專利名稱：一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲組織的分離技術(shù)，具體涉及一種大量快速地分離昆蟲圍食膜的新方法。
背景技術(shù)：
圍食膜(Peritrophic membrane,PM)是昆蟲中腸細(xì)胞分泌的一層厚薄均勻的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)薄膜，由中腸前端一直延伸至后腸。圍食膜主要由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成。具有保護(hù)中腸上皮細(xì)胞，阻止病原物入侵等多種功能，是昆蟲抵御隨食物攝入的病原微生物入侵的第一道天然保護(hù)性屏障，凡是能破壞蛋白與幾丁質(zhì)高度結(jié)合的位點(diǎn)都可能成為害蟲防治的靶標(biāo)位點(diǎn)。所以，近年來(lái)對(duì)圍食膜幾丁質(zhì)與蛋白質(zhì)的組裝機(jī)制、病原微生物與圍食膜相互作用的分子機(jī)理、避免昆蟲對(duì)病原微生物產(chǎn)生抗性等方面的研究已成為學(xué)者們普遍關(guān)注的新執(zhí)占。蛋白質(zhì)是昆蟲圍食膜的主要成分，約占圍食膜的35%_55%。其中糖蛋白能增加圍食膜的致密性、堅(jiān)韌性及半滲透性，蛋白多糖形成圍食膜其余部分，它的多聚糖側(cè)鏈形成高度伸展的纏繞結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)對(duì)于維持圍食膜的致密結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，一般研究昆蟲圍食膜都是因?yàn)榉蛛x圍食膜很困難，而且獲得的量很少，無(wú)法滿足圍食膜蛋白所需的量，而且方法很費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通常是將圍食膜分離出來(lái)后，用充滿濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水注射器反復(fù)清洗掉里面的食物，獲得一條昆蟲圍食膜需約10分鐘時(shí)間。因此，研究昆蟲圍食膜蛋白對(duì)于以圍食膜為靶標(biāo)的昆蟲 生物防治具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。目前，關(guān)于圍食膜中蛋白研究比較少，大部分蛋白結(jié)構(gòu)和功能還不清楚。目前研究圍食膜蛋白種類的基本方法都是采用單向SDS-PAGE或雙向電泳技術(shù)獲得的。在這些研究中，關(guān)鍵的問題就是要獲得和快速分離大批量的圍食膜組織才能保證后續(xù)試驗(yàn)研究順利進(jìn)行。然而，昆蟲圍食膜非常薄，而且一頭昆蟲的圍食膜要把它從中腸中解剖和分離出來(lái)也需要相當(dāng)熟練和有耐心才行，分離出來(lái)的圍食膜組織里面還有食物，如何在保證圍食膜蛋白不被降解的情況下，快速清洗掉里面的食物，又是一個(gè)技術(shù)難關(guān)，并且一頭像棉鈴蟲大小的五齡幼蟲圍食膜分離后僅僅才有53. 45 μ g干重，工作量相當(dāng)大。因此，迫切需要一種能夠快速而大批量地分離昆蟲圍食膜的新方法，以便研究昆蟲圍食膜的功能和作用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上研究背景和存在問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，該方法能夠快速?gòu)睦ハx中腸中分離圍食膜組織，并快速清洗掉里面的食物殘?jiān)?，得到大量純凈的圍食膜組織。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案—種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，其特征在于，按照下列步驟進(jìn)行步驟一，取昆蟲幼蟲標(biāo)本100頭 200頭，將放在冰浴上冷卻；步驟二，取與昆蟲幼蟲標(biāo)本數(shù)量相對(duì)應(yīng)2mL的EP管，每管中加入2mL在(TC下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水，將所有裝有生理鹽水的EP管也放在冰浴上冷卻；步驟三，依次取昆蟲幼蟲標(biāo)本，用解剖針將其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿昆蟲幼蟲的腹中線剪開體壁，暴露出整個(gè)消化道組織，用手術(shù)刀片從前腸前端切斷消化道，再切斷后腸后端的消化道，然后從后腸后端用鑷子分離出整個(gè)含有食物的圍食膜組織，立即將其放入EP管中，每EP管放一條圍食膜，繼續(xù)放在冰浴上冷卻，直至所有的EP管全部裝有昆蟲幼蟲的圍食膜組織；步驟四，將步驟三取出的全部含有圍食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再將另一 96孔塑料板壓在上面，用橡皮筋將兩個(gè)塑料板緊固，然后，將緊固后塑料板放在可控溫?fù)u床搖床中，將可控溫?fù)u床的溫度設(shè)置為0°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘；步驟五，開啟可控溫?fù)u床搖床15分鐘，將EP管中的圍食膜組織中的食物清洗出來(lái)；步驟六，取IOOmL的燒杯2 3個(gè)，加入在0°C下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水IOOmL,放在冰浴上，將上述步驟五中每個(gè)EP管中的圍食膜用鑷子夾出來(lái)，立即依次逐一放在燒杯中清洗2-3次，直到圍食膜透明漂浮，無(wú)任何食物附著為止；步驟七，將分離和清洗干凈的圍食膜收集，放在干凈的EP管中，并立即放在液氮中快速冷卻后，置-80 V冰箱保存。本發(fā)明的大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，比一般的方法效率約提高了 16倍，為昆蟲圍食膜中蛋白的后續(xù)研究提供了方便。
具體實(shí)施例方式為了清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本實(shí)施例以棉 鈴蟲圍食膜的大批量快速分離為例，需要說明的是，本發(fā)明不限于該實(shí)施例。在以下的實(shí)施例中，棉鈴幼蟲標(biāo)本的制作是選擇健康5齡棉鈴幼蟲，在0°C條件下快速冷凍(15分鐘或15分鐘以上)所得到。具體實(shí)施步驟如下1、取5齡棉鈴幼蟲標(biāo)本100頭 200頭，將放在冰浴上冷卻；2、取與5齡棉鈴幼蟲標(biāo)本數(shù)量相對(duì)應(yīng)2mL的EP管，每個(gè)EP管中加入2mL在0°C下提前冷卻好的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水，將這些裝有生理鹽水的EP管也放在冰浴上冷卻；3、依次取5齡棉鈴幼蟲標(biāo)本，用解剖針將其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿5齡棉鈴幼蟲的腹中線剪開體壁，暴露出整個(gè)消化道組織，用手術(shù)刀片從前腸前端切斷其消化道，再切斷后腸后端的消化道，然后從后腸的后端用鑷子拉出整個(gè)含有食物的圍食膜組織，立即將其放入上面的EP管中，每EP管放一條圍食膜，繼續(xù)放在冰浴上冷卻，直至所有的EP管全部裝有5齡棉鈴幼蟲的圍食膜組織。4、將可控溫?fù)u床設(shè)置在0°C，轉(zhuǎn)速設(shè)置在200轉(zhuǎn)/分鐘，等待后續(xù)操作使用。5、將步驟3中解剖取出的全部含有圍食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再將另一 96孔塑料板壓在上面，用橡皮筋將兩個(gè)96孔塑料板緊固，然后，將96孔塑料板放在上面已經(jīng)設(shè)好的可控溫?fù)u床中，打開可控溫?fù)u床15分鐘，就可以將EP管中的圍食膜組織中的食物清洗出來(lái)。
6、取IOOmL的燒杯2-3個(gè)，加入在(TC下提前冷卻好的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水IOOmL,放在冰浴上，將上述步驟5中每個(gè)EP管中的圍食膜用鑷子夾出來(lái)，立即逐一放在燒杯中清洗2-3次，直到圍食膜透明漂浮，無(wú)任何食物附著為止。7、將分離和清洗干凈的圍食膜收集，放在干凈的EP管中，每個(gè)EP管中放的圍食膜的數(shù)量根據(jù)試驗(yàn)不同而不同，一般每10條圍食膜放在一個(gè)EP管中，并立即放在液氮中快速冷卻后，置_80° C冰箱保存?zhèn)溆?。采用本發(fā)明的方法，可在1-2小時(shí)內(nèi)獲得100-200條昆蟲的圍食膜，其效率是一般方法的16倍以上。
權(quán)利要求
1.一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，其特征在于，按照下列步驟進(jìn)行 步驟一，取昆蟲幼蟲標(biāo)本100頭 200頭，將放在冰浴上冷卻； 步驟二，取與昆蟲幼蟲標(biāo)本數(shù)量相對(duì)應(yīng)2mL的EP管，每管中加入2mL在(TC下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水，將所有裝有生理鹽水的EP管也放在冰浴上冷卻； 步驟三，依次取昆蟲幼蟲標(biāo)本，用解剖針將其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿昆蟲幼蟲的腹中線剪開體壁，暴露出整個(gè)消化道組織，用手術(shù)刀片從前腸前端切斷消化道，再切斷后腸后端的消化道，然后從后腸后端用鑷子分離出整個(gè)含有食物的圍食膜組織，立即將其放入EP管中，每EP管放一條圍食膜，繼續(xù)放在冰浴上冷卻，直至所有的EP管全部裝有昆蟲幼蟲的圍食膜組織； 步驟四，將步驟三取出的全部含有圍食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再將另一 96孔塑料板壓在上面，用橡皮筋將兩個(gè)塑料板緊固，然后，將緊固后塑料板放在可控溫?fù)u床搖床中，將可控溫?fù)u床的溫度設(shè)置為0°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘； 步驟五，開啟可控溫?fù)u床搖床15分鐘，將EP管中的圍食膜組織中的食物清洗出來(lái)；步驟六，取IOOmL的燒杯2 3個(gè)，加入在0°C下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水IOOmL,放在冰浴上，將上述步驟五中每個(gè)EP管中的圍食膜用鑷子夾出來(lái)，立即依次逐一放在燒杯中清洗2-3次，直到圍食膜透明漂浮，無(wú)任何食物附著為止； 步驟七，將分離和清洗干凈的圍食膜收集，放在干凈的EP管中，并立即放在液氮中快速冷卻后，置_80°C冰箱保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，該方法可在短時(shí)間內(nèi)從昆蟲中腸中分離圍食膜組織，然后再快速清洗掉里面的食物殘?jiān)?，得到大量純凈的圍食膜組織，比一般的方法效率提高了16倍，為昆蟲圍食膜中蛋白的后續(xù)研究提供了方便。
文檔編號(hào)C12N5/07GK103060261SQ20121059217
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者梁革梅, 李怡萍, 郭予元, 魏紀(jì)珍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 西北農(nóng)林科技大學(xué)