通過(guò)一體化酶生產(chǎn)進(jìn)行的高效木質(zhì)纖維素水解的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)任選地已進(jìn)行了預(yù)處理。其基于在機(jī)械或化學(xué)處理的能夠產(chǎn)生各自水解酶的微生物存在的情況下生物質(zhì)的水解功效得到增強(qiáng)的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明從而提供了利用一體化生產(chǎn)的酶混合物降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供了其中任選地將經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的部分摻入真菌的終生長(zhǎng)培養(yǎng)基的方法。
【專利說(shuō)明】通過(guò)一體化酶生產(chǎn)進(jìn)行的高效木質(zhì)纖維素水解
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明提供了用于從木質(zhì)纖維素原料生物技術(shù)產(chǎn)生單體化合物例如糖和/或乙醇的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]由于有限的礦物油資源以及對(duì)要求減少CO2排放的原因，化學(xué)工業(yè)尋求更加可持續(xù)的生產(chǎn)途徑來(lái)制造大宗化學(xué)產(chǎn)品例如液體燃料和基礎(chǔ)化學(xué)品(base chemicals) 0該策略的一部分關(guān)注在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)至通用化學(xué)品或燃料例如乙醇的轉(zhuǎn)化。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)包含纖維素(-25-40% w/w d.s.)、半纖維素(-15-25% w/w d.s.)和木質(zhì)素(-15-30% w/w d.s.)(作為主要組分)和少量其它碳水化合物、臘、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)化合物?？扇鏢luiter等人，2008所述測(cè)定任何原料的具體組成。在植物生物質(zhì)的形式當(dāng)中，由于它們可用性、低成本和環(huán)境友好的生產(chǎn)，來(lái)源于任何林業(yè)和農(nóng)業(yè)廢物流例如木材殘?jiān)凸炔莸哪举|(zhì)纖維素生物質(zhì)特別適合用于至大宗化學(xué)產(chǎn)品和燃料的轉(zhuǎn)化。此外，利用木質(zhì)纖維素原料的生產(chǎn)過(guò)程的生命周期分析顯示相較于基于其它原料的方法減少的溫室氣體排放。
[0004]描述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)至乙醇和其它基礎(chǔ)化學(xué)品的轉(zhuǎn)化的各種方法選擇已進(jìn)行了描述(Pejo等人，2008)。為了在工業(yè)規(guī)模上實(shí)現(xiàn)這些方法，特別期望將可再生原料中包含的最大量的能量、碳和物質(zhì)成分(mass content)轉(zhuǎn)移至終產(chǎn)物。目前已描述的轉(zhuǎn)化方法都未最大限度地實(shí)現(xiàn)該期望。
[0005]木質(zhì)纖維素材料(例如稻草)至附加值產(chǎn)品(例如乙醇)的生物技術(shù)轉(zhuǎn)化的典型單元操作(unit operations)是:機(jī)械退衆(zhòng)(mechanical de-sizing)、物理-化學(xué)預(yù)處理、酶促水解、發(fā)酵和產(chǎn)物回收。
[0006]實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模纖維素乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵障礙是對(duì)高固相濃度(solidsconcentrations)的預(yù)處理的木質(zhì) 纖維素的成本效益的酶促水解。
[0007]纖維素級(jí)分的水解已被鑒定為木質(zhì)纖維素至乙醇的轉(zhuǎn)化的主要障礙之一。目前高效生物質(zhì)水解所需的酶成本和性能是主要瓶頸。
[0008]木材或農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維素材料至糖以及進(jìn)一步至乙醇的轉(zhuǎn)化是包括多個(gè)步驟的復(fù)雜過(guò)程，其包括機(jī)械生物質(zhì)退漿、水熱預(yù)處理、酶促或化學(xué)生物質(zhì)水解、生物質(zhì)水解物的微生物發(fā)酵和通過(guò)蒸餾或等同技術(shù)進(jìn)行下游的乙醇回收的連續(xù)組合。
[0009][機(jī)械生物質(zhì)退漿]
[0010]典型退漿步驟包括原料的機(jī)械處理例如切割、碾磨或研磨，這通常需要消耗大量能量并且造成顯著的操作成本。將原料切割或碾磨成尺寸0.5_至2cm的顆粒，這使得能夠在水相中產(chǎn)生均勻的懸浮物。將原料顆粒懸浮成可被轉(zhuǎn)移至下游單元操作的可泵漿料需要大量的水，這進(jìn)一步增加了方法的操作成本(Tolan，2002)。
[0011][預(yù)處理]
[0012]木質(zhì)纖維素材料至產(chǎn)物例如乙醇的轉(zhuǎn)化通常包括物理-化學(xué)預(yù)處理步驟。預(yù)處理目標(biāo)在于從纖維素除去和分離半纖維素、破壞和除去木質(zhì)素鞘、降低纖維素的結(jié)晶度、增加纖維素的可觸及的表面面積、和/或增加纖維素的孔徑，以促進(jìn)水解試劑的透入(Tolan，2002 ；ffyman等人，2005)。所述預(yù)處理步驟優(yōu)選動(dòng)員所述生物質(zhì)的戊糖級(jí)分，同時(shí)其增強(qiáng)含固體纖維素級(jí)分的消化性(Wyman等人,2005)。
[0013]通常使用含水漿料進(jìn)行預(yù)處理步驟。優(yōu)選這樣的漿料具有高固體含量，包含約20至40% (w/w)的原料干物質(zhì)。所述預(yù)處理法通常包括在酸(即H2S04、HC1、H3PO4)或堿(即NH40H、NaOH, Κ0Η、石灰)催化劑不存在或存在的情況下生物質(zhì)的加壓水熱處理(pressurised hydrothermal treatment)(-100-25CTC )，在原料濃度為 0.1 至 15% w/w時(shí)添加所述催化劑(Kumar等人,2009a ；Kumar等人,2009b ；Kumar等人,2009c, Wyman等人，2005)。反應(yīng)時(shí)間從IOs變化至2h，以提供生物質(zhì)組分的高效轉(zhuǎn)化，為生物質(zhì)水解和發(fā)酵作準(zhǔn)備。
[0014]替代性預(yù)處理策略包括與有機(jī)溶劑或離子液體的利用組合的溫和水熱處理以減少生物質(zhì)的不順從性和增溶生物質(zhì)的木質(zhì)素和纖維素組分。這后一類預(yù)處理選擇通常具有更高的成本和有限的效率。
[0015]Chandra等人(2007)描述了在稀酸不存在或存在的情況下的水熱預(yù)處理是減小生物質(zhì)對(duì)水解的不順從性的優(yōu)選方法，因?yàn)槠鋭?dòng)員半纖維素和部分解聚木質(zhì)素而無(wú)需增溶作用。此外，其導(dǎo)致具有巨大表面積的無(wú)定形纖維素，這對(duì)于酶促水解是理想的。
[0016]取決于催化劑性質(zhì)和應(yīng)用的溫度特征，預(yù)處理還可導(dǎo)致可溶性抑制劑的形成，包括醋酸、糖(例如糠醛、HMF)和木質(zhì)素降解物，這可降低下游水解和發(fā)酵過(guò)程的效力(Margeot等人，2009)。為了增加水解和發(fā)酵效力，需要棄去預(yù)處理上清液或可將其脫毒(Tolan,2002)。
[0017][預(yù)處理生物質(zhì)的水解]
[0018]經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿液至可發(fā)酵單體糖的分解可通過(guò)酸或酶催化的水解來(lái)實(shí)現(xiàn)。酶促水解比可比較的化學(xué)(例如基于酸的)方法更具選擇性并且耗能更少，從而在發(fā)酵過(guò)程中提供更有利的過(guò)程經(jīng)濟(jì)學(xué)(process economics)和潛在地更高的乙醇產(chǎn)率。
[0019]酶系統(tǒng)是超過(guò)一種酶促活性的混合物。適當(dāng)?shù)拿赶到y(tǒng)在該意義上是將多聚體糖例如纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成己糖(即葡萄糖)和戊糖(即木糖)單糖的酶系統(tǒng)，其典型地包含纖維素酶、半纖維素酶和葡糖苷酶活性。通常在真菌例如木霉屬種(Trichodermasp.)和/或曲霉菌屬種(Aspergillus sp.)的深層液體培養(yǎng)中產(chǎn)生包含纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的酶系統(tǒng)。通常將真菌生物質(zhì)的殘?jiān)c發(fā)酵液分離并棄去。隨后針對(duì)待運(yùn)送的所得的酶產(chǎn)品，濃縮、穩(wěn)定和調(diào)配所述發(fā)酵液。
[0020]酶促生物質(zhì)水解通常在其中總的酶配量包含1-5% w/w(10-20FPU/g纖維素)原料的條件下進(jìn)行。取決于配量方案和所用的酶系統(tǒng)的具體活性組成，將生物質(zhì)在40-55°C水解1-7天。生物質(zhì)中包含的高達(dá)約80-90% w/w的多聚體糖被轉(zhuǎn)化成它們各自的單體。
[0021]根據(jù)Kristensen等人(2009),通常在10-20% w/w的更低的固體含量下進(jìn)行生物質(zhì)的酶促水解。高于15% w/w的固體含量通常導(dǎo)致單體糖產(chǎn)率的顯著丟失。該效應(yīng)歸因于導(dǎo)致不均勻酶分布的與高固體含量漿料的均勻混合相關(guān)的問(wèn)題。此外，終產(chǎn)物(如在酶促水解過(guò)程中釋放的纖維二糖和葡萄糖)的積累可導(dǎo)致纖維素酶和β_葡糖苷酶活性的內(nèi)在抑制(Xiao 等人，2004a)。
[0022]Cardona&Sanchez (2007)描述了預(yù)處理上清液和/或先前的生物質(zhì)水解物作為用于真菌酶產(chǎn)生的生長(zhǎng)和酶誘導(dǎo)底物的用途。Howard等人(2003)描述了直接使用源自真菌發(fā)酵的廢液發(fā)酵液(spent liquid fermentation broth)用于水解。Rao等人(1985)指出整個(gè)真菌發(fā)酵漿液用于高效水解纖維素底物的應(yīng)用。人工培養(yǎng)基用于水解酶產(chǎn)生，其不允許用于特定原料和/或預(yù)處理選擇的水解酶系統(tǒng)的定制。由Rao等人(1985)公開(kāi)的方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是其限于分泌型酶促活性，因?yàn)闆](méi)有采取任何措施來(lái)促進(jìn)非分泌的或細(xì)胞表面結(jié)合的酶釋放。
[0023]當(dāng)木霉屬來(lái)源的酶系統(tǒng)被用于生物質(zhì)水解，細(xì)胞外葡糖苷酶活性通常因它們相當(dāng)?shù)偷奶禺愋曰钚院驮撨^(guò)程中釋放的葡萄糖對(duì)終產(chǎn)物的顯著抑制而成為限速的和限制產(chǎn)率的(Xiao等人，2004a)，Shewale，1982)。因此，纖維素酶制劑或混合物通常被補(bǔ)充以可備選的葡糖苷酶(BGL)活性當(dāng)它們例如通過(guò)黑曲霉菌產(chǎn)生(Seidle等人，2004)。BGL制劑的標(biāo)準(zhǔn)配量方案推薦添加0.01至2個(gè)纖維二糖酶單位(CBU)/g纖維素以增強(qiáng)水解動(dòng)力學(xué)和單體糖產(chǎn)率(Chauve等人,2010)。
[0024]解決在更高的固體濃度上的生物質(zhì)水解的技術(shù)問(wèn)題的可備選策略包括同時(shí)進(jìn)行酶促水解和發(fā)酵(SSF)的方法。
[0025][乙醇發(fā)酵]
[0026]工業(yè)乙醇生產(chǎn)典型地通過(guò)釀酒酵母(S.cerevisiae)來(lái)進(jìn)行。最近已工程化新型微生物菌株(酵母或細(xì)菌)也來(lái)高效地利用來(lái)源于木質(zhì)纖維素原材料的非葡萄糖的糖。戊糖和所有己糖的利用提高了乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。
[0027][產(chǎn)物回收]
[0028]通常通過(guò)已知的蒸餾和/或提純方法從發(fā)酵培養(yǎng)基回收乙醇。
[0029]待解決的問(wèn)題`
[0030]用于降解生物質(zhì)的常規(guī)技術(shù)或是低效的或是依賴于適于降解特定生物質(zhì)的單獨(dú)生產(chǎn)的酶或酶混合物的費(fèi)時(shí)且昂貴的添加。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供改進(jìn)的用于在避免這些缺點(diǎn)的情況下降解生物質(zhì)例如木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法。
[0031]發(fā)明概述
[0032]本發(fā)明提供用于降解經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟:
[0033]c)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶的微生物，從而獲得包含至少一種酶的富含微生物的懸浮物；
[0034]d)處理步驟c的微生物和/或富含微生物的懸浮物；
[0035]e)使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)與步驟d)的產(chǎn)物一起添加至反應(yīng)器以進(jìn)行生物質(zhì)水解來(lái)獲得可溶性糖。
[0036]任選地，通過(guò)物理-化學(xué)處理從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)獲得經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。步驟c)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可能包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，其優(yōu)選地是經(jīng)預(yù)處理的。在上述具體的實(shí)施方案中，其中培養(yǎng)微生物的終生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含經(jīng)預(yù)處理的漿料的部分，從而用于降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法包括步驟:
[0037]a)物理-化學(xué)預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以獲得經(jīng)預(yù)處理的漿料；
[0038]b)將步驟a)的經(jīng)預(yù)處理的漿料分成兩部分，部分A和部分B ；
[0039]c)將部分A摻入原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基以產(chǎn)生終生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在終生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一種能夠產(chǎn)生至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶的微生物，從而獲得包含所述至少一種酶的富含微生物的懸浮物；[0040]d)處理步驟c的微生物和/或富含微生物的懸浮物；
[0041]e)將部分B和步驟d)的產(chǎn)物一起添加至反應(yīng)器以進(jìn)行生物質(zhì)水解來(lái)獲得可溶性糖。
[0042]在步驟c)中真菌是優(yōu)選的微生物。步驟d)的處理可物理或機(jī)械或化學(xué)地或通過(guò)它們的組合地發(fā)生?？扇芜x地將獲自步驟e)的可溶性糖經(jīng)歷下游轉(zhuǎn)化過(guò)程，例如乙醇產(chǎn)生。為此目的，可進(jìn)行固/液分離，例如以獲得包含可溶性糖的富含糖的液相。
[0043]本發(fā)明提供了用于水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的改進(jìn)的方法。本發(fā)明描述了用于從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)殘?jiān)?其實(shí)例示于圖1中)水解和發(fā)酵以產(chǎn)生乙醇的方法，該方法整合了一體化酶生產(chǎn)的高效利用。
[0044]根據(jù)本發(fā)明，將水解酶的產(chǎn)生整合入方法，優(yōu)選緊連著水解過(guò)程。隨后將包含可溶性酶系統(tǒng)和真菌生物質(zhì)的整個(gè)發(fā)酵漿料用于將木質(zhì)纖維素原料水解成組分糖。使用一部分經(jīng)預(yù)處理的原料作為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行的所述酶系統(tǒng)的一體化生產(chǎn)提供了原料和預(yù)處理選項(xiàng)的最佳靈活性。
[0045]在本發(fā)明的至關(guān)重要的方面，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在酶水解之前物理地或機(jī)械地或化學(xué)地處理微生物生物質(zhì)，特別地機(jī)械剪切真菌生物質(zhì)將導(dǎo)致，相較于使用發(fā)酵上清液或培養(yǎng)液而不處理微生物生物質(zhì)或通過(guò)僅使用發(fā)酵液的澄清上清液中包含的可溶性水解酶組分，更快的水解動(dòng)力學(xué)和更優(yōu)的單體糖(例如葡萄糖)產(chǎn)率。
[0046]本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0047]本發(fā)明包括用于生物質(zhì)例如木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解的改進(jìn)的方法。經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的方法的生物質(zhì)可以是如下描述的任何生物質(zhì)。本文中包括的是包含大的顆?；虼髩K的生物質(zhì)例如木材殘?jiān)?、玉米?桿、甘蔗渣、谷草，從而可任選地在進(jìn)行本發(fā)明的實(shí)際方法之前進(jìn)行機(jī)械退漿。
[0048]可替代的是，大部分生物質(zhì)顆粒，例如90%或更多的顆粒，小至足以在懸浮物(漿料)中處理，即它們具有不大于2cm，優(yōu)選不大于0.5cm,更優(yōu)選不大于2mm的直徑，這樣就不需要機(jī)械退漿了。然而，在進(jìn)行機(jī)械退漿的情況下，如下進(jìn)行退漿:
[0049][機(jī)械退漿]
[0050]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將任何木質(zhì)纖維素生物質(zhì)經(jīng)歷利用裝置例如錘或球磨機(jī)或研磨機(jī)或任何類型的此類適合用于將生物質(zhì)殘?jiān)谐伤槠?其中按質(zhì)量計(jì)90%或更多的顆粒具有不超過(guò)2_的直徑，從而導(dǎo)致小顆粒尺寸的生物質(zhì))的裝置或它們的組合的粗退漿。
[0051][預(yù)處理]
[0052]預(yù)處理的目的是(小顆粒)生物質(zhì)的聚合結(jié)構(gòu)的去穩(wěn)定化和/或部分水解。待經(jīng)歷預(yù)處理的生物質(zhì)通常是干燥的，即沒(méi)懸浮于液相中。隨后使用本領(lǐng)域已知的任何轉(zhuǎn)輸系統(tǒng)(例如傳送帶或螺旋式傳輸機(jī))將該生物質(zhì)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器中。將小顆粒生物質(zhì)轉(zhuǎn)移至耐壓容器并隨后經(jīng)歷預(yù)處理。
[0053]預(yù)處理步驟的產(chǎn)物同義地稱為“漿料”或“經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)”或“經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)”或“經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿料”。
[0054]預(yù)處理可以是化學(xué)預(yù)處理，即利用酸或堿的處理。優(yōu)選，可在酸催化劑存在的情況下進(jìn)行預(yù)處理，在非限定性實(shí)例中所述酸催化劑可選自H2S04、H2N03、HC1、H3P04、S02。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，酸組成是H2S04?？梢?-10% w/w d.s.的原料的濃度使用酸催化劑。在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，將酸濃度調(diào)整至0.1-3% w/w d.s.的原料。
[0055]預(yù)處理可備選地是熱處理，例如暴露于超過(guò)80°C的溫度。然而，最優(yōu)選組合化學(xué)與熱處理。在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，可在大氣壓下或高于大氣壓下進(jìn)行水熱預(yù)處理。在酸催化劑存在下的預(yù)處理還可包括利用熱壓力蒸汽(hot pressurized steam)產(chǎn)生120-250°C的溫度。在這些條件下，可在進(jìn)一步處理生物質(zhì)和進(jìn)行任選的中和步驟之前預(yù)處理生物質(zhì)0.1-60分鐘，這可包括石灰或任何其它堿的應(yīng)用以便反應(yīng)介質(zhì)具有3.5-6的pH。
[0056]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可同時(shí)進(jìn)行退漿和預(yù)處理:其中，優(yōu)選將干燥生物質(zhì)轉(zhuǎn)移至預(yù)處理容器并同時(shí)與水接觸?？蓪⑺疅犷A(yù)處理與生物質(zhì)退漿步驟機(jī)械地偶聯(lián)，以便可以以分批或連續(xù)操作模式進(jìn)行預(yù)處理。作為連續(xù)預(yù)處理模式的非限定性實(shí)例，可在裝配有螺旋式傳輸機(jī)機(jī)械裝置的密閉耐壓容器中進(jìn)行預(yù)處理。
[0057]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，以蒸汽閃爆(steam explosion)模式進(jìn)行水熱預(yù)處理，其中將生物質(zhì)經(jīng)歷高于大氣壓的熱蒸汽注射。蒸汽誘導(dǎo)的壓力優(yōu)選為1-30個(gè)大氣壓(120-25(TC )，將所述生物質(zhì)暴露于所述壓力0.1-60分鐘。此后，突然從反應(yīng)容器釋放壓力，從而將預(yù)處理的生物質(zhì)轉(zhuǎn)移至第二收集容器。用于進(jìn)行蒸汽閃爆預(yù)處理的反應(yīng)容器的非限定性實(shí)例可以是由蒸汽套管反應(yīng)器(由兩個(gè)球閥封閉的哈氏合金管(Hastelloypipe)組成)組成的蒸汽槍反應(yīng)器(steam gun reactor) (Autoclave Engineers, Erie,Pa)。將相關(guān)的電加熱器置于反應(yīng)器的所有暴露的無(wú)套管表面上，并且控制至預(yù)處理設(shè)置點(diǎn)溫度。直接蒸汽注射還用于將生物質(zhì)快速升至預(yù)處理溫度。調(diào)整和控制蒸汽壓以維持期望的預(yù)處理溫度。所有預(yù)處理材料通過(guò)反應(yīng)器底部的可置換模具離開(kāi)并且被收集在于厚壁、加套和冷的自蒸發(fā)罐內(nèi)支撐的尼龍袋中。
[0058]優(yōu)選，以這樣的 方式選擇處理時(shí)間和溫度，以便以最高效和經(jīng)濟(jì)的方式將最大量的生物質(zhì)組成水解成它們的組分單體，而不產(chǎn)生顯著量的降解物例如糠醛。
[0059]常見(jiàn)地，經(jīng)預(yù)處理的原料的木質(zhì)素級(jí)分將在10-70% w木質(zhì)素/w d.s.的經(jīng)預(yù)處理的原料的范圍內(nèi)。經(jīng)預(yù)處理的原料的木質(zhì)素含量可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)量，?列如但不限于:http: //www.nrel.gov/biomass/analytical-procedures.html 上公開(kāi)的那些方法。
[0060]在所述預(yù)處理選項(xiàng)后，所得的生物質(zhì)漿料的干燥固體含量為約10-50% w/wd.s.的原料。選擇的預(yù)處理策略的主要目的是選擇最節(jié)能和最具成本效益的方法，所述方法將以使大部分戊糖級(jí)分溶解并且使纖維素纖維對(duì)于下游水解過(guò)程中使用的酶系統(tǒng)是可及的方式制備木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。將生物質(zhì)轉(zhuǎn)移至特定的單位操作將通過(guò)抽泵或僅通過(guò)重力流動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0061][本發(fā)明的核心方法]
[0062]本發(fā)明提供了用于降解預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，其包括步驟:
[0063]c)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶的微生物，從而獲得包含至少一種酶的富含微生物的懸浮物；
[0064]d)處理步驟c的微生物和/或富含微生物的懸浮物；
[0065]e)使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)與步驟d)的產(chǎn)物一起添加至反應(yīng)器以進(jìn)行生物質(zhì)水解來(lái)獲得可溶性糖。[0066]優(yōu)選地，在該方法中通過(guò)物理-化學(xué)處理例如上述預(yù)處理從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)已獲得經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。
[0067]在本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟c)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，所述生物質(zhì)優(yōu)選已進(jìn)行了預(yù)處理。各種酶促活性例如但不限于分解纖維素和分解半纖維素活性一起形成了酶系統(tǒng)，即酶系統(tǒng)是超過(guò)一種酶促活性的混合物。在一些情況下，這些活性的一種以上可被包含在相同多肽分子內(nèi)，然而，更常見(jiàn)地，酶系統(tǒng)包含數(shù)種例如超過(guò)2種，即超過(guò)3種不同酶促多肽的混合物，其中每一種多肽具有至少一種期望的活性，以便組合活性形成酶系統(tǒng)。
[0068]由本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)。本發(fā)明提供了一體化酶生產(chǎn)，其中隨后將步驟d)中獲得的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)和微生物懸浮物用于生物質(zhì)水解。令人驚訝地顯示，預(yù)處理上清液的存在不影響下游酶促水解或發(fā)酵過(guò)程。此外，令人驚訝地顯示，包含來(lái)自酶生產(chǎn)的菌絲體和上清液的整個(gè)發(fā)酵漿料的使用相較于從所述酶生產(chǎn)獲得的單獨(dú)的發(fā)酵上清液，或相較于可比較的商業(yè)酶制劑，在生物質(zhì)水中顯示更優(yōu)的性能。此外，可顯示生理地和/或機(jī)械地和/或化學(xué)地處理根據(jù)步驟d的微生物提供了細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)水解酶系統(tǒng)的最佳活化，所述酶系統(tǒng)在下游水解操作中協(xié)同作用，從而導(dǎo)致木質(zhì)纖維素原料至單體糖組分例如葡萄糖和木糖的最佳降解。
[0069][酶生產(chǎn)(步驟c)]
[0070]如下表征根據(jù)步驟(C)的酶生產(chǎn):在第一步驟中利用微生物接種經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，所述微生物可以是細(xì)菌、古細(xì)菌、酵母或真菌微生物，其能夠產(chǎn)生分解纖維素和/或分解半纖維素酶促活性。分解纖維素活性是能夠降解例如水解纖維素(例如能夠水解其中的一些或全部糖苷鍵)的活性。分解半纖維素活性是能夠降解例如水解半纖維素(例如能夠水解其中的一些或 全部糖苷鍵)的活性。半纖維素包括構(gòu)件塊例如木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木糖葡聚糖。
[0071]在非限定實(shí)施例中，所述酶促活性包括外切型和內(nèi)切型纖維素酶(即纖維二糖水解酶(CBH) 1、I1、內(nèi)切葡聚糖酶(EG) 1-1V、β -葡萄糖苷酶(BGL))、外切和內(nèi)切半纖維素酶(即木聚糖酶、木糖苷酶、β-木糖苷酶(xylobiase)、阿拉伯糖酶、阿拉伯巖藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶)和酯酶(Howard等人,2003, Lynd等人，2002)。因此，本發(fā)明包括優(yōu)選實(shí)施方案，其中至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶具有一種或多種選自下組的活性:1型或II型纖維二糖水解酶(CBH I或CBHII)、1、I1、III 或 IV 型內(nèi)切葡聚糖酶(EG1、EGI1、EGII1、EGIV)、β-葡糖苷酶(BGL)、酯酶、外切半纖維素酶和內(nèi)切半纖維素酶。更優(yōu)選的是外切半纖維素酶和內(nèi)切半纖維素酶優(yōu)選選自木聚糖酶、木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯巖藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶。
[0072]產(chǎn)生所述酶活性，從而可優(yōu)選地按照本發(fā)明使用的細(xì)菌的非限定性實(shí)例包括不動(dòng)桿菌屬種(Actinobacter sp.)、土壤桿菌屬種(Agrobacterium sp.)、芽孢桿菌屬種(Bacillus sp.)、伯克霍爾德氏菌屬種(Burkholdria sp.)、梭菌屬種(Clostridia sp.)、熱解纖維素菌屬種(Caldicellulosiruptor sp.)、纖維弧菌屬種(Cellvibrio sp.)、鹽桿菌屬種(Halobacterium sp.)、假單胞菌屬種(Pseudomonas sp.)、類芽孢桿菌屬種(Paenibacillus sp.)、黃單胞菌屬種(Xanthomonas sp.)和 Thermobifida sp.(Howard 等人，2003, Maki 等人，2009)。
[0073]產(chǎn)生所述酶，從而優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的古細(xì)菌的非限定性實(shí)例包括火球菌屬種(Pyrochoccus sp.)、Sulphobolus sp.、葡萄嗜熱菌屬種(Staphylothermus sp.)和熱球菌屬種(Thermococcus sp.) (Maki 等人，2009)。
[0074]真菌通常是用于本發(fā)明的最優(yōu)選微生物。可優(yōu)選進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法，以便微生物是真菌，所述真菌優(yōu)選選自:木霉屬種(Trichoderma sp.)、曲霉菌屬種(Aspergillussp.)、青霉屬種(Penicillium sp.)和Talaromyces sp.。產(chǎn)生所述酶活性，從而優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的真菌的非限定性實(shí)例包括曲霉菌屬種、毛殼菌屬種(Chaetomiumsp.)、Chrysosporium sp.、鍵抱霉屬種(Fusarium sp.)、腐質(zhì)霉屬種(Humicola sp.)、Orpinomyces sp.、青霉屬種(Pencillium sp.)、Phanerochaete sp.、Piromyces sp.、Talaromyces sp.、檢菌屬種(Trametes sp.)和木霉屬種或它們各自的全型(holomorphs)(Howard等人,2003)。特別優(yōu)選的是選自木霉屬種和Talaromyces sp.的真菌。
[0075]產(chǎn)生酶的生物的選擇可通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的原料漿液的碳水化合物組成、由特定生物產(chǎn)生的酶活性的量和生物物理特征(包括參數(shù)例如溫度穩(wěn)定性、底物選擇性、比活性和抑制劑耐受性)來(lái)確定。
[0076]為了誘導(dǎo)酶產(chǎn)生，在適宜的生長(zhǎng)溫度下溫育所述微生物，取決于所使用的微生物，所述溫度通常可在14與102°C之間，優(yōu)選28與102°C之間變化。直至開(kāi)始產(chǎn)生酶的溫育時(shí)間可因微生物的類型而 變化很大(Lynd等人，2002)，但可利用由Xiao等人(2004b)或Bobey和Ederer (1981)描述的方法測(cè)試經(jīng)預(yù)處理的原料。
[0077]在本發(fā)明的優(yōu)選方面,酶生產(chǎn)利用絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)(無(wú)性態(tài):Hypocrea jecornia)的纖維素酶產(chǎn)生性菌株來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣的微生物的非限定性實(shí)例是里氏木霉菌株Rut-C30(Lynd等人,2002, Szi jarto等人,2004)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，在經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)(作為唯一的重要碳源)上產(chǎn)生真菌酶系統(tǒng)。優(yōu)選利用真菌例如里氏木霉產(chǎn)生真菌酶系統(tǒng)。可在經(jīng)預(yù)處理的原料漿料上生長(zhǎng)里氏木霉的起始培養(yǎng)物直至孢子出現(xiàn)，其可使用方法例如在0D_nm的分光光度計(jì)測(cè)量來(lái)定量。隨后真菌在恒定的混合(以50-250rpm)和pH、溫度以及氧受控的條件下生長(zhǎng)3_7天。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，至關(guān)重要的是在30°C和pH5下溫育真菌以產(chǎn)生最大量的酶和生物質(zhì)。在第5天，通常實(shí)現(xiàn)最大生物質(zhì)和酶的生產(chǎn)，這使得能夠進(jìn)一步進(jìn)行處理。
[0078]生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常包括碳源、氮源、任選地維生素和痕量礦物質(zhì)。以1-30% w/v，更優(yōu)選1-10% w/v和甚至更優(yōu)選1-8% w/v給培養(yǎng)基提供碳源。碳源可包括天然或經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)例如木材、谷草、甘蔗渣、柳枝稷和纖維素，以及獲自漿料和紙生產(chǎn)的粗制紙漿。備選的碳源可包括純化的纖維素、漿料、乳清、糖蜜或糖例如葡萄糖和乳糖?？墒褂锰荚吹慕M合，其中一種碳源是步驟b)的產(chǎn)物或其等同物，而存在的另外的碳源例如本段中上述的一種碳源。以0.1-10% w/v,更優(yōu)選0.1-8% w/v和甚至更優(yōu)選0.1-4% w/v給培養(yǎng)基提供氮源。氮源包括大豆餅(soybean expel I er)、玉米楽；、酵母提取物、青飼料(磨碎的草)、麥麩、廢酒糟和無(wú)機(jī)銨鹽。以0-5% w/v,更優(yōu)選0.001-1 % w/v給培養(yǎng)基提供維生素和痕量礦物質(zhì)。提供給培養(yǎng)基的痕量礦物質(zhì)可包括Fe、Mn、Zn和Co鹽，而加入培養(yǎng)基的維生素可包括維生素B復(fù)合物、生物素、伴白蛋白。
[0079]用于纖維素酶生產(chǎn)者的有效生長(zhǎng)的確切培養(yǎng)基組成和物理?xiàng)l件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的最終選擇將取決于所使用的微生物。
[0080]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物生物質(zhì)和包含殘留木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以及大部分纖維素酶和半纖維素酶活性的廢發(fā)酵培養(yǎng)基將用于下游生物質(zhì)處理步驟。
[0081]在本發(fā)明中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)大部分纖維素酶和半纖維素酶活性保留在殘留的經(jīng)預(yù)處理的原料生物質(zhì)和產(chǎn)生的真菌生物質(zhì)上。
[0082]甚至更有趣地，可顯示當(dāng)使用整個(gè)含酶發(fā)酵漿料(上清液和菌絲體/生物質(zhì))時(shí)，與僅使用含酶發(fā)酵上清液或商業(yè)酶制劑的水解實(shí)驗(yàn)相比較，生物質(zhì)水解更高效。
[0083]這可任選地通過(guò)將可通過(guò)預(yù)處理獲得的生物質(zhì)漿料分成兩股流(以便一部分經(jīng)歷步驟C)，而另一部分直接經(jīng)歷步驟e))來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究人員已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)可將部分經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)經(jīng)歷微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。應(yīng)理解，微生物從而能夠產(chǎn)生適合用于降解經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的酶。因此本發(fā)明還在優(yōu)選實(shí)施方案內(nèi)提供了用于降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟:
[0084]a)物理-化學(xué)預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以獲得經(jīng)預(yù)處理的漿料；
[0085]b)將步驟a)的經(jīng)預(yù)處理的漿料分成兩部分，部分A和部分B ；
[0086]c)將部分A摻入原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基以產(chǎn)生終生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在終生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一種能夠產(chǎn)生至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶的微生物，從而獲得包含所述至少一種酶的富含微生物的懸浮物；
[0087]d)處理步驟c的微生物和/或富含微生物的懸浮物；
[0088]e)將部分B和步驟d )的產(chǎn)物一起添加至反應(yīng)器以進(jìn)行生物質(zhì)水解來(lái)獲得可溶性糖。
[0089]方法的流程圖示于圖1中。
[0090]在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，部分A是少部分步驟a中獲得的經(jīng)預(yù)處理的漿料，優(yōu)選I至20% (干固體重量)，更優(yōu)選I至5% (干固體重量)以及最優(yōu)選I至5% (干固體重量)。固體是堅(jiān)硬顆粒，即在使用的處理?xiàng)l件下不溶于液相的顆粒。
[0091][微生物(步驟(d)的處理]
[0092]令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在水解步驟e)之前物理地和/或機(jī)械地和/或化學(xué)地處理步驟d)中的發(fā)酵漿料以及將處理的產(chǎn)物經(jīng)歷步驟e)將增強(qiáng)生物質(zhì)水解動(dòng)力學(xué)，并且導(dǎo)致更高的可溶性糖產(chǎn)率(圖2)。更高的可溶性糖的產(chǎn)率可在此理解為，當(dāng)將步驟c)的產(chǎn)物經(jīng)歷步驟d)時(shí)，在實(shí)施例4中描述的條件下進(jìn)行72小時(shí)之后可獲得的產(chǎn)率比當(dāng)省略步驟d)時(shí)更高。現(xiàn)有技術(shù)(Rao等人，1985)沒(méi)有公開(kāi)這樣的處理。其中在木質(zhì)纖維素水解之前機(jī)械地處理商業(yè)纖維素酶(Celluclast,Novozymes,Denkmark)/BGL(Novo 188,Novozymes,Denkmark)制劑的對(duì)照實(shí)驗(yàn)不導(dǎo)致木質(zhì)纖維素水解動(dòng)力學(xué)的增強(qiáng)或更高的可溶性糖產(chǎn)率。
[0093]在一個(gè)實(shí)施方案中，在培養(yǎng)步驟之后，例如通過(guò)離心或本領(lǐng)域公知的其它方法分離通過(guò)培養(yǎng)步驟c)獲得的微生物。在該實(shí)施方案中，將分離的微生物經(jīng)歷步驟d)。然而，在本發(fā)明的備選的和甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，整個(gè)含微生物的懸浮物，即包含微生物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的(C)的培養(yǎng)產(chǎn)物，是在生物質(zhì)水解之前經(jīng)物理地和/或機(jī)械地和/或化學(xué)地處理的。整個(gè)含微生物的懸浮物而非僅僅含微生物的懸浮物的上清液用于生物水解的應(yīng)用允許在下游生物質(zhì)水解操作中更高效的酶配量，如本發(fā)明的研究人員已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)的。處理可以是物理、機(jī)械、化學(xué)處理或它們的組合。[0094]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，在發(fā)酵容器中，使含微生物懸浮物經(jīng)歷增加轉(zhuǎn)子速度的攪拌。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)踐中，抽泵含微生物懸浮物并在含有超大胸廓(ultrathorax)的傳輸管中進(jìn)行剪切。如果微生物是真菌，這兩個(gè)實(shí)施方案的任一個(gè)可以是特別有用的，這樣處理包括真菌菌絲體的處理。
[0095]可如下進(jìn)行機(jī)械處理:其可包括使微生物或微生物懸浮物經(jīng)歷l-500kW/m3，更優(yōu)選l-200kW/m3，更優(yōu)選l-100kW/m3的比容積功輸入(也稱為“功率輸入”)，進(jìn)行優(yōu)選0.1-60分鐘，更優(yōu)選I-30分鐘，更優(yōu)選I-10分鐘的持續(xù)時(shí)間。
[0096]機(jī)械處理可選自利用混合器的處理、利用勻漿器的處理和利用碾磨機(jī)的處理。這樣的機(jī)械處理可對(duì)微生物施加機(jī)械切變應(yīng)力或磨削力，并且可破裂或破壞細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁或真菌菌絲體或其部分。超過(guò)一種這樣的處理可彼此組合。細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁或真菌菌絲體或其部分的破裂或破壞，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法例如顯微鏡法測(cè)試。
[0097]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，含微生物的懸浮物經(jīng)處理，即在發(fā)酵酶生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)通過(guò)增加葉輪轉(zhuǎn)速(impellor speed)進(jìn)行剪切。
[0098]在反應(yīng)容器中，機(jī)械過(guò)程的功效是通過(guò)施用于微生物生物質(zhì)的相對(duì)功率梯度控制的。
[0099]備選地，可通過(guò)將含微生物的發(fā)酵漿料從發(fā)酵容器泵至水解容器來(lái)引起導(dǎo)致水解酶活性增加的剪切應(yīng)力?？稍趥鬏敼苤谐楸煤图羟泻⑸餄{料?？杉思羟形⑸?。在剪切速率方面，使含微生物漿料經(jīng)歷1600-500001/s，更優(yōu)選1600-270001/s和甚至更優(yōu)選1600-100001/s。該處理適合于引起水解酶活性的增加。該處理可進(jìn)行優(yōu)選0.01至100s。
[0100]備選地，可使含微生物漿料經(jīng)歷高壓均質(zhì)或經(jīng)歷超聲處理或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的引起高剪切應(yīng)力的其它設(shè)備例如Ultraturax。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，在發(fā)酵容器中，使含微生物漿料經(jīng)歷增加轉(zhuǎn)子速度的`攪拌。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)踐中，在傳輸管中抽泵含微生物懸浮物。由此可剪切微生物。在剪切速率方面，使含微生物漿料經(jīng)歷1600-500001/s，更優(yōu)選1600-270001/s，更優(yōu)選1600-100001/s，以誘導(dǎo)水解酶活性的增加，進(jìn)行0.01至IOOs的一段時(shí)間。
[0101]讀者將理解，本發(fā)明包括本文中公開(kāi)的值的任何特定組合。例如，本文中公開(kāi)的任何特定的剪切速率或剪切速率的范圍將被理解為與進(jìn)行本文中公開(kāi)的這樣的處理的任何指定時(shí)間(分鐘或秒)的組合的明確公開(kāi)。同樣地，本文中公開(kāi)的任何比容積功輸入或比容積功輸入范圍還將被理解為與本文中公開(kāi)的進(jìn)行這樣的輸入的任何指定的時(shí)間(分鐘或秒)的組合的明確公開(kāi)。本發(fā)明的部分也是那些實(shí)施方案，其中比容積功輸入(kW/m3)與時(shí)間(分鐘)的乘積等于本文中公開(kāi)的其任何乘積。本發(fā)明的部分也是那些實(shí)施方案，其中剪切速率(Ι/s)與時(shí)間(s)的乘積等于本文中公開(kāi)的其任何乘積。
[0102]在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，組合機(jī)械與化學(xué)裂解方法，這增強(qiáng)任一方法的功效。
[0103]在本發(fā)明的特定實(shí)踐中，將微生物或含微生物的懸浮物以0.01-2% w/w d.s.的菌絲體,更優(yōu)選0.01-1 % w/w d.s.的菌絲體,甚至更優(yōu)選0.01-0.5% w/w d.s.的菌絲體濃度與表面活性劑，最優(yōu)選Triton X-100混合。隨后，使微生物/表面活性劑混合物優(yōu)選經(jīng)歷上述剪切過(guò)程，這是例如特別有利的如果微生物是真菌，以便可剪切其菌絲體。(表面活性劑或去垢劑不是特別地限制類別的常用有機(jī)化合物，其通常包含疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，從而具有兩親性特征)。
[0104]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)踐中，將微生物或含微生物懸浮物以1-30% w/v，更優(yōu)選1-20% w/v以及甚至更優(yōu)選1-5% w/v的濃度與有機(jī)溶劑(包括胺、醚或醇例如乙醇)混合。隨后，將微生物/表面活性劑混合物經(jīng)歷上述剪切過(guò)程，這是例如特別有利的如果微生物是真菌，以便可剪切其菌絲體。
[0105]可通過(guò)增加發(fā)酵容器的葉輪速度，通過(guò)將發(fā)酵漿料從起源泵至靶容器以及通過(guò)在指定的反應(yīng)容器中進(jìn)行高壓均質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)輸入漿料中的指定功率?；瘜W(xué)試劑例如鹽、有機(jī)溶劑、酶和表面活性的添加顯著地減小獲得成功菌絲體裂解和細(xì)胞內(nèi)酶組分的釋放的必需功率輸入。[0106]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)化學(xué)裂解實(shí)現(xiàn)機(jī)械處理，所述化學(xué)裂解可通過(guò)添加無(wú)機(jī)鹽(osmolysis)、酶、有機(jī)溶劑和/或表面活性劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，通過(guò)添加0.01-10M，更優(yōu)選0.01-5M，甚至更優(yōu)選0.1-1M無(wú)機(jī)鹽例如NaCl、KC1或其它化學(xué)應(yīng)力試劑例如(NH2)2CCK CH6ClN3來(lái)誘導(dǎo)菌絲體細(xì)胞裂解。
[0107]在本發(fā)明的另一個(gè)特定方面，化學(xué)裂解試劑可包括帶電荷或不帶電荷的表面活性劑(Biotechnol Lett.(1980) 2, pp.43-48),例如 Tween-80 (不帶電荷的)、TritonX-100 (不帶電荷的)、SDS (帶負(fù)電荷的)或CTAB (帶正電荷的)，分別以0.1_3 % w/wd.s.微生物生物質(zhì),更優(yōu)選0.1-1% w/w d.s.菌絲,和甚至更優(yōu)選0.5-1%/w d.s.微生物生物質(zhì)的濃度施用所述表面活性劑。
[0108]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，化學(xué)裂解試劑可包含酶或酶系統(tǒng)，例如殼多糖酶(PlantPathol.(200)49，pp.573-589)，可以分別以 0.01-10 % w/w d.s.微生物生物質(zhì)，更優(yōu)選
0.01-1% w/w d.s.菌絲,甚至更優(yōu)選以0.01-0.1 %/w d.s.菌絲的濃度施用所述酶或酶系統(tǒng)，隨后分別在20-70°C溫育0.l-72h。
[0109]在本發(fā)明的特定實(shí)踐中，組合機(jī)械和化學(xué)裂解方法，據(jù)信這增強(qiáng)任一方法的功效。
[0110]在本發(fā)明的特定實(shí)踐中，將微生物以0.01-5% w/w d.s.微生物生物質(zhì)，更優(yōu)選
0.01-1% w/w d.s.微生物生物質(zhì)的濃度與表面活性劑，最優(yōu)選Triton X-100混合。隨后，使微生物/表面活性劑混合物經(jīng)歷l_500kW/m3，更優(yōu)選l-200kW/m3的比容積功輸入，進(jìn)行
0.1-60分鐘，以進(jìn)行有效處理。
[0111]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)踐中，將微生物生物質(zhì)以5-40% w/v,更優(yōu)選20-40% w/V，甚至更優(yōu)選30-35% w/v的濃度與有機(jī)溶劑(包括胺、醚或醇例如乙醇)混合。隨后，使微生物/有機(jī)溶劑混合物經(jīng)歷l_500kW/m3，更優(yōu)選l-200kW/m3的比容積功輸入，進(jìn)行0.1-60分鐘以進(jìn)行有效處理。
[0112]可通過(guò)增加發(fā)酵容器的葉輪速度，通過(guò)將發(fā)酵漿料從起源泵至靶容器以及通過(guò)在指定的反應(yīng)容器中進(jìn)行高壓均質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)輸入漿料中的指定功率?；瘜W(xué)試劑例如鹽、有機(jī)溶劑、酶和表面活性的添加顯著地減小獲得成功菌絲體裂解和細(xì)胞內(nèi)酶組分的釋放的必需功率輸入。
[0113]已意外地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酶活性從產(chǎn)生酶的生物的釋放可增強(qiáng)所應(yīng)用的酶系統(tǒng)的水解性能，這樣可應(yīng)用更低的纖維素和β-葡糖苷酶配量方案。
[0114]根據(jù)本發(fā)明的數(shù)據(jù)，令人驚訝地顯示在水解之前剪切或另外地物理地或機(jī)械地或化學(xué)地處理菌絲體生物質(zhì)將釋放的葡糖苷酶(BGL)，與不這樣操作但為獲得相同的水解產(chǎn)率而必須外源地提供的β_葡糖苷酶(BGL) —樣多。剪切和BGl活性的外源性添加具有累加效應(yīng)，從而產(chǎn)生更高的糖產(chǎn)率和增強(qiáng)的糖化動(dòng)力學(xué)。
[0115]菌絲體結(jié)合的酶活性的釋放還允許減少纖維素酶配量而不減弱水解動(dòng)力學(xué)或來(lái)自木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的可溶性糖產(chǎn)率?？偟膩?lái)說(shuō)，本文中公開(kāi)的教導(dǎo)顯示將預(yù)處理的原料作為唯一生長(zhǎng)培養(yǎng)基允許產(chǎn)生非常適合分解該特定木質(zhì)纖維素材料的酶系統(tǒng)。因此，本發(fā)明中公開(kāi)的現(xiàn)場(chǎng)酶生產(chǎn)允許木質(zhì)纖維素原料和預(yù)處理選項(xiàng)的選擇的最大靈活性。此外，整個(gè)廢發(fā)酵漿料用于下游生物質(zhì)水解操作的應(yīng)用允許更高效的配量方案，所述方案增加產(chǎn)物產(chǎn)率和酶的成本效益。
[0116]在水解操作中減少酶配量方案還可通過(guò)從產(chǎn)生酶的生物體釋放細(xì)胞內(nèi)酶活性從而增強(qiáng)細(xì)胞外酶系統(tǒng)的性能進(jìn)行。
[0117]如果將真菌用于酶生產(chǎn)，則處理步驟d)的目的是破裂真菌的全部或部分例如真菌菌絲體。
[0118][生物質(zhì)水解(步驟(e)]
[0119]為了實(shí)現(xiàn)經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)至可發(fā)酵的、單體己糖(即葡萄糖)和戊糖(即木糖)的分解，將來(lái)自一體化酶生產(chǎn)的廢發(fā)酵漿料(上清液和菌絲體)與經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)一起添加至反應(yīng)器中以進(jìn)行生物質(zhì)水解。如通常已知的，己糖是具有6個(gè)碳原子的單糖，戊糖是具有5個(gè)碳原子的單糖。
[0120]在非限定性實(shí)例中，可優(yōu)選以分批模式水解具有達(dá)到30%，優(yōu)選15-30% (w/w)的固體內(nèi)容物的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿料。
[0121]對(duì)于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)很明顯的是，水解酶系統(tǒng)的配量、溫育時(shí)間、停留時(shí)間、用于生物質(zhì)水解的任選補(bǔ)料方案和水解效率與應(yīng)用的特定酶系統(tǒng)和原料內(nèi)在關(guān)聯(lián)。
[0122]在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿料的水解將通過(guò)由所述絲狀真菌里氏木霉產(chǎn)生的酶系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0123]在該情況下，將經(jīng)預(yù)處理的原料漿料與含有水解酶系統(tǒng)的廢的和任選地剪切的發(fā)酵漿料混合。在此類條件下用于木質(zhì)纖維素原料的優(yōu)選配量方案在0.l-l%w的酶/w的原料或l-20FPU/g在原料中包含的纖維素的范圍內(nèi)變化(Zu等人，2009)。
[0124]在18_72h的停留時(shí)間上在45_55°C的溫度實(shí)現(xiàn)經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的水解。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，以0.25-0.8%w的酶/d.s的經(jīng)預(yù)處理的原料(補(bǔ)充或未補(bǔ)充另外的葡糖苷酶)的酶配量和在50-53°C的溫度于72小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)經(jīng)預(yù)處理的谷草的分批水解。令人驚訝地，即使利用低酶配量方案，仍然可獲得相對(duì)于所述原料中包含的總糖高出50% w/w的水解產(chǎn)率。這些在低酶配量方案下產(chǎn)生的高糖產(chǎn)率的實(shí)現(xiàn)可歸因于高效酶系統(tǒng)的一體化產(chǎn)生，如上文中已描述的。
[0125]本發(fā)明任選地包括在方法的步驟e)中添加β -葡糖苷酶。
[0126]優(yōu)選，水解反應(yīng)的特征在于步驟e)中獲得的可溶性糖包括單體C5糖和/或C6糖，優(yōu)選葡萄糖和/或木糖。
[0127]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將包含富含糖的上清液和富含固體木質(zhì)素的殘?jiān)纳镔|(zhì)水解物經(jīng)歷固體/液體分離法，所述方法這可通過(guò)例如離心、過(guò)濾或簡(jiǎn)單的重力傾析來(lái)實(shí)現(xiàn)。應(yīng)理解，可溶性糖是當(dāng)進(jìn)行固體/液體分離(如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的)時(shí)可主要見(jiàn)于液相中的所有糖。[0128][生物質(zhì)水解物的發(fā)酵]
[0129]本發(fā)明的任選其它方面是在步驟e)中獲得的生物質(zhì)水解物的發(fā)酵。因此，本發(fā)明還包括上述方法，其進(jìn)一步特征在于進(jìn)一步加工富含糖的相。在特定的實(shí)施方案中，將富含糖的液相進(jìn)一步加工成乙醇。可在本發(fā)明的意義內(nèi)將微生物用于將含戊糖和己糖的生物質(zhì)水解物轉(zhuǎn)化成乙醇。
[0130]優(yōu)選地，在該步驟中，使用可從步驟e)獲得的富含糖的液相，其包含高可發(fā)酵的糖含量，優(yōu)選為約15-50% w/v。在本說(shuō)明書中糖含量是所有戊糖和己糖的含量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該生物質(zhì)水解物具有16-25% w/v的糖含量。在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，生物質(zhì)水解物還包含從一體化酶生產(chǎn)方法留傳的另外的營(yíng)養(yǎng)物(即蛋白質(zhì)、鹽和糖)。
[0131]可利用顯示過(guò)程穩(wěn)固性(process robustness)、高抑制劑/乙醇耐受性、在高和低糖濃度下的可靠的產(chǎn)物產(chǎn)率的微生物菌株實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)水解物至乙醇的發(fā)酵?？蓪⑻寝D(zhuǎn)化成乙醇的此類微生物的非限定性實(shí)例包括面包酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)、樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)、漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單抱菌(Zymomonas mobilis)、大腸桿菌(E.coli)、產(chǎn)酸克雷伯式菌(Klebsiella oxytoca)和尖鍵抱(Fusarium oxysporum)。
[0132]用于方法選擇和生物體的選擇的選擇標(biāo)準(zhǔn)是過(guò)程穩(wěn)固性、產(chǎn)物/抑制劑/溫度耐受性以及恒定的高乙醇產(chǎn)率(Fischer等人,2008 ;Matsushika等人,2009)。
[0133]可在28-70°C的溫度進(jìn)行乙醇發(fā)酵，取決于所用微生物的最適溫度和發(fā)酵效率，進(jìn)行 10-48 小時(shí)(Matsushika 等人，2009)。
[0134]現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)顯 示己糖至乙醇的理論轉(zhuǎn)化極限對(duì)于酵母可以為51% w/w(即Ig葡萄糖對(duì)0.51g乙醇)(Matsushika等人,2009)。
[0135]在本文中描述的公開(kāi)內(nèi)容中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)所述預(yù)處理不影響生物質(zhì)水解或發(fā)酵操作的性能。
[0136]利用酵母菌株的己糖發(fā)酵可在28_35°C的溫度、pH4_6進(jìn)行，并可在10_48h內(nèi)完成。作為發(fā)酵的結(jié)果，獲得包含酵母生物質(zhì)和約0.5-25% w/v的乙醇(這取決于生物質(zhì)水解物的初始糖濃度以及戊糖和己糖的轉(zhuǎn)化效率)的漿料。
[0137][乙醇回收]
[0138]可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)從發(fā)酵液體回收乙醇。一個(gè)這樣的方法是依賴于釀造和化學(xué)工業(yè)中使用的設(shè)備例如蒸懼柱(distillation column)的常規(guī)蒸餾和提純法。這些技術(shù)在工業(yè)中已良好建立，且可備選裝置本身是已知的(Leland，2008，Cardona和Sanchez, 2007)。在本發(fā)明的可選擇實(shí)施方案中，通過(guò)汽提技術(shù)(strippingtechnology)回收乙醇,這樣的技術(shù)的非限定性實(shí)例是真空汽提、氣提、噴淋蒸發(fā)(sprayevaporation)。
[0139]本發(fā)明的實(shí)踐可導(dǎo)致90-100% v/v的乙醇產(chǎn)物?？蓪⒃摦a(chǎn)物任選地與添加劑混合或可選擇地加工以配制可運(yùn)送至最終消費(fèi)者的產(chǎn)品。
[0140]術(shù)語(yǔ)的定義:
[0141]在本發(fā)明中，使用許多術(shù)語(yǔ)，在下文中定義所述術(shù)語(yǔ)。[0142]術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”和“木質(zhì)纖維素生物質(zhì)”是指任何纖維素或木質(zhì)纖維素材料，包括包含纖維素和任選地還包含半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、多糖、寡糖和/或單糖的材料。生物質(zhì)還可包含另外的組分，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、蠟、酚和類固醇。生物質(zhì)通?？蓙?lái)源于單個(gè)來(lái)源，或包括來(lái)源于超過(guò)一個(gè)來(lái)源的混合物；例如，生物質(zhì)可包含小麥spelts與小麥秸桿的混合物、或草與葉的混合物。生物質(zhì)的非限定性實(shí)例是生物能農(nóng)作物、農(nóng)業(yè)廢物、大都市固體廢物(municipal solid waste)、工業(yè)固體廢棄物(industrial solid waste)、造紙污泥(sludge from paper manufacture)、庭院廢棄物(yard waste)、木材和林業(yè)廢物。純生物質(zhì)的具體地非限定性實(shí)例包括燕麥spelts、玉米穗軸(corn cobs)、農(nóng)作物殘洛例如玉蜀黍的包皮(corn husks)、玉米稻桿(corn stover)、草、小麥、小麥稻桿、大麥、大麥稻桿、干草、稻草、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、大豆、獲自谷物的碾磨的組分、樹(shù)、枝條、根、葉、木屑、鋸屑、灌木和矮樹(shù)叢、蔬菜、水果、花和動(dòng)物畜糞。
[0143]術(shù)語(yǔ)“機(jī)械退漿”是指用于減少生物質(zhì)的顆粒尺寸的任何機(jī)械方法。退漿應(yīng)用的非限定性實(shí)例是錘子碾磨或破碎。
[0144]術(shù)語(yǔ)“經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)”意指在糖化之前已經(jīng)歷物化處理的生物質(zhì)。在本文中進(jìn)一步描述處理例如預(yù)處理。
[0145]術(shù)語(yǔ)“木質(zhì)纖維素(的)”是指包含木質(zhì)素和纖維素的組合物。木質(zhì)纖維素材料還可包含半纖維素。
[0146]術(shù)語(yǔ)“纖維素(的)”是指包含纖維素的組合物。
[0147]術(shù)語(yǔ)“糖化”或“生物質(zhì)水解”是指從多糖產(chǎn)生可發(fā)酵糖。
[0148]術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵糖”是指可被微生物在發(fā)酵過(guò)程中用作碳源來(lái)產(chǎn)生產(chǎn)物例如乙醇的寡糖和單糖。
[0149]術(shù)語(yǔ)“水解物”是指 糖化的產(chǎn)物，其包含在糖化過(guò)程中產(chǎn)生的糖，剩余的未水解的生物質(zhì)以及用于生物質(zhì)水解的酶。
[0150]術(shù)語(yǔ)“漿料”是指不溶性材料和液體的混合物。
[0151]術(shù)語(yǔ)“可混合的漿料”是指在其經(jīng)歷的攪拌系統(tǒng)的作用下變成大體上均勻的漿料?！盎旌铣潭取笔侵笣{料的該性質(zhì)。
[0152]術(shù)語(yǔ)“充分混合的漿料”是指其中漿料的組分大體上均等地分布在(勻勻的)整個(gè)漿料中的狀態(tài)。
[0153]生物質(zhì)的“干重”或“d.w.”意指除去了全部水或基本上除去了全部水的生物質(zhì)的重量。通常根據(jù)美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials)(ASTM)標(biāo)準(zhǔn)E1756-01(用于測(cè)定生物質(zhì)中的總固體的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試法)或紙漿和造紙工業(yè)技術(shù)協(xié)會(huì)(Technical Association of the Pulp and Paper Industry), Inc.(TAPPI)標(biāo)準(zhǔn)T-412om-02 (紙漿、紙和紙板中的水份)測(cè)量干重。
[0154]術(shù)語(yǔ)“干重”(d.w.)或“干物質(zhì)”(d.s.)是指添加至每一批次或批次補(bǔ)料系統(tǒng)反應(yīng)器的生物質(zhì)干重的總量，在添加的時(shí)刻計(jì)算，作為運(yùn)行結(jié)束時(shí)反應(yīng)器中反應(yīng)組合物的總
重量的百分比。
[0155]術(shù)語(yǔ)“糖化酶“或“水解酶”可以指包含一種或多種用于水解聚合生物質(zhì)，從而將寡糖和/或單糖釋放至水解物中的酶(其中超過(guò)一種酶是優(yōu)選的)的糖化酶系統(tǒng)。糖化酶系統(tǒng)包含一種或多種選自“糖苷酶”類的酶，其水解二糖、寡糖和多糖的醚鍵，并且見(jiàn)于“水解酶”大類(EC3.)的酶分類EC3.2.1.x。此外，可存在可以屬于或可以不屬于該類的其它酶。可根據(jù)它們水解的生物質(zhì)組分分類用于本方法的糖苷酶。用于本方法的糖苷酶包括水解纖維素的糖苷酶(例如，纖維素酶、內(nèi)纖維素酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β -葡萄糖苷酶)、水解半纖維素的糖苷酶，稱為半纖維素酶(例如，木聚糖酶、木聚糖內(nèi)切酶、木聚糖外切酶、β -木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶(arabinoxylanases)、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖醛酸糖苷酶和水解淀粉的糖苷酶(例如，淀粉酶、α -淀粉酶類、β -淀粉酶類、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶)。此外，可有用地將其它添加劑添加至糖化酶系統(tǒng)例如肽酶(EC3.4.X.y)、脂酶(EC3.1.1.x和3.1.4.x)、木質(zhì)素酶(EC1.11.1.x)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)以幫助從生物質(zhì)的其它組分釋放多糖。在本領(lǐng)域眾所周知的是產(chǎn)生水解多糖的酶的微生物通常顯示活性例如纖維素降解，所述活性由具有不同底物特異性的幾種酶或一組酶催化的。因此，來(lái)自微生物的“纖維素酶”可包含一組酶，其全部或一些可促成纖維素降解活性。商業(yè)或非商業(yè)酶制劑例如纖維素酶可包含許多酶，這取決于用于獲得酶的純化方案。因此，本方法中使用的糖化酶包括至少一種“纖維素酶”，該活性可通過(guò)超過(guò)一種酶來(lái)催化。任選地，本方法中使用的糖化酶可包括至少一種半纖維素酶，這通常取決于本方法中使用的預(yù)處理的生物質(zhì)的類型。例如，當(dāng)糖化利用酸預(yù)處理的生物質(zhì)時(shí)通常不需要半纖維素酶，當(dāng)糖化在中性或堿性條件下預(yù)處理的生物質(zhì)時(shí)通常包括半纖維素酶。糖化酶可商購(gòu)獲得，例如Spezyme? CP 纖維素酶(Genencor International, Rochester, N.Y.)和Mul t if ect?木聚糖酶(Genencor)。此外,可生物地(包括使用重組微生物地)產(chǎn)生糖化酶。可開(kāi)發(fā)可用于本發(fā)明的新型糖化酶。
[0156]SSF代表同時(shí)糖和發(fā)酵。
實(shí)施例
[0157]使用下列術(shù)語(yǔ):[0158]“HPLC”是高效液相色譜，“C”是攝氏度，“kPa”千帕斯卡，“m”是米，“mm”是毫米，“kW”是千瓦，“ μ m”是微米，“ μ L”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分鐘，“mM”是毫摩爾，“cm”是厘米，“g”是克，“kg”是千克，“wt”是重量，“hr”是小時(shí)，“temp”或“T”是溫度，“theoret”是理論的，“pretreat”是預(yù)處理，“DWB”是生物質(zhì)的干重，“ASME”是美國(guó)機(jī)械工程師學(xué)會(huì)，“s.s.”是不銹鋼，“in”是英尺，“PSD”是顆粒大小分布，“d-50”是其中顆粒累加體積達(dá)50%的顆粒低于該尺寸的顆粒直徑，“d-95”是指其中顆粒累加體積達(dá)95%的顆粒低于該尺寸的顆粒直徑，“rpm”是每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)。
[0159]硫酸、氫氧化銨、醋酸、乙酰胺、酵母提取物、葡萄糖、木糖、山梨醇、MgSO4.7H20、磷酸和朽1 樣酸獲自 Sigma-Aldrich (St.Louis, M0.)。
[0160]生物質(zhì)的組成通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法的任一種(例如ASTM E1758-01 “用于通過(guò)HPLC測(cè)定碳水化合的標(biāo)準(zhǔn)方法”)來(lái)測(cè)量。
[0161]實(shí)施例1:單體糖的測(cè)量
[0162]為了測(cè)定秸桿水解的進(jìn)展，以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔采集樣品，利用HPLC測(cè)定可溶性糖含量。
[0163]利用HPLC(AgilentTechnologies,Palo Alto,Calif.)測(cè)量糖化液中的可溶性糖(例如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木二糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖)。[0164]直接測(cè)量水解物中的單糖。通過(guò)離心從水解物除去不溶性物質(zhì)。調(diào)整分離的液體的pH，必要時(shí)利用硫酸。必要時(shí)，稀釋分離的液體，隨后通過(guò)0.2 μ m注射器式濾器直接過(guò)濾至HPLC小瓶中。
[0165]為了分析總的溶解的糖，將IOml稀釋樣品置于壓力小瓶(pressure vial)中，加入349 μ 175%的H2S04。將小瓶蓋上蓋，置于高壓釜中進(jìn)行I小時(shí)以將所有糖水解成單糖。冷卻樣品，利用碳酸鈉將它們的PH調(diào)整至必需pH，隨后將樣品過(guò)濾至HPLC小瓶中，利用HPLC進(jìn)行分析。在運(yùn)行后，根據(jù)每一種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中的濃度。
[0166]實(shí)施例2:小麥秸桿的物理-化學(xué)預(yù)處理
[0167]將小麥秸桿磨碎成小于2cm的顆粒尺寸。隨后，將磨碎的秸桿與水混合，添加H2SO4作為預(yù)處理催化劑，隨后在高壓下進(jìn)行水熱處理。
[0168]隨后將所得的經(jīng)預(yù)處理的原料的懸浮物用于產(chǎn)生水解酶和用于下游操作中的糖化過(guò)程。
[0169]實(shí)施例3:使用經(jīng)預(yù)處 理的原料產(chǎn)生水解酶
[0170]在絲狀真菌里氏木霉的液體深層培養(yǎng)中產(chǎn)生用于將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化成組分糖的水解酶(即纖維素酶和半纖維素酶)。
[0171]在初始培養(yǎng)步驟中，將種子培養(yǎng)物生長(zhǎng)在2升只裝有400ml補(bǔ)充有2% w/v的經(jīng)預(yù)處理生物質(zhì)(參見(jiàn)實(shí)施例2)和0.5% v/v的玉米漿的培養(yǎng)液的搖瓶中。利用在600nm具有為10的光密度(OD)的真菌孢子的制劑接種培養(yǎng)基。將搖瓶培養(yǎng)物在250rpm的恒定攪拌下在30°C和pH5生長(zhǎng)48小時(shí)。
[0172]在具有5升的工作容積的生物反應(yīng)器中進(jìn)行種子培養(yǎng)物的增大。培養(yǎng)基組成與初始種子培養(yǎng)物設(shè)置相同。利用10% v/v的初始種子培養(yǎng)物接種每一種生物反應(yīng)器。在350rpm的恒定攪拌的條件下，將培養(yǎng)物在30°C (pH5)生長(zhǎng)48小時(shí)。
[0173]在具有100升的工作容積的150升生物反應(yīng)器中進(jìn)行主要酶生產(chǎn)。培養(yǎng)基與先前的種子培養(yǎng)相同。然而，為了生產(chǎn)水解酶，添加8% w/v的經(jīng)預(yù)處理生物質(zhì)和2% v/v的玉米衆(zhòng)。利用5% v/v的第二種子培養(yǎng)物接種培養(yǎng)液。隨后在350rpm的恒定攪拌下于30°C生長(zhǎng)產(chǎn)生酶的真菌里氏木霉。推薦在25%的恒定p02下生長(zhǎng)5天，以確保在好氣條件下進(jìn)行最佳酶生產(chǎn)。在5天的培養(yǎng)條件后，收獲包含預(yù)處理的生物質(zhì)的殘?jiān)?、廢發(fā)酵培養(yǎng)液(培養(yǎng)基)和真菌菌絲體的整個(gè)含酶發(fā)酵漿料。
[0174]利用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford法測(cè)定發(fā)酵液(上清液)中的總的可溶性酶(蛋白質(zhì))的濃度(Bradford, Μ.，1976)。
[0175]在下游水解實(shí)驗(yàn)中，利用含酶上清液或整個(gè)發(fā)酵漿料(上清液+經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)+真菌菌絲體)。
[0176]實(shí)施例4:秸桿水解
[0177]利用纖維素酶系統(tǒng)水解經(jīng)預(yù)處理的小麥秸桿，所述纖維素酶系統(tǒng)包含(i)實(shí)施例3中描述的上清液、(ii)全部真菌懸浮物(真菌菌絲體+生物質(zhì)+上清液)或(iii)其中已在真菌秸桿水解之前真菌菌絲體被剪切的全部真菌懸浮物。任選地還在外源添加的葡糖苷酶(BGL)存在的情況下進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。
[0178]在被調(diào)整至ρΗ5的培養(yǎng)基中，在50°C于I升具有20% w/w d.s.的經(jīng)預(yù)處理的秸桿的反應(yīng)體積中進(jìn)行水解反應(yīng)72小時(shí)。水解酶配量方案是0.5% w的纖維素酶/w經(jīng)預(yù)處理的秸桿。酶的配量參考實(shí)施例2中測(cè)定的廢發(fā)酵液中的總蛋白質(zhì)濃度。任選地，利用額外的BGL活性(Novo 188,Novozymes,Denkmark)進(jìn)行反應(yīng)。以2個(gè)纖維二糖單位(CBU)/mg纖維素酶進(jìn)行BGL活性配量。如由Prior等人(2008)所述，測(cè)定CBU。
[0179]在恒定攪拌(50rpm)下于生物反應(yīng)器系統(tǒng)中進(jìn)行糖化反應(yīng)，以確保等同的反應(yīng)條件。在特定的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在下游木質(zhì)纖維素水解過(guò)程之前，將葉輪(L5M, SilversonMachines Ltd.)速度增加至8000rpm進(jìn)行30分鐘來(lái)剪切含水解酶的發(fā)酵漿料。為了測(cè)定水解動(dòng)力學(xué)和葡萄糖產(chǎn)率，在第3、7、24和48h采集樣品。通過(guò)上述HPLC法測(cè)量表觀葡萄糖釋放。不同水解設(shè)置的結(jié)果示于圖2中。
[0180]圖2中的數(shù)據(jù)顯示如果將含酶的木霉屬真菌懸浮物(參見(jiàn)實(shí)施例3)用于在BGL補(bǔ)充不存在的情況下水解經(jīng)預(yù)處理的秸桿，在水解之前剪切真菌生物質(zhì)增強(qiáng)水解動(dòng)力學(xué)和終末葡萄糖產(chǎn)率。
[0181]僅利用BGL補(bǔ)充的發(fā)酵液(上清液)進(jìn)行經(jīng)預(yù)處理的秸桿的水解實(shí)驗(yàn)，顯示與在BGL不存在的情況下利用整個(gè)剪切的發(fā)酵漿料進(jìn)行的反應(yīng)相似的水解動(dòng)力學(xué)和終葡萄糖產(chǎn)率。
[0182]利用額外地補(bǔ)充有BGL的剪切的整個(gè)發(fā)酵漿料(即真菌菌絲體、生物質(zhì)和上清液)的水解反應(yīng)，顯示相較于所有其它檢查的水解方法最有利的水解動(dòng)力學(xué)和糖產(chǎn)率。該令人驚訝的作用可歸因于細(xì)胞內(nèi)和/或表面結(jié)合至微生物的酶活性釋放，該作用與發(fā)酵液中的可溶性纖維素酶系統(tǒng)協(xié)同作用。
[0183]附圖概述:
[0184]圖1:包括來(lái)自現(xiàn)場(chǎng)酶生產(chǎn)留傳的菌絲體的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙醇的方法。L =木質(zhì)素，P =戊糖，H =己糖。圖1是通常`舉例說(shuō)明用于通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵途徑將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇的生物精煉法(biorefining process)方框圖。
[0185]圖.2:葡萄糖從預(yù)處理的秸桿釋放。水解條件:20% w/w d.s.的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，纖維素酶配量:0.5% w可溶性酶/w的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，任選的BGL配量:2CBU/mg纖維素酶，在第3、7、24、48、72h小時(shí)取樣。在額外的BGL活性不存在和存在的情況下，利用含酶發(fā)酵液體培養(yǎng)基或剪切的/未剪切的整個(gè)發(fā)酵漿料(液體培養(yǎng)基上清液+生物質(zhì)+真菌菌絲體)進(jìn)行生物質(zhì)水解。
_] 文獻(xiàn):
[0187]Chauve et al.(2010)Biotechnology for Biofuels2010,3:3
[0188]Bradford, M.(1976)，Anal.Biochem.72:248-254
[0189]Prior B.A.，Day D.F.(2008) Appl.Biochem.Biotechnol.146 (1-3)，pp.151-64
[0190]Pe jo, E.T., Oliva, J.M.and Ballestros, M.(2008) Realistic approach forfull-scale bioethanol production from lignocellulose:a review J.Sci&Indust.Research67, pp.874-884
[0191]Howard, R.L., Abotsi, E., van Rensburg, J.Howard, S.(2003)Lignocellulosebiotechnology:1ssues of bioconversion and enzyme production.Afr1.J.Biotechnol.2, pp.602-619
[0192]Sluiter, B.Hames, R.Ruiz, C.Scarlata, J.Sluiter, D.Templeton, andD.Crocker (2008)Determination of StructuralCarbohydrates and Lignin in Biomass.Laboratory Analytical Procedure(LAP)Technical Report NREL/TP-510-42618,http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf
[0193]Kumar R，Mago G，Balan V，Wyman CE.(2009a) Physical and chemicalcharacterizations of corn stover and poplar solids resulting from leadingpretreatment technologies.Bioresour.Technol.100(17)，pp.3948-62.[0194]Kumar R，Wyman CE.(2009b)Effects of cellulase and xylanase enzymeson the deconstruction of sol ids from pretreatment of poplar by leadingtechnologies.Biotechnol Prog.2009，25(2)，pp.302-14.[0195]Kumar R， Wyman CE.(2009c)Effect of additives on the digestibility ofcorn stover solids following pretreatment by leading technologies.BiotechnolBioeng.2009，Aprl5 ；102(6):1544-57.[0196]Wyman CE，Dale BE，Elander RT, Holtzapple M，Ladisch MR，Lee YY.(2005)Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leadingpretreatment technologies to corn stover.Bioresour.Technol.96(18), pp.2026-32.[0197]Chandra, R.R.，Bura, R.，Mabee，W.E.，Berlin, A.，Pan，X:，Saddler,J.N.(2007)Substrate Pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis oflignocellulosics ? Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.108，pp.67-93.[0198]Margeot，A., Han-Hagerdahl, B.，Edlund，M.，Slade，R.，Monot，F(xiàn).(2009) Newimprovements for lignocellulosic ethanol.Curr.0pin.Biotechnol.20，pp.1-9.[0199]Chandrakant, P.，Bisaria，V.S.(1998)Simultaneous bioconversion ofcellulose and hemicellulose to ethnaol.Crit.Rev.Biotechnol.18, pp.295-331
[0200]Xiao, Z.，Zhang, X.，Gregg, D.J.，Saddler, J.N.(2004a)Effects of sugarinhibition on cellulose and beta-glucosidase during enzymatic hydrolysis ofsoftwood substrates.App1.Biochem.Biotechnol.113—116，pp.1115—1125
[0201]Hodge , D.B.，K arim, M.N.，Schell，D.J.，McMillan，J.D.(2009)Model-based fed—batch for high—solids enzymatic cellulose hydrolysis.ApplBiochemBiotechnol.152，pp.88-107
[0202]Reith，J.H.，den Uii，H.，van Veen, H.，de Laat, W.T.A.M.，Niessen，J.J.，de Jong, E.，Elbersen，H.W.，Weusthuis, R.，van Dijken，J.P.，Raamsdonk，L (2002)Co-prodcution of bioethanol, electrcity，and heat from biomass residues.1n:Twelfth European Conference and Technology Exhibition on Biomass for Energy,Industry and Climate Protection，Amsterdam，The Netherlands.[0203]Palmquist，E.，Hahn-Hagerdahl (2000a)Fermentation of lignocellulosichydrolysates.1-1nhibition and detoxification Bioresource Technology74，ppl7_24
[0204]Palmquist，E.，Hahn-Hagerdahl (2000b)Fermentation of lignocellulosichydrolysates.11: inhibitors and mechanisms of inhibition.BioresourceTechnol.74，pp.25-33
[0205]Jing，X.，Zhang, X.and Bao, J.(2009) Inhibition Performance ofLignocellulose Degradation Products on Industrial Cellulase Enzymes DuringCellulose Hydrolysis Applied Biochemistry and Biotechnologyl59,pp.696-707
[0206]Xiao, Z.，Storms, R.and Tsang，A.(2004b)Microplate-based filter paperassay to measure total cellulase activity.Biotechnology and Bioengineering88:832-837
[0207]Bobey, D.，Ederer, G.M.(1981) Rapid detection of yeast enzymes byusing4-methylumbelliferyl substrates J.Clin.Microbiol., pp.2, 393-394
[0208]Maki, M.，Leung, K.T.，Qin，W.(2009)The prospects of cellulose producingbacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass.1nt.J.Biol.Sc1.5，pp.500-516
[0209]Lynd, L R.，Weimer, P.J.，van Zyl，W.H.，pretorius, 1.S.(2002)Microbialcellulose utilisation !Fundamentals and biotechnology.Microbiol, and Molecular.Biology Rev.66.pp.506—577
[0210]Shewale JG.Beta-Glucosidase:its role in cellulase synthesis andhydrolysis of cellulose.(1982)Int J Biochem.14，pp.435-43
[0211]Seidle，H.F.，Marten, 1.，Shoseyov, 0.，Huber, R.E.(2004)，Physical andkinetic properties of the family3beta-glucosidase from Aspergillus niger whichis important for cellulose breakdown.The Protein J.23, pp.11-23
[0212]Szi jarto，N.，Szengyel，z.，Liden，G.，Reczey，K.(2004) Dynamics of cellulaseprodcution by glucose grown cultures of trichoderma reesei RUT_C30as a responseto addition of cellulose Appl.Biochem.Biophys.115,pp.115-124
[0213]Kristensen, J.B.，F(xiàn)elby, C.，Jorgensen, H.(2009) Yield-determining factorsin high—solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose Biotech, for Biofuels2，pp.1-22
[0214]Fischer, C.R.，Klein-Marcuschamer, D.，Stephanopoulos，G.(2008)Selectionand optimization of microbial hosts for biofuels production.Metab.Eng.10 (6),pp.295—304.[0215]Shaw A.J.，Podkaminer K.K.，Desai S.G.，Bardsley J.S.，Rogers S.R.，Thorne P.G.,Hogsett D.A., Lynd LR.(200B) Metabolic engineering of athermophilicbacterium to produce ethanol at high yield.Proc.Natl.Acad.Sc1.105 (37),pp.13769-74
[0216]CampelI, J.A., Hansen, R.W., Wilson, J.R.(1999) Cost effective colorimetricmicrotitre plate enzymic assays for sucrose, glucose and fruetose in sugarcanetissue extracts.J.Sc1.Food.Agicult.79，pp.232-236
[0217]Matsushika A，Inoue H，Murakami K,Takimura 0，Sawayama S.(2009)Bioethanolproduction performance of five recombinant strains of laboratory and industrialxylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae.Bioresour Technol.2009Apr ； 100 (8):2392-8.[0218]Nigam JN.(2001)Ethanol production from hardwood spent sulfite liquorusing an adapted strain of Pichia stipitis.J Ind Microbiol Biotechnol.26 (3)，pp.145-50.[0219]Laplace JM, Delgenes JP, Moletta R， Navarro JM.(1992)Alcoholic glucoseand xylose fermentations by the coculture process !compatibility and typing ofassociated strains.Can J Microbiol.38(7)，pp.654-8
[0220]Tolan, J.S.(2002):1gens process for producing ethanol from cellulosicbiomass.Clean Technol.Environ.Policy.3，pp.339-345
[0221]Cardona，C.A.，Sanchez，0.J.(2007)Fuel ethanol production:Process designtrends and integration opportunities Bioresource Technol.98，pp.2415—2457
[0222]Jorgensen, H.，Vibe-Pedersen，J.，Larsen, J.，F(xiàn)elby C.(2006) Liquefactionof lignocellulose at high — solids concentrations.Biotechnology andBioengineering96, pp.862-870
[0223]Chadha B.S., Kanwar S.S.，Saini H.S.，Garcha H.S.(1995) Hybrid process forethanol production from rice straw.ActaMicrobiol Immunol Hung.42(I):53-9.[0224]Hennessey, S.M.Seapan，M.，Elander, R.T.，Tucker, M.P.(2006)Process forconcentrated biomass saccharification W02009/045651A2
[0225]Leland，Μ.V.(2008)Separation technologies for recovery and dehydrationof alcohols from fermentation broth.Biofuel, Biorpod.Bioref.2, pp.553-588
[0226]Rao, M.，Desphpande, V.，Seeta，R.，Srinivasan, M.C.，Mishra, C.(1985)Hydrolysis of sugarcane Bagasse by mycelium biomass from penicilliumfuniculosum.Biotechno l.Bioengineer27,00.1070-72
【權(quán)利要求】
1.一種用于降解預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟: c)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶的微生物，從而獲得包含所述至少一種酶的富含微生物的懸浮物； d)通過(guò)如下方法處理步驟C的微生物和/或富含微生物的懸浮物 (i)機(jī)械處理，包括經(jīng)歷l_500kW/m3，更優(yōu)選l_200kW/m3，和甚至更優(yōu)選l-100kW/m3的比容積功輸入，進(jìn)行優(yōu)選0.1-60分鐘，更優(yōu)選I-30分鐘，和甚至更優(yōu)選I-10分鐘的持續(xù)時(shí)間 和/或 (?)機(jī)械處理，其選自利用混合器的處理、利用勻漿器的處理和利用碾磨機(jī)的處理； 和/或 (iii)機(jī)械處理，其包括將含微生物的發(fā)酵漿料從發(fā)酵容器泵至水解容器； e)使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)與步驟d)的產(chǎn)物一起添加至反應(yīng)器以進(jìn)行生物質(zhì)水解來(lái)獲得可溶性糖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)獲自通過(guò)物理-化學(xué)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。
3.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)優(yōu)選是經(jīng)預(yù)處理的。
4.一種用于降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，其包括步驟: a)物理-化學(xué)預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以獲得經(jīng)預(yù)處理的漿料； b)將步驟a)的經(jīng)預(yù)處理的漿料分成兩部分，部分A和部分B； c)將部分A摻入原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基以產(chǎn)生終生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且在終生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一種能夠產(chǎn)生至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶的微生物，從而獲得包含所述至少一種酶的富含微生物的懸浮物； d)處理步驟c的微生物和/或富含微生物的懸浮物； e)將部分B和步驟d)的產(chǎn)物一起添加至反應(yīng)器以進(jìn)行生物質(zhì)水解來(lái)獲得可溶性糖。
5.權(quán)利要求4的方法，其中步驟d)包括機(jī)械處理。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中步驟d)包括機(jī)械處理，包括經(jīng)歷l_500kW/m3，更優(yōu)選l-200kff/m3,和甚至更優(yōu)選l-100kW/m3的比容積功輸入，進(jìn)行優(yōu)選0.1-60分鐘，更優(yōu)選I-30分鐘，和甚至更優(yōu)選I-10分鐘的持續(xù)時(shí)間。
7.權(quán)利要求4至6的方法，其中步驟d)包括機(jī)械處理，其選自利用混合器的處理、利用勻漿器的處理和利用碾磨機(jī)的處理，其中所述機(jī)械處理可對(duì)微生物施加機(jī)械剪切應(yīng)力或磨削力，并且可破裂或破壞細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求4至7的任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)包括機(jī)械處理，該機(jī)械處理包括將含微生物的發(fā)酵漿料從發(fā)酵容器泵至水解容器。
9.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，當(dāng)步驟d)包括抽泵時(shí)，含微生物漿料所承受的剪切速率在1600-500001/s，更優(yōu)選1600-270001/s，和甚至更優(yōu)選1600-100001/s的范圍內(nèi)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中將所述處理進(jìn)行0.01至IOOs的一段時(shí)間。
11.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中處理包括利用超聲波的處理。
12.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)包括化學(xué)處理，所述化學(xué)處理是利用一種或多種化學(xué)試劑的處理，所述化學(xué)試劑優(yōu)選選自下組:鹽、有機(jī)溶劑、表面活性劑和酶。
13.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)包括根據(jù)權(quán)利要求5至10的機(jī)械處理和利用根據(jù)權(quán)利要求12的一種或多種化學(xué)試劑的處理。
14.權(quán)利要求4至13的任一項(xiàng)的方法，其中部分A是步驟a中獲得的經(jīng)預(yù)處理的漿料的少數(shù)部分，優(yōu)選I至20% (干固體重量)，更優(yōu)選I至5% (干固體重量)和最優(yōu)選I至5% (干固體重量)。
15.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是真菌，其優(yōu)選選自:木霉屬種(Trichoderma sp.)、曲霉菌屬種(Aspergillus sp.)、青霉屬種(Penicillium sp.)和Talaromyces sp.,且更優(yōu)選選自:木霉屬種、Talaromyces sp.。
16.權(quán)利要求15的方法,其中所述微生物是木霉屬種，更優(yōu)選里氏木霉(Trichodermareesei)。
17.前述權(quán)利要求的任 一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種具有分解纖維素和/或分解半纖維素活性的酶具有一個(gè)或多個(gè)選自下組的活性:1型或II型纖維二糖水解酶(CBH I或CBH II)、1、I1、III或IV型內(nèi)纖維素酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、酯酶、外切半纖維素酶和內(nèi)切半纖維素酶。
18.權(quán)利要求17的方法，其中外切半纖維素酶和內(nèi)切半纖維素酶優(yōu)選選自木聚糖酶、木糖苷酶、β -木糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯巖藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶。
19.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟e)中添加葡糖苷酶。
20.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)中獲得的所述可溶性糖包括單體C5糖和/或C6糖，優(yōu)選葡萄糖和/或木糖。
21.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中將步驟e)的所述可溶性糖進(jìn)一步加工成乙醇。
【文檔編號(hào)】C12P19/02GK103459603SQ201280008506
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月31日
【發(fā)明者】M·拉巴赫, Z·德拉戈維克, A·科勒, J·格拉克, J·巴土奇, T·布魯克 申請(qǐng)人:科萊恩產(chǎn)品（德國(guó)）有限公司