導(dǎo)的技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
[0232]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中的一種或多種轉(zhuǎn)化將由生物催化劑在需氧條件下進(jìn)行。在一個(gè)備選方案中，本發(fā)明方法中的一種或多種轉(zhuǎn)化將在厭氧條件下進(jìn)行。在一個(gè)別的備選方案中，本發(fā)明方法中的一些步驟將在需氧條件下進(jìn)行而一些步驟將在厭氧條件下進(jìn)行。
[0233]2.3全細(xì)胞生物催化劑的修飾
[0234]本發(fā)明方法中使用的生物催化劑可以是未經(jīng)修飾的物種宿主細(xì)胞，其中天然存在該酶。然而，通常需要遺傳修飾宿主細(xì)胞以產(chǎn)生非天然存在(即重組或工程化)的宿主細(xì)胞。
[0235]2.4宿主細(xì)胞基因組的染色體修飾
[0236]在一些實(shí)施方案中，已修飾了全細(xì)胞生物催化劑(即宿主細(xì)胞)的染色體。該修飾可以是染色體中核酸的插入、缺失或取代。對(duì)細(xì)胞染色體引起修飾的方法是公知的，例如轉(zhuǎn)座子誘變、Cre-Lox介導(dǎo)的重組、lambda Red和RecET介導(dǎo)的重組。
[0237]穩(wěn)定整合到核酸染色體中是有利的，因?yàn)槠湓试S維持核酸而無需可選擇標(biāo)志物。
[0238]通過實(shí)施重復(fù)插入，可以將許多不同核酸穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞生物催化劑的染色體中。穩(wěn)定整合意指可將宿主細(xì)胞培養(yǎng)超過5代而不失去該改變。一般而言，穩(wěn)定的遺傳改變包括持續(xù)超過10代的修飾，特別穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過約25代，且更特別穩(wěn)定的遺傳修飾將超過50代(包括無限期)。
[0239]2.5對(duì)宿主細(xì)胞生物催化劑基因組的附加體修飾
[0240]在一些實(shí)施方案中，修改宿主細(xì)胞基因組的附加體組成。附加體意指任何自主復(fù)制元件，例如質(zhì)粒(可為線性或環(huán)狀)、粘粒、酵母人工染色體(YAC)等。附加體元件經(jīng)常對(duì)其宿主細(xì)胞施加代謝負(fù)荷，且因此在缺乏確保附加體的至少一個(gè)拷貝在細(xì)胞分裂后存在于每個(gè)子細(xì)胞的任何活性劃分機(jī)制的情況下，需要納入可選擇標(biāo)志。
[0241]2.6導(dǎo)入的核酸序列
[0242]導(dǎo)入細(xì)胞的核酸可包含一種或多種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種、或甚至更多)的許多元件。通常地，這些元件之一編碼用于產(chǎn)生雙官能或三官能C7烷或這類分子前體的酶。在一些備選方案中，該核酸編碼的蛋白質(zhì)并非是在本發(fā)明方法中發(fā)揮功能的酶。
[0243]通常而言，啟動(dòng)子可操作地連接于核酸。啟動(dòng)子的選擇將取決于意圖的應(yīng)用，且可容易地由技術(shù)人員確定。例如，如果酶催化的反應(yīng)可能對(duì)特定宿主細(xì)胞有害，那么可以期望使用受調(diào)節(jié)的或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，從而使得基因表達(dá)可在需要時(shí)打開或關(guān)閉?；蛘撸赡軆?yōu)選的是使得表達(dá)受弱或強(qiáng)構(gòu)成性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)以確保該酶在生長的所有階段均表達(dá)。適用于真核細(xì)胞系統(tǒng)的例示性啟動(dòng)子包括SV40早期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)類固醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、和Moloney鼠白血病病毒(MMLV)啟動(dòng)子。例示性酵母啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸酯激酶啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子、半乳糖激酶(GALl)啟動(dòng)子 、半乳糖差向異構(gòu)酶(galactoepimerase)啟動(dòng)子和醇脫氫酶(ADH)啟動(dòng)子。酵母中的其他合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。適用于細(xì)菌細(xì)胞系統(tǒng)的例示性啟動(dòng)子包括但不限于:T7、Τ3、SP6、Iac和trp啟動(dòng)子。
[0244]如果需要確保表達(dá)，那么導(dǎo)入的核酸還可以可操作地連接以如需要的包含5’不翻譯區(qū)(UTR)、3’UTR、增強(qiáng)子和/或終止子區(qū)。這類元件將是技術(shù)人員已知的。
[0245]2.7多種酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)
[0246]在一些實(shí)施方案中，使用單一菌株的宿主細(xì)胞來表達(dá)超過一種(例如2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、或20種或更多種、或甚至更多種)用在本發(fā)明方法中的酶。在此情況中，所述多種酶可由同一種導(dǎo)入核酸編碼。在一個(gè)備選方案中，所述酶可編碼在分開的導(dǎo)入核酸片段上。酶可均從單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)(例如通過將酶以操縱子的形式排布)。在一個(gè)備選方案中，酶可從多個(gè)分開的啟動(dòng)子表達(dá)。在一些情況中，可通過相同化學(xué)物誘導(dǎo)多個(gè)分開的啟動(dòng)子(例如，多種酶中每種可從酵母GAL啟動(dòng)子表達(dá)，如此意味著每個(gè)基因可用半乳糖誘導(dǎo))。其他合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中已知的。在一個(gè)備選方案中，編碼本發(fā)明方法中使用的酶的每個(gè)基因在不同啟動(dòng)子的控制下。如此，可經(jīng)由不同誘導(dǎo)化合物的使用來分別誘導(dǎo)不同的酶。在另一個(gè)備選方案中，使用折中辦法，其中許多酶在相同啟動(dòng)子的控制下，而許多酶在不同啟動(dòng)子的控制下。當(dāng)已在宿主細(xì)胞中生成眾多酶途徑且期望協(xié)調(diào)途徑的其他成員來控制途徑的每個(gè)成員，但分開控制每個(gè)途徑時(shí)，這一備選方案特別有利。
[0247]可對(duì)多種酶是從染色體還是從質(zhì)粒表達(dá)進(jìn)行其他考慮。在其中從質(zhì)粒表達(dá)酶的情況下，有利地，每種質(zhì)粒包含不同的起點(diǎn)和/或不同的可選擇標(biāo)志。
[0248]多種酶在單一細(xì)胞中表達(dá)是有利的，因?yàn)槿绻脖磉_(dá)的酶在反應(yīng)途徑中彼此承接直接作用，這確保上游酶反應(yīng)的產(chǎn)物立即可受下游酶的作用。這避免了以下需要:(i)中間物的純化和第二反應(yīng)容器的設(shè)置以實(shí)施第二反應(yīng)；或(ii)將產(chǎn)物從包含上游酶的細(xì)胞運(yùn)輸?shù)狡淇墒馨掠蚊傅募?xì)胞作用的培養(yǎng)基中。
[0249]2.8伴侶蛋白系統(tǒng) [0250]當(dāng)細(xì)胞已工程化為在非自然條件下(例如，當(dāng)某物種天然的蛋白質(zhì)以高于自然水平的水平表達(dá)或者在一個(gè)備選方案中，當(dāng)來自不同物種的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí))表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，在一些情況下該蛋白將不會(huì)以活性形式表達(dá)。相反它會(huì)不正確地折疊并累積為非功能性“包含體”聚集物。在此情況下，用于表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞可進(jìn)行遺傳修飾以進(jìn)一步表達(dá)伴侶蛋白，其能夠阻止該蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，或者能夠?qū)⑵鋸木奂癄顟B(tài)重折疊。納入這類伴侶蛋白是有利的，因?yàn)樗黾用考?xì)胞的活性蛋白質(zhì)的量，且因此增加本發(fā)明方法的總體效率。所表達(dá)的伴侶蛋白可以是宿主細(xì)胞的伴侶蛋白。在一個(gè)備選方案中，伴侶蛋白可來自與該蛋白質(zhì)相同的物種/菌株。典型的用于表達(dá)的伴侶蛋白包括GroEL/GroES家族的成員和DnaJ/DnaK/GrpE家族的成員。原型大腸桿菌GroEL/GroES和DnaJ/DnaK/GrpE蛋白的同源物已在其他原核物種中鑒定出來(參見例如)，且真核同源物也是已知的(GroEL和GroES分別對(duì)應(yīng)于真核蛋白Hsp60和HsplO,而DnaJ、DnaK和GrpE分別對(duì)應(yīng)于真核蛋白HSp70、HSp40和Hsp24)。這些蛋白質(zhì)已在許多酵母物種(例如釀酒酵母)中鑒定出來。用于與用在本發(fā)明方法中的酶共表達(dá)的適宜伴侶蛋白的選擇對(duì)于遵循本文中教導(dǎo)的技術(shù)人員來說將是明顯的。
[0251]2.9宿主細(xì)胞的代謝工程化
[0252]代謝工程化是優(yōu)化宿主細(xì)胞中參數(shù)以增加細(xì)胞產(chǎn)生化合物能力的過程。任選地，本發(fā)明方法中使用的宿主細(xì)胞已經(jīng)過工程化以優(yōu)化上文論述的雙官能C7烷的輸出。
[0253]增加細(xì)胞產(chǎn)生一種化合物能力的代謝工程化主要經(jīng)由兩種方法進(jìn)行。第一種是優(yōu)化途徑中從起始材料產(chǎn)生期望產(chǎn)物的酶。在導(dǎo)致雙官能C7烷產(chǎn)生的多酶途徑中(如附圖所示和前面部分所述的)，可以使用技術(shù)人員已知的技術(shù)(例如，二維電泳、使用同位素標(biāo)記的前體、和核磁共振(NMR)光譜學(xué))來測(cè)定途徑中每種中間物的濃度，并因此確定哪個(gè)酶轉(zhuǎn)化是限速步驟，即反應(yīng)方案中的哪個(gè)步驟最慢。這可以通過觀察中間物的積累來確定，中間物的積累指示作用于此中間物的酶在限制轉(zhuǎn)化的總體速率。在此情況中，因而應(yīng)增加該中間物反應(yīng)的速率。這可通過多種手段進(jìn)行。首先，可提高限制性酶的表達(dá)水平。任選地，這可以通過將編碼該酶的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子，例如T7啟動(dòng)子(如果該酶在大腸桿菌中表達(dá))或TEF啟動(dòng)子(如果該酶在酵母中表達(dá))的控制下來實(shí)現(xiàn)。第二種選擇是提高編碼存在于細(xì)胞的該酶的基因的拷貝數(shù)，例如通過將該基因置于多拷貝質(zhì)粒上，或通過將基因的多拷貝納入宿主細(xì)胞的染色體中(這些拷貝可摻入染色體的同一位置或在染色體的不同位置)。
[0254]提高雙官能C7烷的產(chǎn)生(如附圖中顯示和前述部分描述的)還可以通過使得任一種能將底物、任意中間物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)向到并非本方法目標(biāo)的代謝途徑中的酶的活性失活或降低。因此，可降低酶活性以增加雙官能C7烷的產(chǎn)率。如此，在一些實(shí)施方案中，本文中公開的重組宿主細(xì)胞可在能將本發(fā)明方法的起始材料或在產(chǎn)生雙官能C7烷的反應(yīng)途徑中產(chǎn)生的任意中間物轉(zhuǎn)向成不同的、不想要的終產(chǎn)物的一種或多種酶中具有缺陷(例如通過缺失編碼感興趣酶的核酸或降低核酸的表達(dá))。在一個(gè)備選方案中，所述酶未缺失，而是改變?yōu)槭蛊湟缘陀谝吧兔傅乃俾首饔糜诘孜?、中間物或產(chǎn)物。在其中酶催化可逆反應(yīng)的情況中，所述酶應(yīng)改變?yōu)槭蛊鋬H以期望的反應(yīng)方向作用。
[0255]例如，在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞可在能將庚二酰_[acp]轉(zhuǎn)化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)或?qū)?-羧基己?；?CoA (庚二酰-CoA)轉(zhuǎn)化成KAPA的酶中具有缺陷(例如BioF的缺失或失活，該基因編碼7-酮-8-氨基壬酸合成酶(E.C.2.3.1.47))。
[0256]在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞可在二氨基庚二酸脫羧酶中具有缺陷，其創(chuàng)建賴氨酸營養(yǎng)缺陷型。賴氨酸營養(yǎng)缺陷型對(duì)于D, L 二氨基庚二酸(賴氨酸的中間前體)的碳通量的去調(diào)節(jié)可尤其有用。賴氨酸營養(yǎng)缺陷型將需要補(bǔ)料分批發(fā)酵。
[0257]2.10生長全細(xì)胞生物催化劑
[0258]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用在實(shí)施本發(fā)明方法中轉(zhuǎn)化時(shí)生長(即分裂)的宿主細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在優(yōu)化期望雙官能C7烷產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)?？膳囵B(yǎng)本文中所述的任一種重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生和/或分泌本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。如本文中使用的，術(shù)語培養(yǎng)等同于發(fā)酵罐和生物反應(yīng)器。
[0259]2.10.1 培養(yǎng)基 [0260]在一些情況中，用于生長的碳源將以營養(yǎng)液，例如Luria培養(yǎng)基或酵母提取培養(yǎng)基的形式提供。在其他情況中，可使用適于宿主細(xì)胞生長的限定培養(yǎng)基(即，其中每種組分濃度已知的培養(yǎng)基)。在一個(gè)備選方案中，生長培養(yǎng)基包含葡萄糖作為碳源。在另一個(gè)備選方案中，宿主細(xì)胞使用的培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。
[0261]2.10.2多種菌株在相同培養(yǎng)物中的生長
[0262]在一些實(shí)施方案中，催化本發(fā)明方法中轉(zhuǎn)化的酶存在于超過一種菌株/物種的細(xì)胞中，其中同時(shí)使用那些超過一種菌株/物種的細(xì)胞。在其中當(dāng)實(shí)施本發(fā)明方法中的轉(zhuǎn)化時(shí)多種菌株/物種在生長的情況中(即細(xì)胞在共培養(yǎng))，選擇的菌株/物種必須選擇為使得一種菌株不與其他菌株競爭。這類關(guān)系可通過向共培養(yǎng)物引入人工共生獲得。即，使用的兩種菌株/物種對(duì)于必要但是不同的養(yǎng)分各自為營養(yǎng)缺陷的。此外，其他菌株應(yīng)工程化為產(chǎn)生過量的該養(yǎng)分，從而使得兩種菌株在培養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基不包含這兩種必要養(yǎng)分時(shí)能在培養(yǎng)物中一起存活。適宜的營養(yǎng)缺陷體的選擇將完全在遵循本文教導(dǎo)的技術(shù)人員的能力以內(nèi)。
[0263]2.10.3 發(fā)酵
[0264]本文所述培養(yǎng)條件可以擴(kuò)大規(guī)模并連續(xù)生長用于制備庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺。例示性的生長規(guī)程包括，例如補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)分離，或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。所有這些工藝均為本領(lǐng)域中公知的。發(fā)酵規(guī)程對(duì)于商業(yè)量的二和三官能C7烷的生物合成產(chǎn)生尤其有用。一般地且如同非連續(xù)培養(yǎng)規(guī)程地，前文描述的庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺的連續(xù)和/或接近連續(xù)產(chǎn)生包括在充足的養(yǎng)分和培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)產(chǎn)生本文所述庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺的重組宿主細(xì)胞以維持和/或近乎維持指數(shù)期生長。在這類條件下的連續(xù)培養(yǎng)可包括例如，I天、2、3、4、5、6或7天或更長。另外，連續(xù)培養(yǎng)可包括I周、2、3、4或5周或更長并長達(dá)數(shù)個(gè)月?；蛘撸绻m合特定應(yīng)用的話，重組細(xì)胞可培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。應(yīng)理解連續(xù)和/或接近連續(xù)培養(yǎng)條件還可包括在這些例示性時(shí)段之間的所有時(shí)間間期。還理解培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞的時(shí)間是用于產(chǎn)生針對(duì)期望目的充足量的產(chǎn)物的充足時(shí)間段。
[0265]發(fā)酵規(guī)程是本領(lǐng)域中公知的。簡言之，用于生物合成產(chǎn)生前文所述庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺的發(fā)酵可以例如，補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)分離，或連續(xù)分離和連續(xù)發(fā)酵利用。分批和連續(xù)發(fā)酵規(guī)程的例子是本領(lǐng)域中公知的。
[0266]除了上文使用本文所述庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7_羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺生產(chǎn)者來連續(xù)生產(chǎn)大量這些的發(fā)酵規(guī)程以外，庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚內(nèi)酰胺生產(chǎn)者還可以例如，同時(shí)進(jìn)行別的規(guī)程以將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成其他化合物，或使產(chǎn)物可與發(fā)酵培養(yǎng)物分開并序貫進(jìn)行化學(xué)或生物催化轉(zhuǎn)化以如期望的將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成其他化合物。
[0267]2.11本發(fā)明的組合物
[0268]本發(fā)明還提供包含依照本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞以及庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羥基庚酸、7-羥基庚醛、7-氨基庚酸、七亞甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇和庚內(nèi)酰胺的組合物。本發(fā)明還提供包含依照本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞和原料的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述原料是可再生原料，例如其中所述原料選自下組:葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。在一些實(shí)施方案中，所述原料是多芳香烴，例如苯、甲苯或莽草酸。
[0269]3.1實(shí)施例
[0270] 在一般性描述本發(fā)明后，通過對(duì)以下實(shí)施例的提述將會(huì)更容易地理解本發(fā)明，其通過例示提供且不意圖為限制的。理解可對(duì)本文中公開的例示性實(shí)施方案進(jìn)行各種修改和變化，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
[0271]3.1.1通過氨裂合酶(EC4.3.1.-)的2，6_ 二氨基庚二酸酯到2_氨基_5，6_脫氫庚二酸(6-氨基-2-庚烯二元酸)和2-氨基庚二酸到2-庚烯二元酸的轉(zhuǎn)化(見圖10)
[0272]3.1.1.1詵擇MAL酶某閔靶物
[0273]在鑒定了涉及2，6- 二氨基庚二酸到庚二酸(其用于產(chǎn)生尼龍7，7)的轉(zhuǎn)化和庚二酸到7-氨基庚酸的轉(zhuǎn)化的途徑后，選擇來自這些途徑的基因靶物。具體地，選擇來自包括甲基天冬氨酸氨裂合酶(MAL ;EC4.3.1.2)在內(nèi)的氨裂合酶家族(EC4.3.1)的酶靶物，該選擇基于其廣泛底物特異性、在大范圍宿主中的存在、被克隆和外源表達(dá)的能力和用于合理設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程的可獲晶體結(jié)構(gòu)。選擇來自無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)、假破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetanomorphum)和米曲霉的MAL基因。由無丙二酸檸檬酸桿菌(GeneBank AB005294 ;片段 1641-2882878596..879060NM_NM)和假破傷風(fēng)梭菌(GeneBank S48141 ;片段756-1997)編碼的MAL酶具有顯著的相異性(57%同一性)。米曲霉MAL基因(GeneBank XMOO1827609)是進(jìn)化趨異的(與無丙二酸檸檬酸桿菌MAL44%同一性，與假破傷風(fēng)梭菌MAL39%同一性)，其可顯示不同的催化特性和/或選擇性。另一種不尋常的氨裂合酶(其為用于2，6-二氨基庚二酸酯和2-氨基庚二酸的還原性脫氨基化的潛在酶的)是來自突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)的D-葡糖氨酸氨裂合酶(EC4.3.1.9)(登錄號(hào)BAD69624)。這是一種催化α，β -消除的不尋常的氨裂合酶:
[0274]D-葡糖氨酸一 >2-脫氫-3-脫氧-D-葡糖酸+NH3
[0275]
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自2，6 二氨基庚二酸鹽(2，6DAP)和α -氨基-庚二酸鹽(AAP)的化合物與催化2，6DAP到6_氨基-2-庚烯二酸(6Α2ΗΑ)的還原性脫氨基化或AAP到2-庚烯二酸(2HDA)的還原性脫氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生6Α2ΗΑ或 2HDA。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是2，6DAP。
3.權(quán)利要求2的方法，其還包括使所述6Α2ΗΑ與催化6Α2ΗΑ到AAP的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生ΑΑΡ。
4.權(quán)利要求3的方法，其還包括使所述AAP與催化AAP到2HDA的還原性脫氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA。
5.權(quán)利要求4的方法，其還包括使所述2HDA與催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
6.權(quán)利要求5的方法，其還包括使所述PA與催化PA到庚二酸半醛(PAS)的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
7.權(quán)利要求6的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7-氨基-庚酸(7ΑΗΑ)的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
8.權(quán)利要求7的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到庚內(nèi)酰胺(ENTL)的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
9.權(quán)利要求7的方 法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7-氨基-庚醛(7ΑΗΤ)的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生AHT。
10.權(quán)利要求9的方法，其還包括使所述7ΑΗΤ與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生1，7- 二氨基庚烷(1，7DAH)的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
11.權(quán)利要求4的方法，其還包括使所述2HDA與催化輔酶A(CoA)到2HAD的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2-庚烯二酸-CoA (2HDA-CoA)的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA_CoA。
12.權(quán)利要求11的方法，其還包括使所述2HDA-CoA與催化2HDA_CoA到庚二酰-CoA(PCoA)的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PCoA。
13.權(quán)利要求12的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
14.權(quán)利要求13的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
15.權(quán)利要求14的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
16.權(quán)利要求15的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
17.權(quán)利要求15的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
18.權(quán)利要求17的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
19.權(quán)利要求4的方法，其還包括使所述AAP與催化氨基基團(tuán)到AAP的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α-酮-庚二酸鹽(AKP)的酶接觸，其中產(chǎn)生ΑΚΡ。
20.權(quán)利要求19的方法，其還包括使所述AKP與催化AKP到α-羥基-庚二酸鹽(AHP)的酮還原的一種或多種酶接觸，其中產(chǎn)生ΑΗΡ。
21.權(quán)利要求20的方法，其還包括使所述AHP與催化CoA到AHP的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α-羥基-庚二酸鹽(AHP-CoA)的酶接觸，其中產(chǎn)生AHP-CoA。
22.權(quán)利要求21的方法，其還包括使所述AHP-CoA與催化AHP-CoA到2HDA_CoA的脫水的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA-CoA。
23.權(quán)利要求22的方法，其還包括使所述2HDA-CoA與催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PCoA。
24.權(quán)利要求23的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
25.權(quán)利要求24的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
26.權(quán)利要求25的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
27.權(quán)利要求26的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
28.權(quán)利要求26的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
29.權(quán)利要求28的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
30.權(quán)利要求20的方法，其還包括使所述AHP與催化AHP到2HDA的脫水的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA。
31.權(quán)利要求30的方法，其還包括使所述2HDA與催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
32.權(quán)利要求31的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
33.權(quán)利要求32的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
34.權(quán)利要求33的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
35.權(quán)利要求33的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
36.權(quán)利要求35的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
37.權(quán)利要求30的方法，其還包括使所述2HDA與催化CoA到2HAD的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生2HDA-CoA的酶接觸，其中產(chǎn)生2HDA-CoA。
38.權(quán)利要求37的方法，其還包括使所述2HDA-CoA與催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PCoA。
39.權(quán)利要求38的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
40.權(quán)利要求39的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
41.權(quán)利要求40的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
42.權(quán)利要求41的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
43.權(quán)利要求41的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
44.權(quán)利 要求43的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
45.權(quán)利要求19的方法，其還包括使所述AKP與催化AKP到α-酮-辛二酸鹽(AKS)的α-酮酸鏈延伸的酶接觸，其中產(chǎn)生AKS。
46.權(quán)利要求45的方法，其還包括使所述AKS與催化氨基基團(tuán)到AKS的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生α-氨基辛二酸鹽(AAS)的酶接觸，其中產(chǎn)生AAS。
47.權(quán)利要求46的方法，其還包括使所述AAS與催化AAS到7ΑΗΑ的α-酮酸脫羧化的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
48.權(quán)利要求47的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
49.權(quán)利要求47的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΤ。
50.權(quán)利要求49的方法，其還包括使所述7ΑΗΤ與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
51.權(quán)利要求45的方法，其還包括使所述AKS與催化AKS到PAS的α-酮酸脫羧化的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
52.權(quán)利要求51的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
53.權(quán)利要求52的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
54.權(quán)利要求52的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΤ。
55.權(quán)利要求54的方法，其還包括使所述7ΑΗΤ與催化氨基基團(tuán)到7ΑΗΤ的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
56.權(quán)利要求23的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
57.權(quán)利要求56的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7ΑΗΑ。
58.權(quán)利要求57的方法，其還包括使所述7ΑΗΑ與催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
59.權(quán)利要求57的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
60.權(quán)利要求59的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I, 7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
61.權(quán)利要求38的方法，其還包括使所述PCoA與催化PCoA到PAS的還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
62.權(quán)利要求61的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
63.權(quán)利要求62的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
64.權(quán)利要求62的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
65.權(quán)利要求64的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I,7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
66.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自6A2HA和2HDA的化合物與催化6A2HA到AAP的烯酸還原或2HDA到PA的烯酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生AAP或PA。
67.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自PCoA和庚二酰[acp] (PACP)的化合物與催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接觸，其中產(chǎn)生PA。
68.權(quán)利要求67的方法，其還包括使所述PA與催化PA到PAS的羧酸還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
69.權(quán)利要求68的方法，其還包括使所述PAS與催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHA。
70.權(quán)利要求69的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接觸，其中產(chǎn)生ENTL。
71.權(quán)利要求69的方法，其還包括使所述7AHA與催化7AHA到7AHT的醛脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7AHT。
72.權(quán)利要求71的方法，其還包括使所述7AHT與催化氨基基團(tuán)到7AHT的轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生I,7DAH的酶接觸，其中產(chǎn)生1，7DAH。
73.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使AKP與催化AKP到AHP的酮還原的一種或多種酶接觸，其中產(chǎn)生ΑΗΡ。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述AKP通過α-酮己二酸或α-酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn)生。
75.權(quán)利要求73的方法，其進(jìn)一步包括AHP到PA或到PcoA的轉(zhuǎn)化。
76.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括通過α-酮酸鏈延伸將AKP轉(zhuǎn)化為AKS。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述AKP通過α-酮己二酸或α-酮戊二酸的鏈延伸產(chǎn)生。
78.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使所述PAS與催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接觸，其中產(chǎn)生7AM。
79.權(quán)利要求78的方法，其中通過從2，6DAP、AKG、PCoA或PACP的轉(zhuǎn)化獲得所述PAS。
80.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使選自PCoA和PACP的化合物與催化該化合物到PAS還原的酶接觸，其中產(chǎn)生PAS。
81.一種轉(zhuǎn)化化合物的方法，所述方法包括使PAS與催化PAS到7-羥基-庚酸(7HHA)的醇脫氫的酶接觸，其中產(chǎn)生7HHA。
82.權(quán)利要求1-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶、或一種或多種酶是純化的酶。
83.權(quán)利要求1-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶、或一種或多種酶在細(xì)胞裂解物或部分純化的細(xì)胞裂解物中。
84.權(quán)利要求1-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶、或一種或多種酶在重組表達(dá)其的細(xì)胞中。
85.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酶包含氨裂合酶。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述氨裂合酶是EC4.3.1中的氨裂合酶。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述EC4.3.1中的氨裂合酶包括EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;或 EC4.3.1.24。
88.權(quán)利要求3、5、12、23、31、38和66中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括烯酸還原酶。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述烯酸還原酶包括ECl.3.1中的烯酸還原酶。
90.權(quán)利要求89 的方法，其中所述ECl.3.1中的烯酸還原酶包括ECl.3.1.31。
91.權(quán)利要求6、14、25、32、40和68中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括羧酸還原酶。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述羧酸還原酶包括ECl.2.99中的羧酸還原酶。
93.權(quán)利要求92的方法，其中所述ECl.2.99中的羧酸還原酶包括ECl.2.99.6。
94.權(quán)利要求7、15、26、33、52、57、62、69和78中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括ω轉(zhuǎn)氨酶。
95.權(quán)利要求94的方法，其中所述ω轉(zhuǎn)氨酶包括EC2.6.1中的轉(zhuǎn)氨酶。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述EC2.6.1中的ω轉(zhuǎn)氨酶包括EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ；或 EC2.6.1.68。
97.權(quán)利要求13、24、39、56、61和67中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包含硫酯酶、酸-硫醇連接酶或CoA轉(zhuǎn)移酶。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述硫酯酶包含EC3.1.2中的硫酯酶。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述EC3.1.2中的硫酯酶包括EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 ；或 EC3.1.2.20。
100.權(quán)利要求97的方法，其中所述酸-硫醇連接酶包括EC6.2.1中的酸-硫醇連接酶。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述EC6.2.1中的酸-硫醇連接酶包括EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 jEC6.2.1.23。
102.權(quán)利要求97的方法，其中所述CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
104.權(quán)利要求10、18、19、29、36、44、46、50、60、65和72中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括氨基轉(zhuǎn)移酶。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述氨基轉(zhuǎn)移酶包含EC2.6.1中的氨基轉(zhuǎn)移酶。
106.權(quán)利要求105的方法，其中所述EC2.6.1中的氨基轉(zhuǎn)移酶包括EC2.6.1.67。
107.權(quán)利要求20或73的方法，其中所述一種或多種酶包括羰基還原酶。
108.權(quán)利要求107的方法，其中所述羰基還原酶包括EC.1.1.1.184。
109.權(quán)利要求47或51的方法，其中所述酶包括α-酮酸脫羧酶。
110.權(quán)利要求56、61、或80的方法，其中所述酶包括脂肪-?；?CoA還原酶。
111.權(quán)利要求110的方法，其中所述脂肪-?；?CoA還原酶是ECl.2.1中的還原酶。
112.權(quán)利要求111的方法，其中所述ECl.2.1中的脂肪-?；?CoA包括ECl.2.1.50。
113.權(quán)利要求9、15、28、35、43、49、55、59、64和71中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括醛脫氫酶。
114.權(quán)利要求113的方法，其中所述醛脫氫酶包括ECl.2.1中的醛脫氫酶。
115.權(quán)利要求114的方法，其中所述ECl.2.1中的醛脫氫酶包括ECl.2.1.4或ECl.2.1.63。
116.權(quán)利要求11、21和37中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包括CoA轉(zhuǎn)移酶。
117.權(quán)利要求116的方法，其中所述CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
119.權(quán)利要求8、16、27、34、42、48、53、58、63和70中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶是酰胺水解酶。
120.權(quán)利要求22或30的方法，其中所述酶包括水裂合酶。
121.權(quán)利要求120的方法，其中所述水裂合酶包括EC4.2.1中的水裂合酶。
122.權(quán)利要求121的方法，其中所述EC4.2.1中的水裂合酶包括EC4.2.1.2 ；EC4.2.1.59 ；4.2.1.61 ；4.1.2.17 或 4.1.2.18。
123.權(quán)利要求45、74、76和77中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-酮酸鏈延伸由包含以下的酶組中的一種或多種催化:AksA、AksD, AksE和AksF。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述AksA包括EC2.3.3中的AksA酶。
125.權(quán)利要求124的方法，其中所述EC2.3.3中的AksA酶包括EC2.3.3.13或2.3.3.14。
126.權(quán)利要求123的方法，其中所述AksD包括EC4.2.1中的AksD酶。
127.權(quán)利要求126的方法，其中所述EC4.2.1中的AksD酶包括EC4.2.1.33。
128.權(quán)利要求123的方法，其中所述AksF包括ECl.1.1中的AksF酶。
129.權(quán)利要求128的方法，其中所述ECl.1.1.中的AksF酶包括ECl.1.1.85。
130.權(quán)利要求45、74、76和77中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種ct-酮酸鏈延伸酶來自產(chǎn)甲烷的細(xì)菌。
131.權(quán)利要求81的方法，其中所述酶包括醇脫氫酶。
132.權(quán)利要求131的方法，其中所述醇脫氫酶包括EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。
133.權(quán)利要求131的方法,其中所述醇脫氫酶選自來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的丁醇脫氧酶、酵母屬(Saccharomyces) ADHIV、和來自釀酒酵母(S.cerevisiae)的 ADH6。
134.權(quán)利要求67或80的方法，其中所述PCoA或PACP源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA。
135.權(quán)利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自可再生原料，包括纖維素原料、糖、甘油或脂肪酸。
136.權(quán)利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自合成氣(SynGas)、甲烷或甲醇。
137.權(quán)利要求134的方法，其中所述苯甲酰-CoA源自多環(huán)芳香烴。
138.權(quán)利要求1、2和79中任一項(xiàng)的方法，其中所述2，6DAP由缺少二氨基庚二酸脫羧酶的產(chǎn)賴氨酸生物體產(chǎn)生。
139.權(quán)利要求1、2、79和138中任一項(xiàng)的方法，其中所述2，6DAP源自可再生原料。
140.權(quán)利要求139的方法，其中所述可再生原料包括糖。
141.一種生物衍生的尼龍_7、尼龍-7，X或尼龍-X, 7。
142.由包括聚合7AHA的工藝產(chǎn)生的尼龍_7，其中所述7AHA源自PAS或AAS。
143.由包括聚合PA和1，7DHA的工藝產(chǎn)生的尼龍_7，7，其中所述PA源自PCoA；PACP ；或 2HDA 而 1，7DHA 源自 7AHA。
144.由包括聚合7AHA 的工藝產(chǎn)生的尼龍_7，其中7AHA由包括以下方法步驟的方法制備: ⑴權(quán)利要求2-7 ； (ii)權(quán)利要求2-4和11-15； (iii)權(quán)利要求2-4和19-26； (iv)權(quán)利要求2-4、19-20 和 30-33 ；
(V)權(quán)利要求 2-4、19-20、30 和 37-41 ； (vi)權(quán)利要求2-4、19 和 45-47 ；
(vii)權(quán)利要求2-4、19、45 和 51-52 ;
(viii)權(quán)利要求2-4、19-23 和 56-57 ；
(ix)權(quán)利要求2-4、19-20、30、37-38 和 61-62 ； (X)權(quán)利要求67-69 ； (xi)權(quán)利要求73-75； (xii)權(quán)利要求76-77； (xiii)權(quán)利要求78-79;或 (xiv)權(quán)利要求80。
145.由包括聚合1，7DHA和PA的工藝產(chǎn)生的尼龍7，7，其中1，7DHA由包括以下方法步驟的方法制備: (a)權(quán)利要求2-7和9-10; (b)權(quán)利要求2-4、11-15 和 17-18 ； (c)權(quán)利要求2-4、19-26 和 28-29 ；
(d)權(quán)利要求2-4、19-20、30-33 和 35-36 ；
(e)權(quán)利要求2-4、19-20、37-41 和 43-44 ；
(f)權(quán)利要求2-4、19、45-47 和 49-50 ；
(g)權(quán)利要求2-4、19、45、51-52 和 54-55 ；(h)權(quán)利要求2-4、19-23 和 56-60 ；
(i)權(quán)利要求2-4、19-20、37-38 和 61-65 ； (j)權(quán)利要求67-69和71-72 ； (k)權(quán)利要求73-75 ； (I)權(quán)利要求76-77 ； (m)權(quán)利要求78-79 ;或 (η)權(quán)利要求80，且 其中PA由包括以下方法步驟的方法制備: (ο)權(quán)利要求2-5 ； (P)權(quán)利要求2-4和11-13 ； (q)權(quán)利要求2-4和19-24 ； (r)權(quán)利要求 2-4、19-20 和 30-31 ；
(s)權(quán)利要求 2-4、19-20、30 和 37-39 ；
(t)權(quán)利要求67 ;或 (U)權(quán)利要求73-75。
146.一種基本純的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其實(shí)質(zhì)數(shù)目包含一種或多種編碼涉及選自7AHA;PA ;1，7DAH ；ENTL ;和7HHA的一種或多種聚合物單體的生物合成的一種或多種酶的外源核酸，其中所述酶選自下組:酰基-CoA還原酶、?；鵞acp]還原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、硫酯酶、羧酸還原酶、脂肪-?；鵆oA還原酶、ω -轉(zhuǎn)氨酶、α -酮酸脫羧酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶、和催化α-酮酸鏈延伸的酶。
147.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
148.權(quán)利要求147的培養(yǎng)物,其中所述原核細(xì)胞選自下組:大腸桿菌(Escherichiacoli)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘氨醇單胞菌(sphingomonads)、產(chǎn)甲燒的細(xì)菌(例如Methanobacterium autotrophicum)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、沙門氏菌屬(Salmonella)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacteria)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、短桿菌屬(Brevibacterium)、鏈球菌屬(Streptococci)、乳桿菌屬(Lactobacilli)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、梭菌屬(Clostridium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、和節(jié)桿菌屬(Arthobacter)。
149.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
150.權(quán)利要求149的培養(yǎng)物，其中所述真核細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
151.權(quán)利要求150的培養(yǎng)物，其中所述真菌細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
152.權(quán)利要求151的培養(yǎng)物，其中所述酵母細(xì)胞是選自以下組的酵母的細(xì)胞:解脂西洋蓄霉(Yarrowia Iipolytica)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、伊薩酵母屬(Issatchenka)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)。
153.權(quán)利要求152的培養(yǎng)物，其中所述假絲酵母細(xì)胞是選自下組的酵母的細(xì)胞:熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、白色假絲酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guiIlermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis 和 C.Zeylenoides0
154.權(quán)利要求150的培養(yǎng)物，其中所述真菌細(xì)胞是選自下組的真菌的細(xì)胞:曲霉屬(Aspergillus)、外瓶霉屬(Exophiala)、毛霉屬(Mucor)、木霉屬(Trichoderma)、枝抱屬(Cladosporium)、平革菌屬(Phanerochaete)、Cladophialophora、擬青霉屬(Paecilomyces)、Scedosporium 和 Ophiostoma0
155.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述氨裂合酶包括EC4.3.1中的氨裂合酶。
156.權(quán)利要求155的培養(yǎng)物，其中所述EC4.3.1中的氨裂合酶包括EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;或 EC4.3.1.24。
157.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述烯酸還原酶包括ECl.3.1中的烯酸還原酶。
158.權(quán)利要求157的培養(yǎng)物，其中所述ECl.3.1中的烯酸還原酶包括ECl.3.1.31。
159.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述羧酸還原酶包括ECl.2.99中的羧酸還原酶。
160.權(quán)利要求159的培養(yǎng)物，其中所述ECl.2.99中的羧酸還原酶包括ECl.2.99.6。
161.權(quán)利要求160的培養(yǎng)物，其中所述ω-轉(zhuǎn)氨酶包括EC2.6.1中的轉(zhuǎn)氨酶。
162.權(quán)利要求161的培養(yǎng)物，其中所述EC2.6.1中的ω -轉(zhuǎn)氨酶包括EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ；或 EC2.6.1.68。
163.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述硫酯酶包括EC3.1.2中的硫酯酶。
164.權(quán)利要求163的培養(yǎng)物，其中所述EC3.1.2中的硫酯酶包括EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 jEC3.1.2.20。
165.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述酸-硫醇連接酶包括EC6.2.1中的酸-硫醇連接酶。
166.權(quán)利要求165的培養(yǎng)物，其中所述EC6.2.1中的酸-硫醇連接酶包括EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 ^EC6.2.1.23。
167.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶。
168.權(quán)利要求167的培養(yǎng)物，其中所述EC2.8.3中的CoA轉(zhuǎn)移酶包括EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
169.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述氨基轉(zhuǎn)移酶包括EC2.6.1中的氨基轉(zhuǎn)移酶。
170.權(quán)利要求169的培養(yǎng)物，其中所述EC2.6.1中的氨基轉(zhuǎn)移酶包括EC2.6.1.67。
171.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述羰基還原酶包括EC.1.1.1.184。
172. 權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述脂肪-?；?CoA還原酶包括ECl.2.1中的還原酶。
173.權(quán)利要求172的培養(yǎng)物，其中所述ECl.2.1中的脂肪-?；?CoA包括ECl.2.1.50。
174.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述醛脫氫酶包括ECl.2.1中的醛脫氫酶。
175.權(quán)利要求174的培養(yǎng)物，其中所述ECl.2.1中的醛脫氫酶包括ECl.2.1.4或ECl.2.1.63。
176.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述水裂合酶包括EC4.2.1中的水裂合酶。
177.權(quán)利要求176的培養(yǎng)物，其中所述EC4.2.1中的水裂合酶包括EC4.2.1.2 ;EC4.2.1.59 ；4.2.1.61 ；4.1.2.17 或 4.1.2.18。
178.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述催化α-酮酸鏈延伸的酶包括選自包含以下的酶組中的一種或多種酶:AksA、AksD, AksE和AksF酶。
179.權(quán)利要求178的培養(yǎng)物，其中所述AksA包括EC2.3.3中的AksA酶。
180.權(quán)利要求179的培養(yǎng)物，其中所述EC2.3.3中的AksA酶包括EC2.3.3.13或2.3.3.14。
181.權(quán)利要求178的培養(yǎng)物，其中所述AksD包括EC4.2.1中的AksD酶。
182.權(quán)利要求181的培養(yǎng)物，其中所述EC4.2.1中的AksD酶包括EC4.2.1.33。
183.權(quán)利要求178的培養(yǎng)物，其中所述AksF包括ECl.1.1中的AksF酶。
184.權(quán)利要求183的培養(yǎng)物，其中所述ECl.1.1.中的AksF酶包括ECl.1.1.85。
185.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述醇脫氫酶包括EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。
186.權(quán)利要求146的培養(yǎng)物，其中所述醇脫氫酶選自來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhA、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhB、來自丙酮丁醇梭菌的丁醇脫氫酶、酵母屬ADHIV、和來自釀酒酵母的ADH6。
187.—種分離的細(xì)胞，其包含一種或多種編碼涉及選自7AHA;PA;1，7DAH;ENTL;和7HHA的一種或多種聚合物單體的生物合成的一種或多種酶的外源核酸，其中所述酶選自下組:?；鵆oA還原酶、酰基[acp]還原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸還原酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、酸-硫醇連接酶、水裂合酶、羰基還原酶、羧酸還原酶、脂肪-酰基CoA還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、α-酮酸脫羧酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶、和催化α-酮酸鏈延伸的酶。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK104011216SQ201280042460
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月30日
【發(fā)明者】P.S.珀?duì)柭? 陳昌林, A.L.波特斯, A.V.E.康拉蒂, B.D.赫佐格 申請(qǐng)人:英威達(dá)技術(shù)有限責(zé)任公司