專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程領(lǐng)域，更具體地涉及一種能夠檢測(cè)組織工程生物反應(yīng)器中組織培養(yǎng)物或組織植入物上活細(xì)胞生長(zhǎng)情況的檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法，用于在線(xiàn)或離線(xiàn)連續(xù)定量檢測(cè)組織培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞在某一個(gè)特定的組織工程支架或組織植入物上生長(zhǎng)和存活的真實(shí)情況，評(píng)估組織培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)與存活的影響因素，對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。
背景技術(shù)：
組織工程技術(shù)的一個(gè)重要應(yīng)用就是體外構(gòu)建組織植入物，即用組織工程方法體外構(gòu)建組織植入物是將體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞，接種于天然或人工合成的組織工程支架上，在體外培養(yǎng)后，再移植到體內(nèi)，以替代病損的組織。組織工程技術(shù)的發(fā)展為先天性疾病和獲得性疾病的治療創(chuàng)造了前所未有的機(jī)會(huì)。組織植入物上的活細(xì)胞量是一個(gè)非常重要的參數(shù)，它是分析細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和代謝的基礎(chǔ)，是控制組織培養(yǎng)過(guò)程的首要參數(shù)，也是評(píng)估組織植入物是否具有生理功能的重要指標(biāo)。在組織植入物的培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常需要及時(shí)地、定量地了解細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，以便對(duì)培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。但是目前的組織工程反應(yīng)器缺乏能夠?qū)ε囵B(yǎng)中的組織培養(yǎng)物進(jìn)行在線(xiàn)、連續(xù)、定量檢測(cè)的裝置，在組織培養(yǎng)中大多數(shù)情況下只能對(duì)細(xì)胞在組織植入物上的生長(zhǎng)情況進(jìn)行非連續(xù)的、非動(dòng)態(tài)的終點(diǎn)檢測(cè)，而不能進(jìn)行連續(xù)的、動(dòng)態(tài)的檢測(cè)。如果要連續(xù)觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)及存活情況，需要同時(shí)培養(yǎng)大量樣品，在培養(yǎng)過(guò)程中取出培養(yǎng)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)。這會(huì)造成支架、種子細(xì)胞、培養(yǎng)基及培養(yǎng)設(shè)備的大量浪費(fèi)。對(duì)于種子細(xì)胞稀缺、培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜、培養(yǎng)困難的組織培養(yǎng)過(guò)程，受到培養(yǎng)規(guī)模的限制，培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的連續(xù)檢測(cè)和評(píng)估就更加難以實(shí)現(xiàn)。因此，在組織工程領(lǐng)域迫切需要建立簡(jiǎn)單快速、能夠在不損傷細(xì)胞活性及生理功能，不中斷培養(yǎng)過(guò)程的前提下進(jìn)行`活細(xì)胞定量的檢測(cè)裝置和檢測(cè)方法。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(200680041273.4)公開(kāi)了一種用于檢測(cè)活細(xì)胞活性的裝置和方法，使用成像傳感器分析細(xì)胞在熒光染料刺激后的熒光圖像，獲得細(xì)胞活性的檢測(cè)數(shù)據(jù)。本發(fā)明的目的在于提供了一種能夠在線(xiàn)或離線(xiàn)的、連續(xù)的、定量的檢測(cè)組織工程反應(yīng)器中培養(yǎng)的組織植入物上細(xì)胞活性和生長(zhǎng)情況的裝置和相應(yīng)的檢測(cè)方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該裝置具有一個(gè)與組織培養(yǎng)回路相并聯(lián)的檢測(cè)回路和一個(gè)與組織培養(yǎng)回路相并聯(lián)的沖洗回路，能夠在不中斷培養(yǎng)過(guò)程的情況下檢測(cè)細(xì)胞活性和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并且能夠及時(shí)去除檢測(cè)試劑對(duì)細(xì)胞的危害；另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該裝置和方法簡(jiǎn)單有效容易實(shí)施，對(duì)組織培養(yǎng)設(shè)備和檢測(cè)設(shè)備的要求也不高。其實(shí)施效果在于能夠?qū)崿F(xiàn)組織培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)的可控化、可監(jiān)測(cè)化，有利于為組織植入物的臨床應(yīng)用、制定相關(guān)的GLP和GMP規(guī)范提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種能夠在線(xiàn)或離線(xiàn)的、連續(xù)的、定量的檢測(cè)組織工程反應(yīng)器中培養(yǎng)的組織植入物上細(xì)胞活性和生長(zhǎng)情況的裝置，其特征在于包括:一個(gè)與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的檢測(cè)回路和一個(gè)與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的沖洗回路。檢測(cè)回路和沖洗回路通過(guò)閥門(mén)和管路組合在一起，并通過(guò)閥門(mén)開(kāi)閉控制檢測(cè)回路和沖洗回路的切換。所述的與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的檢測(cè)回路，包括一個(gè)檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶，通過(guò)管路與組織培養(yǎng)腔相連；一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵設(shè)置在檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶和組織培養(yǎng)腔之間，用于驅(qū)動(dòng)液體在回路中流動(dòng)；一個(gè)檢測(cè)器，設(shè)置在組織培養(yǎng)腔下游，用于檢測(cè)信號(hào)變化；在檢測(cè)過(guò)程中恒流泵驅(qū)動(dòng)檢測(cè)液在該封閉的回路中循環(huán)。所述的與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的沖洗回路，包括一個(gè)沖洗液儲(chǔ)液瓶，通過(guò)管路依次與組織培養(yǎng)腔、檢測(cè)器相連；一個(gè)設(shè)置在檢測(cè)器下游的廢液瓶，一個(gè)恒流泵設(shè)置在沖洗液儲(chǔ)液瓶和組織培養(yǎng)腔之間，用于驅(qū)動(dòng)液體從沖洗液儲(chǔ)液瓶依次流經(jīng)組織培養(yǎng)腔和檢測(cè)器，流入廢液瓶，完成對(duì)檢測(cè)回路的沖洗；一個(gè)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種能夠在線(xiàn)的、連續(xù)的、定量的檢測(cè)組織工程反應(yīng)器中培養(yǎng)的組織植入物上細(xì)胞活性和生長(zhǎng)情況的方法，其特征在于包括:1、關(guān)閉組織培養(yǎng)回路上下游2、切換至沖洗回路；

3、沖洗組織培養(yǎng)物；4、關(guān)閉沖洗回路，開(kāi)啟檢測(cè)回路；5、將檢測(cè)試劑注入到組織培養(yǎng)腔內(nèi)；6、讓檢測(cè)試劑在檢測(cè)回路中循環(huán)，檢測(cè)初始狀態(tài)的光密度或熒光強(qiáng)度作為初始值(參比)；7、讓檢測(cè)試劑在檢測(cè)回路中循環(huán)，讓檢測(cè)試劑反應(yīng)至規(guī)定的時(shí)間；8、檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束時(shí)的光密度或熒光強(qiáng)度，將檢測(cè)到的信號(hào)與參比對(duì)照，計(jì)算活細(xì)胞量；9、切換至沖洗回路10、沖洗組織培養(yǎng)物；11、關(guān)閉沖洗回路，切換至培養(yǎng)回路，繼續(xù)組織培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的反應(yīng)試劑可以是對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或低毒的試劑包括:含有刃天青(Resazurin)染料的試劑如Alamar Blue,含有二乙酰突光素(FDA)染料的試劑，含有乳酸脫氫酶的試劑，含有氟衍生物(fuo derivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、口引哚衍生物(indo derivate)、rhod_2、鈣綠和quin-2組成的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案里所述的組織培養(yǎng)物111上的細(xì)胞包括:原代培養(yǎng)的各種組織細(xì)胞、連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系、具有多種分化潛能或單一分化潛能的干細(xì)胞。這些細(xì)胞生長(zhǎng)在組織工程支架上或微載體上。所述的組織培養(yǎng)物111可以是固定在組織工程反應(yīng)器的組織培養(yǎng)腔中，也可以是在組織培養(yǎng)腔中懸浮狀態(tài)培養(yǎng)。


圖1示意顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的活細(xì)胞檢測(cè)裝置中沖洗回路的結(jié)構(gòu)；圖2示意顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的活細(xì)胞檢測(cè)裝置中檢測(cè)回路的結(jié)構(gòu)；
圖3示意顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)，其中沖洗回路和檢測(cè)回路在一條通路上；圖4示意顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的三通閥的結(jié)構(gòu)和流路方向的切換；圖5示意顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的帶有細(xì)胞截留裝置的組織培養(yǎng)腔的結(jié)構(gòu)；圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的進(jìn)行活細(xì)胞檢測(cè)的流程圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置包括一個(gè)與組織培養(yǎng)回路并聯(lián)的沖洗回路包括:一個(gè)沖洗液儲(chǔ)液瓶101，一個(gè)三通閥102，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)三通閥104，一個(gè)組織培養(yǎng)腔105，組織培養(yǎng)物111、一個(gè)三通閥106，一個(gè)檢測(cè)腔107，一個(gè)三通閥108，一個(gè)廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個(gè)回路。用于在檢測(cè)之前沖洗組織培養(yǎng)物111及檢測(cè)回路，去除影響檢測(cè)反應(yīng)的培養(yǎng)液；或在檢測(cè)活細(xì)胞量之后沖洗洗組織培養(yǎng)物111及檢測(cè)回路，去除檢測(cè)液，消除檢測(cè)液長(zhǎng)期存在對(duì)細(xì)胞的影響。所述的組織培養(yǎng)物111位于組織培養(yǎng)腔內(nèi)105，可以是固定在組織培養(yǎng)腔105內(nèi)培養(yǎng)，也可以是懸浮在組織培養(yǎng)腔105內(nèi)培養(yǎng)。所述的三通閥用于控制流路或流路組件的開(kāi)閉，從而完成流路的切換。其中所述的三通閥104和106分別位于組織培養(yǎng)腔105的上下游，完成流路在組織培養(yǎng)回路112與檢測(cè)或沖洗回路之間的切換；三通閥102位于沖洗液儲(chǔ)液瓶上游，用于控制沖洗液儲(chǔ)液瓶的開(kāi)閉。所述的液體驅(qū)動(dòng)泵 103設(shè)置在沖洗液儲(chǔ)液瓶101和組織培養(yǎng)腔105之間，用于驅(qū)動(dòng)液體從沖洗液儲(chǔ)液瓶101依次流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105和檢測(cè)腔107，流入廢液瓶109，完成對(duì)組織培養(yǎng)物的沖洗。在沖洗的具體實(shí)施過(guò)程中:(I)旋轉(zhuǎn)三通閥102至沖洗液儲(chǔ)液瓶101和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥104至液體驅(qū)動(dòng)泵103、組織培養(yǎng)腔105之間流路暢通，組織培養(yǎng)回路112上游與組織培養(yǎng)腔105之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥106至組織培養(yǎng)腔105與檢測(cè)腔107之間流路暢通，組織培養(yǎng)腔105組織培養(yǎng)回路112下游之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥108至檢測(cè)腔107與廢液瓶109之間流路暢通。(2)開(kāi)啟液體驅(qū)動(dòng)泵103，使沖洗液逐漸替換流路的其它液體，直至沖洗液完全充滿(mǎn)流路，在此過(guò)程中液體流入廢液瓶109。如圖2所示，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置包括一個(gè)與組織培養(yǎng)回路并聯(lián)的檢測(cè)回路包括:一個(gè)檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201，一個(gè)三通閥202，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)三通閥104，一個(gè)組織培養(yǎng)腔105，組織培養(yǎng)物111，一個(gè)三通閥106，一個(gè)檢測(cè)器203，檢測(cè)器中與檢測(cè)管路相連接的檢測(cè)腔107，一個(gè)三通閥108，一個(gè)廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個(gè)回路，檢測(cè)器與一個(gè)計(jì)算機(jī)204連接，通過(guò)計(jì)算機(jī)204控制檢測(cè)器并進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理和輸出。三通閥202位于檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間，完成流路在檢測(cè)回路、檢測(cè)循環(huán)回路或沖洗回路之間的切換；三通閥104和106分別位于組織培養(yǎng)腔105的上下游，完成流路在組織培養(yǎng)回路與檢測(cè)或沖洗回路之間的切換；三通閥108位于廢液瓶109和檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶101之間，完成流路在檢測(cè)回路或檢測(cè)循環(huán)回路之間的切換。在檢測(cè)的具體實(shí)施過(guò)程中:(I)旋轉(zhuǎn)三通閥202至檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通，檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201和廢液瓶109之間流路關(guān)閉，旋轉(zhuǎn)三通閥104至液體驅(qū)動(dòng)泵103、組織培養(yǎng)腔105之間流路暢通，組織培養(yǎng)回路112上游與組織培養(yǎng)腔105之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥106至組織培養(yǎng)腔105與檢測(cè)腔107之間流路暢通，組織培養(yǎng)腔105組織培養(yǎng)回路112下游之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥108至檢測(cè)腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201之間流路關(guān)閉。(2)開(kāi)啟液體驅(qū)動(dòng)泵103，使檢測(cè)液逐漸替換流路的其它液體，直至檢測(cè)液完全充滿(mǎn)流路，在此過(guò)程中液體流入廢液瓶109。(3)旋轉(zhuǎn)三通閥202至檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201關(guān)閉，液體驅(qū)動(dòng)泵103和檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201下游之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥108至廢液瓶109關(guān)閉，液體驅(qū)動(dòng)泵103和檢測(cè)腔107之間流路暢通，從而形成一個(gè)封閉的回路，檢測(cè)液由液體驅(qū)動(dòng)泵103驅(qū)動(dòng)，在組織培養(yǎng)腔105和檢測(cè)腔107中循環(huán)流動(dòng)，使得在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)體積的檢測(cè)劑與組織植入物上的細(xì)胞充分反應(yīng)；檢測(cè)液的循環(huán)流動(dòng)起到傳質(zhì)和混合的作用，使檢測(cè)液反應(yīng)更充分，提高反應(yīng)的信號(hào)，防止?fàn)I養(yǎng)物耗竭，代謝廢物運(yùn)出。其中所述的管路110是由無(wú)毒的、能夠耐受濕熱滅菌或化學(xué)滅菌如環(huán)氧乙烷、酒精滅菌的軟管或硬管組成，管子的直徑在0.1mm到3mm之間。其中所述的檢測(cè)腔107是能夠進(jìn)行熒光、吸光度、或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的腔體；檢測(cè)器110是可進(jìn)行熒光、吸光度、或 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的設(shè)備模塊；檢測(cè)器與一個(gè)計(jì)算機(jī)112連接，通過(guò)計(jì)算機(jī)112控制檢測(cè)器，并進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理和輸出。其中所述的檢測(cè)液可以是對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或低毒的試劑包括:含有刃天青(Resazurin)染料的試劑如Alamar Blue,含有二乙酰突光素染料的試劑,含有乳酸脫氫酶的試劑，含有氟衍生物(fluo derivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、卩引哚衍生物(indo derivate)、rhod_2、|丐綠和quin_2組成的試劑。并且檢測(cè)液含有對(duì)應(yīng)的組織細(xì)胞維持代謝必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和PH環(huán)境，例如與待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)條件一致的細(xì)胞培養(yǎng)液或D-Hanks液、PBS液等，并且這些物質(zhì)不影響檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行和信號(hào)的檢測(cè)。如圖3所示，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其中沖洗回路和檢測(cè)回路整合在在一條通路上，包括:一個(gè)沖洗液儲(chǔ)液瓶101，一個(gè)三通閥102，一個(gè)檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201，一個(gè)三通閥202，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)三通閥104，一個(gè)組織培養(yǎng)腔105，組織培養(yǎng)物111，一個(gè)三通閥106，一個(gè)檢測(cè)器203，檢測(cè)器中與檢測(cè)管路相連接的檢測(cè)腔107，一個(gè)三通閥108，一個(gè)廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個(gè)回路，檢測(cè)器與一個(gè)計(jì)算機(jī)204連接，通過(guò)計(jì)算機(jī)204控制檢測(cè)器并進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理和輸出。所述的檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201、沖洗液儲(chǔ)液瓶101、廢液瓶109依次設(shè)置于液體驅(qū)動(dòng)泵103的上游，分別通過(guò)三通閥202、102、108與液體驅(qū)動(dòng)泵103上游的管路相連，通過(guò)三通閥的開(kāi)閉控制檢測(cè)回路和沖洗回路的切換。
所述的沖洗回路和檢測(cè)回路組合方式可以簡(jiǎn)化活細(xì)胞檢測(cè)裝置，在活細(xì)胞檢測(cè)過(guò)程中通過(guò)流路切換方便地完成樣品的沖洗和檢測(cè)。如圖4所示，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的三通閥，通過(guò)三通閥內(nèi)部閥芯的旋轉(zhuǎn)，控制液體流路在兩個(gè)或三個(gè)方向上暢通，從而完成流路的切換。值得注意的是，也可以用在回路上設(shè)置兩個(gè)兩通閥來(lái)代替所述的三通閥，只要其能夠完成相應(yīng)的流路切換的過(guò)程。如圖5所示，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的組織培養(yǎng)腔105，在其出口處有一個(gè)細(xì)胞截留裝置501，當(dāng)組織植入物懸浮生長(zhǎng)在組織工程反應(yīng)器中時(shí)，細(xì)胞截留裝置501使沖洗液、檢測(cè)液等液體通過(guò)組織培養(yǎng)腔105流入下游檢測(cè)腔107而細(xì)胞被截留在培養(yǎng)腔內(nèi)。所述的細(xì)胞截留裝置可以是砂 芯、濾器或篩網(wǎng)，其截留孔徑在1-10 μ m。如圖6所示，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的進(jìn)行活細(xì)胞檢測(cè)的流程圖。在一個(gè)結(jié)合圖3裝置的具體檢測(cè)的實(shí)施過(guò)程中:(I)旋轉(zhuǎn)三通閥104至組織培養(yǎng)回路112上游與組織培養(yǎng)腔105之間流路關(guān)閉，液體驅(qū)動(dòng)泵103、組織培養(yǎng)腔105之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥106至組織培養(yǎng)腔105組織培養(yǎng)回路112下游之間流路關(guān)閉，組織培養(yǎng)腔105與檢測(cè)腔107之間流路暢通；從而關(guān)閉組織培養(yǎng)回路。(2)旋轉(zhuǎn)三通閥102至沖洗液儲(chǔ)液瓶101和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥202至檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201關(guān)閉，沖洗液儲(chǔ)液瓶101與液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥108至檢測(cè)腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與沖洗液儲(chǔ)液瓶201之間流路關(guān)閉；從而使沖洗回路暢通。(3)開(kāi)啟液體驅(qū)動(dòng)泵103，使沖洗液逐漸替換流路的其它液體，直至沖洗液完全充滿(mǎn)流路，在此過(guò)程中液體流入廢液瓶109，從而完成組織培養(yǎng)物的沖洗。(4)旋轉(zhuǎn)三通閥202至檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通，檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201和沖洗液儲(chǔ)液瓶101之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥108至檢測(cè)腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與沖洗液儲(chǔ)液瓶101之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥102關(guān)閉沖洗液儲(chǔ)液瓶101，沖洗液儲(chǔ)液瓶101和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通；從而完成沖洗回路到檢測(cè)回路的切換。(5)開(kāi)啟液體驅(qū)動(dòng)泵103，使檢測(cè)液逐漸替換流路的其它液體，直至檢測(cè)液完全充滿(mǎn)流路，在此過(guò)程中液體流入廢液瓶109，從而完成檢測(cè)液的導(dǎo)入。(6)旋轉(zhuǎn)三通閥202至檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201關(guān)閉，液體驅(qū)動(dòng)泵103和檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201下游之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥108至廢液瓶109關(guān)閉，液體驅(qū)動(dòng)泵103、組織培養(yǎng)腔105和檢測(cè)腔107之間流路暢通，從而形成一個(gè)封閉的回路，檢測(cè)液由液體驅(qū)動(dòng)泵103驅(qū)動(dòng)，在組織培養(yǎng)腔105和檢測(cè)腔107中循環(huán)流動(dòng)；從而完成檢測(cè)液在檢測(cè)回路內(nèi)的循環(huán)。(7)檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)器的反應(yīng)信號(hào)，如吸光度、熒光強(qiáng)度、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度等信號(hào)的變化作為初始信號(hào)，傳遞到計(jì)算機(jī)204，從而完成初始信號(hào)的采集。(8)檢測(cè)液由液體驅(qū)動(dòng)泵103驅(qū)動(dòng)，在組織培養(yǎng)腔105和檢測(cè)腔107中循環(huán)流動(dòng)規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間，使檢測(cè)劑與組織植入物上的細(xì)胞充分反應(yīng)；檢測(cè)器檢測(cè)反應(yīng)信號(hào)，把信號(hào)傳遞到計(jì)算機(jī)204，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理獲得活細(xì)胞量的數(shù)據(jù)。值得注意的是，所述的檢測(cè)液的循環(huán)流動(dòng)起到傳質(zhì)和混合的作用，使檢測(cè)液反應(yīng)更充分，提高反映的信號(hào)，防止?fàn)I養(yǎng)物耗竭，方便代謝廢物運(yùn)出。所述的反應(yīng)時(shí)間為0.5-4小時(shí)；所述的反應(yīng)信號(hào)包括:吸光度、熒光強(qiáng)度、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度等；所述的信號(hào)檢測(cè)包括在反應(yīng)期間連續(xù)檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)腔的信號(hào)變化，或者只檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)檢測(cè)腔的信號(hào)。(9)檢測(cè)結(jié)束，旋轉(zhuǎn)三通閥102至沖洗液儲(chǔ)液瓶101和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥202至檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201關(guān)閉，沖洗液儲(chǔ)液瓶201與液體驅(qū)動(dòng)泵103之間流路暢通；旋轉(zhuǎn)三通閥104至液體驅(qū)動(dòng)泵103、組織培養(yǎng)腔105之間流路暢通，組織培養(yǎng)回路112上游與組織培養(yǎng)腔105之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥106至組織培養(yǎng)腔105與檢測(cè)腔107之間流路暢通，組織培養(yǎng)腔105組織培養(yǎng)回路112下游之間流路關(guān)閉；旋轉(zhuǎn)三通閥108至檢測(cè)腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與沖洗液儲(chǔ)液瓶201之間流路關(guān)閉；從而完成檢測(cè)回路到?jīng)_洗回路的切換。(10)開(kāi)啟液體驅(qū)動(dòng)泵103，使沖洗液逐漸替換流路的其它液體，直至沖洗液完全充滿(mǎn)流路，在此過(guò)程中液體流入廢液瓶109，從而完成組織培養(yǎng)物的沖洗。(11)關(guān)閉液體驅(qū)動(dòng)泵103，旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)三通閥104和106至組織培養(yǎng)回路112上、下游與組織培養(yǎng)腔105之間流路暢通，沖洗和檢測(cè)回路關(guān)閉，從而將反應(yīng)器切換到組織培養(yǎng)回路。實(shí)施例1在組織培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)培養(yǎng)的血管組織上的活細(xì)胞量( I)旋轉(zhuǎn)三通閥切換流路，使組織培養(yǎng)腔105上下游的組織培養(yǎng)回路關(guān)閉，檢測(cè)劑儲(chǔ)液瓶201關(guān)閉，沖洗回路暢通；(2)開(kāi)啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲(chǔ)液瓶101流出，流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105、檢測(cè)腔107，再流入廢液瓶，從而完成對(duì)組織培養(yǎng)腔及培養(yǎng)物中溶液的置換，排除培養(yǎng)液中物質(zhì)(如脫落細(xì)胞等)對(duì)檢測(cè)的干擾；

(3)沖洗完成后，旋轉(zhuǎn)三通閥切換流路，使沖洗液儲(chǔ)液瓶101關(guān)閉，檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201通暢，開(kāi)啟恒流泵103，使檢測(cè)液從檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶流出，流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105、檢測(cè)腔107，再流入廢液瓶，從而完成檢測(cè)液對(duì)組織培養(yǎng)腔及培養(yǎng)物中沖洗液的置換，使整個(gè)檢測(cè)回路中的液體為濃度均一的，未經(jīng)稀釋的檢測(cè)液；(4)旋轉(zhuǎn)三通閥切換流路，使廢液儲(chǔ)液瓶109關(guān)閉，從而使檢測(cè)液在封閉回路中循環(huán)，保持檢測(cè)液中含有維持細(xì)胞正常代謝的成分(如培養(yǎng)基、Hanks液成分等)，保證細(xì)胞在檢測(cè)期間維持正常的生理狀態(tài)，保證在檢測(cè)期間細(xì)胞基本的營(yíng)養(yǎng)需求?；芈贩忾]循環(huán)，保證反應(yīng)體系的傳質(zhì)，防止局部物質(zhì)過(guò)濃，影響反應(yīng)結(jié)果。(5)檢測(cè)反應(yīng)初始時(shí)刻的通過(guò)檢測(cè)器的反應(yīng)信號(hào)作為初始信號(hào)，傳遞到計(jì)算機(jī)204，從而完成初始信號(hào)的采集。(6)讓檢測(cè)液在回路中循環(huán)規(guī)定的時(shí)間，在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，檢測(cè)器檢測(cè)反應(yīng)信號(hào)，把信號(hào)傳遞到計(jì)算機(jī)204，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理獲得活細(xì)胞量的數(shù)據(jù)。(7)在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將三通閥切換至洗液回路暢通；(8)開(kāi)啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲(chǔ)液瓶101流出，流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105，再流入廢液瓶109，從而完成對(duì)組織培養(yǎng)腔及培養(yǎng)物的沖洗。(9)關(guān)閉恒流泵103，旋轉(zhuǎn)三通閥關(guān)閉檢測(cè)回路上下游，切換至培養(yǎng)回路，使培養(yǎng)回路暢通；繼續(xù)組織培養(yǎng)。實(shí)施例2在組織培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)懸浮培養(yǎng)的微載體上的細(xì)胞活力
(I)旋轉(zhuǎn)三通閥切換流路，使組織培養(yǎng)腔105上下游的組織培養(yǎng)回路關(guān)閉，檢測(cè)劑儲(chǔ)液瓶201關(guān)閉，沖洗回路暢通；(2)開(kāi)啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲(chǔ)液瓶101流出，流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105、組織培養(yǎng)腔出口的細(xì)胞截留器501、檢測(cè)腔107，再流入廢液瓶，從而完成對(duì)組織培養(yǎng)腔及培養(yǎng)物中溶液的置換，排除培養(yǎng)液中物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾；(3)沖洗完成后，旋轉(zhuǎn)三通閥切換流路，使沖洗液儲(chǔ)液瓶101關(guān)閉，檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201通暢，開(kāi)啟恒流泵103，使檢測(cè)液從檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶流出，流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105、組織培養(yǎng)腔出口細(xì)胞截留器501、檢測(cè)腔107，再流入廢液瓶，從而完成檢測(cè)液對(duì)組織培養(yǎng)腔及培養(yǎng)物中沖洗液的置換，使整個(gè)檢測(cè)回路中的液體為濃度均一的，未經(jīng)稀釋的檢測(cè)液；(4)旋轉(zhuǎn)三通閥切換流路，使廢液儲(chǔ)液瓶109關(guān)閉，從而使檢測(cè)液在封閉回路中循環(huán)，保持檢測(cè)液中含有維持細(xì)胞正常代謝的成分(如培養(yǎng)基、Hanks液成分等)，保證細(xì)胞在檢測(cè)期間維持正常的生理狀態(tài)，保證在檢測(cè)期間細(xì)胞基本的營(yíng)養(yǎng)需求?；芈贩忾]循環(huán)，保證反應(yīng)體系的傳質(zhì)，防止局部物質(zhì)過(guò)濃，影響反應(yīng)結(jié)果。(5)檢測(cè)反應(yīng)初始時(shí)刻的通過(guò)檢測(cè)器的反應(yīng)信號(hào)作為初始信號(hào)，傳遞到計(jì)算機(jī)204，從而完成初始信號(hào)的采集。(6)讓檢測(cè)液在回路中循環(huán)規(guī)定的時(shí)間，在反應(yīng)期間，檢測(cè)器連續(xù)檢測(cè)反應(yīng)信號(hào)，把信號(hào)傳遞到計(jì)算機(jī)204，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理獲得細(xì)胞活力的數(shù)據(jù)。(7)在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將三通閥切換至沖洗回路暢通；(8)開(kāi)啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲(chǔ)液瓶101流出，流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105，組織培養(yǎng)腔出口的細(xì)胞截留器501、再流入廢液瓶109，從而完成對(duì)組織培養(yǎng)腔及培養(yǎng)物的沖洗。(9)關(guān)閉恒流泵103，旋轉(zhuǎn)三`通閥關(guān)閉檢測(cè)回路上下游，切換至培養(yǎng)回路，使培養(yǎng)回路暢通；繼續(xù)組織培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，包括一個(gè)與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的檢測(cè)回路和一個(gè)與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的沖洗回路。檢測(cè)回路和沖洗回路通過(guò)三通閥和管路組合在一起，并通過(guò)閥門(mén)開(kāi)閉控制檢測(cè)回路和沖洗回路的切換。
所述的沖洗回路包括一個(gè)沖洗液儲(chǔ)液瓶101，一個(gè)三通閥102，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)三通閥104，一個(gè)組織培養(yǎng)腔105，組織培養(yǎng)物111、一個(gè)三通閥106，一個(gè)檢測(cè)腔107，一個(gè)三通閥108，一個(gè)廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個(gè)回路； 所述的檢測(cè)回路包括一個(gè)檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201，一個(gè)三通閥202，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)三通閥104，一個(gè)組織培養(yǎng)腔105，組織培養(yǎng)物111、一個(gè)三通閥106，一個(gè)檢測(cè)器203，檢測(cè)器中與檢測(cè)管路相連接的檢測(cè)腔107，一個(gè)三通閥108，一個(gè)廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個(gè)回路，檢測(cè)器與一個(gè)計(jì)算機(jī)204連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一個(gè)與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的沖洗回路: 所述的組織培養(yǎng)物111位于組織培養(yǎng)腔內(nèi)105 ； 所述的三通閥104和106分別位于組織培養(yǎng)腔105的上下游，完成流路在組織培養(yǎng)回路與檢測(cè)或沖洗回路之間的切換；三通閥102位于沖洗液儲(chǔ)液瓶上游，用于控制沖洗液儲(chǔ)液瓶的開(kāi)閉； 所述的液體驅(qū)動(dòng)泵103設(shè)置在沖洗液儲(chǔ)液瓶101和組織培養(yǎng)腔105之間，用于驅(qū)動(dòng)液體從沖洗液儲(chǔ)液瓶101依次流經(jīng)組織培養(yǎng)腔105和檢測(cè)腔107，流入廢液瓶109，完成對(duì)組織培養(yǎng)物的沖洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一個(gè)與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的檢測(cè)回路: 所述的三通閥202位于檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201和液體驅(qū)動(dòng)泵103之間，完成流路在檢測(cè)回路、檢測(cè)循環(huán)回路或沖洗回路之間的切換；三通閥104和106分別位于組織培養(yǎng)腔105的上下游，完成流路在組織培養(yǎng)回路與檢測(cè)或沖洗回路之間的切換；三通閥108位于廢液瓶109和檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶101之間，完成流路在檢測(cè)回路或檢測(cè)循環(huán)回路之間的切換； 所述的檢測(cè)器，設(shè)置在組織培養(yǎng)腔下游，用于檢測(cè)信號(hào)變化；在檢測(cè)過(guò)程中恒流泵103驅(qū)動(dòng)檢測(cè)液在該封閉的回路中循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于進(jìn)一步包括檢測(cè)回路和沖洗回路通過(guò)三通閥和管路組合在一起，并通過(guò)閥門(mén)開(kāi)閉控制檢測(cè)回路和沖洗回路的切換: 一個(gè)沖洗液儲(chǔ)液瓶101，一個(gè)三通閥102，一個(gè)檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201，一個(gè)三通閥202，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)三通閥104，一個(gè)組織培養(yǎng)腔105，一個(gè)三通閥106，一個(gè)檢測(cè)器203，檢測(cè)器中與檢測(cè)管路相連接的檢測(cè)腔107，一個(gè)三通閥108，一個(gè)廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個(gè)回路，檢測(cè)器與一個(gè)計(jì)算機(jī)204連接，通過(guò)計(jì)算機(jī)204控制檢測(cè)器并進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理和輸出； 所述的檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201、沖洗液儲(chǔ)液瓶101、廢液瓶109依次設(shè)置于液體驅(qū)動(dòng)泵103的上游，分別通過(guò)三通閥202、102、108與液體驅(qū)動(dòng)泵103上游的管路相連，通過(guò)三通閥的開(kāi)閉控制檢測(cè)回路和沖洗回路的 切換。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，檢測(cè)組織工程生物反應(yīng)器中組織植入物上細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞活性的方法，其特征在于包括: (1)關(guān)閉組織培養(yǎng)回路上下游 (2)切換至沖洗回路； (3)沖洗組織培養(yǎng)物； (4)關(guān)閉沖洗回路，開(kāi)啟檢測(cè)回路； (5)將檢測(cè)試劑注入到組織培養(yǎng)腔內(nèi)； (6)讓檢測(cè)試劑在檢測(cè)回路中循環(huán)，檢測(cè)初始狀態(tài)的光密度或熒光強(qiáng)度作為初始值(參比)； (7)讓檢測(cè)試劑在檢測(cè)回路中循環(huán)，讓檢測(cè)試劑反應(yīng)至規(guī)定的時(shí)間； (8)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束時(shí)的光密度或熒光強(qiáng)度，將檢測(cè)到的信號(hào)與參比對(duì)照，計(jì)算活細(xì)胞量; (9)切換至沖洗回路 (10)沖洗組織培養(yǎng)物； (11)關(guān)閉沖洗回路，切換至培養(yǎng)回路，繼續(xù)組織培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于所述的管路所述的管路110是由無(wú)毒的、能夠耐受濕熱滅菌或化學(xué)滅菌如環(huán)氧乙烷、酒精滅菌的軟管或硬管組成，管子的直徑在0.1mm到3mm之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于所述的檢測(cè)腔107是能夠進(jìn)行熒光、吸光度、或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的腔體；檢測(cè)器110是可進(jìn)行熒光、吸光度、或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的設(shè)備模塊；檢測(cè)器與一個(gè)計(jì)算機(jī)112連接，通過(guò)計(jì)算機(jī)112控制檢測(cè)器，并進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理和輸出。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于所述的檢測(cè)液可以是對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或低毒的試劑包括:含有刃天青(Resazurin)染料的試劑如Alamar Blue，含有二乙酰熒光素染料的試劑，含有乳酸脫氫酶的試劑，含有氟衍生物(fluoderivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、卩引哚衍生物(indo derivate)、rhod_2、|丐綠和quin-2組成的試劑。并且檢測(cè)液含有對(duì)應(yīng)的組織細(xì)胞維持代謝必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH環(huán)境，例如與待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)條件一致的細(xì)胞培養(yǎng)液或D-Hanks液、PBS液等，并且這些物質(zhì)不影響檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行和信號(hào)的檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置，其特征在于所述的組織培養(yǎng)物111可以是固定在組織工程反應(yīng)器的組織培養(yǎng)腔中，也可以是在組織培養(yǎng)腔中懸浮狀態(tài)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于組織工程反應(yīng)器的活細(xì)胞檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法，可在不損傷細(xì)胞活性及功能，不中斷培養(yǎng)過(guò)程的前提下檢測(cè)組織工程生物反應(yīng)器中組織培養(yǎng)物的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的活細(xì)胞檢測(cè)裝置包括與組織工程反應(yīng)器的培養(yǎng)回路并聯(lián)的一個(gè)沖洗回路和一個(gè)檢測(cè)回路，兩者通過(guò)三通閥和管路組合在一起，通過(guò)閥門(mén)開(kāi)閉控制回路之間的切換。沖洗回路包括一個(gè)沖洗液儲(chǔ)液瓶101，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)廢液瓶109，完成檢測(cè)前后對(duì)組織培養(yǎng)物111的沖洗；檢測(cè)回路包括一個(gè)檢測(cè)液儲(chǔ)液瓶201，一個(gè)液體驅(qū)動(dòng)泵103，一個(gè)檢測(cè)器203和一個(gè)計(jì)算機(jī)204，一個(gè)廢液瓶109，完成對(duì)組織培養(yǎng)物111上活細(xì)胞的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12M3/02GK103074213SQ201210579150
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者貢向輝, 樊瑜波 申請(qǐng)人:北京航空航天大學(xué)