專利名稱：用于擴增土壤線蟲co i基因的簡并引物組合及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及巢式PCR技術(shù)，具體地說，涉及一種用于擴增土壤線蟲CO I基因的簡并引物組合及其應用。
背景技術(shù)：
幾乎在所有類型的生態(tài)系統(tǒng)中，從海洋到淡水、土壤，從熱帶到極地地區(qū)，從海拔最高到海拔最低的區(qū)域都有線蟲的存在。線蟲可以分為自由生活和寄生生活兩大類，自由生活線蟲的取食范圍包括細菌、真菌、藻類、原生動物以及腐殖質(zhì)等，而寄生性線蟲則在動物和植物中均有發(fā)現(xiàn)。土壤線蟲是土壤食物鏈的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在三條土壤的基本能量通路(植物組織、細菌和真菌)中，致病性線蟲參與了植物組織通路，食細菌和食真菌的線蟲參與了細菌和真菌通路，而雜食性的線蟲則涵蓋了所有通路，這使得線蟲越來越多的被應用于土壤生態(tài)系統(tǒng)的指不生物(Yeates. , G. ff. , Bongers, T. , de Goede, R. G. M. , Freckman, D. ff. and Georgieva, S. S. 1993. Feeding habits in soil nematode families and genera—an outline for soil ecologists. Journal of Nematology, 25:315 - 31)。與其他的土壤動物相比，線蟲作為指示生物的優(yōu)勢在于1)數(shù)量大并且種類豐富，原生動物的數(shù)量也很豐富，但是缺乏形態(tài)學特征難以分類鑒定，并且單細胞結(jié)構(gòu)太過簡單；2)生境廣泛，在很多極端環(huán)境都有線蟲的存在；3)容易培養(yǎng)且研究的方法多樣(Andr6, H. M.，Ducarme, X. and Lebrun, P. 2002. Soil biodiversity:myth, reality or conning 0ikos，96(I):3-24)。
線蟲在自然界中數(shù)量眾多且種類豐富，僅生活在海洋中的線蟲種類可能就超過 100萬種，而其中只有大概1000種得到了鑒定和描述。這是因為從形態(tài)學上對線蟲進行分類鑒定存在非常大的困難線蟲個體小且缺乏鑒定的特征，在依賴傳統(tǒng)光學顯微鏡的情況下也難以對鑒定特征進行量化(De Ley，P.，De Ley,1. T.，Morris, K. et al. 2005. An integrated approach to fast and informative morphological vouchering of nematodes for applications in molecular barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Sciences, 360 (1462) : 1945-1958)。為了解決這個問題，越來越多的研究者開始選擇利用保守的分子序列來構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(molecular phylogenetic tree)來石角立分子操作分類單兀(molecular operational taxonomic units, MOTU)o用于分析的基因序列就稱為“DNA條碼(DNA barcode)”，而MOTU就對應著傳統(tǒng)分類學上“種”這個概念(Blaxter, M. L. 2004. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. SeriesB:Biological Sciences, 359(1444) :669-679)。應用MOTU系統(tǒng)可以快速有效地對大多數(shù)物種進行鑒定， 因此有很多線蟲分類學家開始使用DNA條碼的方法對線蟲進行鑒定分類以及演化過程的研究。
目前，利用DNA條碼技術(shù)對線蟲進行分類的研究，相對于線蟲龐大的種類數(shù)目來說還遠遠不夠。在絕大部分線蟲DNA條碼的研究中目前 較為常用的保守序列片段為18S rDNA，但是18S rRNA在建樹過程中多用于分析屬以上的分類單元，在對一些親緣關(guān)系較近的物種來說就會顯得分辨率不夠(Me I dal, B. H. Μ.，Debenham, N. J.，De Ley, P. et al. 2007. An improved molecular phylogeny of the Nematoda with special emphasis on marine taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution, 42 (3) : 622-636)。雖然有些研究者開始嘗試使用另一個常用的位于線粒體的細胞色素C氧化酶亞基I基因(cytochrome oxidase csubunit I, CO I)來對線蟲進行分類(Derycke, S. , Vanaverbeke, J. , Rigaux, A. , Backeljau,T. and Moens,T.2010. Exploring the use of cytochrome oxidase c subunit I (COI) for DNA barcoding of free-living marine nematodes. ^PLoS ONE, 5 (10):el3716),但是這部分研究多集中于海洋線蟲和寄生性線蟲，對于土壤線蟲的分類幾乎沒有。由于海洋線蟲和寄生性線蟲的線粒體基因在線粒體上的排列順序和核酸序列，與自由生活的土壤線蟲差異很大，這些研究所提供的擴增CO I的通用引物并不適合土壤線蟲CO I基因的擴增。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于擴增土壤線蟲CO I基因的簡并引物組合。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于擴增土壤線蟲CO I基因的簡并引物組合，包括:
第一對引物
7C0X1JB-F1:5’-ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3’，
7C0X1JB-R1:5’-AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3’ ；以及
第二對引物
7C0X1JB-F2:5’-GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3’，
7C0X1JB-R2:5’-ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3’ ；
其中，Y代表堿基C或T，W代表堿基A或T，K代表堿基G或T，D代表堿基G、A或T，R代表堿基A或G，M代表堿基A或C，H代表A、T或C，S代表G或C，N代表A、T、C 或G。其中，第一對引物有2*2*2*2*2*3*2*2*3*2*2*3*3=41472種組合形式，第二對引物有 3*3*2*4*2*2*3*3*4*3*4=124416種組合形式。在進行巢式PCR時，第一輪PCR使用的是第一對引物的41472種排列組合的混合物，第二輪PCR使用的是第二對引物的124416種排列組合的混合物。
本發(fā)明還提供含有所述簡并引物組合的用于檢測或進行分類學鑒定土壤線蟲的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、LA Taq DNA聚合酶、PCR反應緩沖液等中的一種或多種。 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
本發(fā)明還提供所述簡并引物組合或所述試劑盒在檢測或進行分類學鑒定土壤線蟲中的應用，包括以下步驟1)提取樣品中的DNA ；2)以步驟I)中提取的DNA為 模板，進行巢式PCR擴增反應；3)分析PCR產(chǎn)物。
巢式PCR擴增反應如下
第一輪PCR 反應體系為 25yL，包括5’ 端引物 7C0X1JB-F1 (10 μ M) 2 μ L，3’ 端引物 7C0X1 JB-Rl (10 μ Μ) 2 μ L，10XLA Taq 緩沖液 2· 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 2. 5 μ L, LA Taq 酶(5U/y L) O. 3μ L，線蟲 DNA2y L，ddH2013. 7 μ L0
第一輪PCR 反應條件為94°C 5min ；94°C 20s, 60°C _50°C(每循環(huán)降低 0. 5°C)20s, 72°C lmin,20 個循環(huán)；94°C 20s, 50°C 20s, 72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C IOmin0
第二輪PCR 反應體系為 50yL，包括5’ 端引物 7C0X1JB-F2 (10 μ M) 4 μ L，3，端引物 7C0X1JB-R2 (10 μ Μ) 4 μ L，10XLA Taq 緩沖液 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 5 μ L, LA Taq 酶 (5U/ μ L) O. 5 μ L，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2 μ L，ddH2029. 5 μ L。
第二輪PCR 反應條件為94°C 5min ;94°C 20s，56°C 20s，72°C lmin，40 個循環(huán)； 72°C IOmin。
具體地，本發(fā)明利用幾種已知的線蟲的CO I基因進行序列比對，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計通用引物，再利用通用引物擴增未知種類土壤線蟲的CO I片段進行驗證。流程如下
I)通用引物設(shè)計
從NCBI網(wǎng)站上下載七種已知線蟲(秀麗小桿線蟲Caenorhabditis briggsae、秀 HI3隱桿線蟲Caenorhabditis eIegans、嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditis bacteriophora、 幾類圓線蟲 Strongyloides stercoralis、小卷蛾斯氏線蟲 Steinernema carpocapsae、 Strelkovimermis spiculatus 和Pristionchuspacificus)的 CO I 基因序列，其基因 ID分別為 5666636、2565700、4421891、37805768、326200256、2846681 和 4078882。利用 Clustal X2軟件對這七條序列進行比對，找出保守的區(qū)域，設(shè)計兩對簡并引物(Seq ID No. 1-4)
第一對引物(擴增長度約為860bp)
7C0XIJB-F 1:5’ -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3，；
7C0X1 JB-Rl: 5，-AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3，。
第二對引物(擴增長度約為695bp)
7C0XIJB-F2:5，-GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3，；
7C0X1JB-R2:5，-ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3，。
其中，Y代表堿基C或T，W代表堿基A或T，K代表堿基G或T，D代表堿基G、A或 T, R代表堿基A或G，M代表堿基A或C，H代表A、T或C，S代表G或C，N代表A、T、C或G。 其中，第一對引物有41472種組合形式，第二對引物有124416種組合形式。在進行巢式PCR 時，第一輪PCR使用的是第一對引物的41472種排列組合的混合物，第二輪PCR使用的是第二對引物的124416種排列組合的混合物。
2) 土壤線蟲的分離
在直徑為12cm的玻璃漏斗末端接一段橡皮管，橡皮管末端用鐵夾夾緊，固定于鐵架臺上，在漏斗內(nèi)加入一定量的去離子水。將200g土壤樣品分別用一層紙巾和一層紗布包裹，放置于漏斗內(nèi)，并補入足量的去離子水使土壤完全浸沒，置于室溫條件下分離。分別在經(jīng)過24`h、48h、72h后,打開鐵夾,放出橡皮管末端內(nèi)2mL左右的水于50mL離心管中。最后一次收集后，8000g離心5min，棄上清，將管底的線蟲懸液轉(zhuǎn)移到1. 5mL離心管中，加入等體積的凍存液(NaC15. 85g,K2HP046. 8g,甘油 300g, lmol/L Na0H5. 6mL,用去離子水定容至 1L, 高溫滅菌后，加入0. lmol/L MgS043mL)，立即放入液氮中急凍，再轉(zhuǎn)入_80°C冰箱保存。
3) 土壤線蟲DNA的提取
使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit (血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒)中的部分試劑。
a.挑取單條線蟲于200yL緩沖液GA中，加入20yL蛋白酶K溶液，混勻，在56°C 消化3ho
b.加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin。
c.加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)，混勻，于12，OOOrpm離心10分鐘。
d.將上層水相吸入一個新的1.5ml EP管中，加入兩倍體積無水乙醇，_20°C沉淀 30mino
e. 12, OOOrpm離心IOmin,棄上清,加入600 μ L漂洗液PW,混勻，于12, OOOrpm離心 IOmin0
f.棄去上層的漂洗液，并在室溫徹底晾干。
g.加入50 μ L去離子水溶解DNA。
4) PCR擴增及測序
利用巢式PCR，分別進行兩輪PCR來擴增目的片段。
第一輪PCR
第一輪PCR 反應體系為 25yL，包括5’ 端引物 7C0X1JB-F1 (10 μ M) 2 μ L，3’ 端引物 7C0X1 JB-Rl (10 μ Μ) 2 μ L，10XLA Taq 緩沖液 2· 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 2. 5 μ L, LA Taq 酶(5U/y L) O. 3μ L，線蟲 DNA2y L，ddH2013. 7 μ L0
PCR 條件94°C 預變性 5min ;94°C 20s,60°C -50 °C (每循環(huán)降低 0. 5 °C ) 20s， 72°C lmin，20 個循環(huán)；94°C 20s, 50°C 20s, 72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
第二輪PCR:
第二輪PCR反應體系為50yL，包括5’端引物7C0X1JB-F2 (10 μ Μ)4 μ L，3’端引物 7C0X1JB-R2 (10 μ Μ) 4 μ L, IOXLA Taq 緩沖液 5 μ L，dNTP (2· 5mM) 5 μ L，LATaq 酶(5U/ μ L) O. 5 μ L，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2 μ L，ddH2029. 5 μ L。
PCR 條件94°C預變性 5min ；94°C 20s，56°C 20s，72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
將第二輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小，并送公司測序，在NCBI上 Blast比對鑒定序列信息。
本發(fā)明通過設(shè)計兩對通用引物，利用巢式PCR法擴增出土壤線蟲的部分CO I基因片段，利用該片段對土壤線蟲進行分類。本發(fā)明提供的用于擴增土壤線蟲CO I基因的簡并引物組合，可用于自由生活的土壤線蟲CO I基因片段的擴增，利用這段序列可以有效地對土壤線蟲進行分類鑒定。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點
(一)簡易性傳統(tǒng)利用光學顯微鏡做土壤線蟲的形態(tài)分類鑒定，對鑒定人的要求很高，沒有大量土壤線蟲形態(tài)鑒定經(jīng)驗的人很難勝任。而利用本發(fā)明的通用引物，只需熟練 PCR操作即可，即使完全沒有線蟲形態(tài)分類鑒定知識的人也可輕松完成。
(二)高效性傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定需要花費大量時間一個個鑒定標本，利用本發(fā)明的通用引物，一次巢式PCR就可以同時完成大量樣品的分類鑒定，大大節(jié)約了鑒定時間。
(三)實用性 與其他利用18SRNA基因設(shè)計引物做線蟲barcoding的方法相比,本發(fā)明選擇了 CO I基因，分辨率更高，可以更有效地對土壤線蟲進行種的區(qū)分，同時填補了土壤線蟲分類鑒定領(lǐng)域的空白。


圖1為本發(fā)明實施例2中利用所述簡并引物組合及巢式PCR法擴增20條線蟲的CO I基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；其中，最左側(cè)泳道為DNA Marker，1 20泳道為1 20號樣品， 21泳道為空白對照。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。所用原料均為市售商品。
實施例1用于擴增土壤線蟲CO I基因的簡并引物組合的設(shè)計
從NCBI網(wǎng)站上下載七種已知線蟲(秀麗小桿線蟲Caenorhabditis briggsae、秀 I 隱桿線蟲 Caenorhabditis elegans、嗜菌異小桿線蟲 Heterorhabdtis bacteriophora、 幾類圓線蟲 Strongyloides stercoralis、小卷蛾斯氏線蟲 Steinernema carpocapsae> Strelkovimermis spiculatus和Pristionchus pacificus)的CO I基因序列，其基因 ID分別為 5666636、2565700、4421891、37805768、326200256、2846681 和 4078882。利用 Clustal X2軟件對這七條序列進行比對，找出保守的區(qū)域，設(shè)計兩對簡并引物(Seq ID No. 1-4)
第一對引物(擴增長度約為860bp)
7C0X1JB-F 1:5’ -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3，；
7C0X1 JB-Rl: 5，-AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3，。
第二對引物(擴增長度約為695bp)
7C0XIJB-F2:5，-GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3，；
7C0X1JB-R2:5，-ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3，。
其中，Y代表堿基C或T，W代表堿基A或T，K代表堿基G或T，D代表堿基G、A 或T，R代表堿基A或G，M代表堿基A或C，H代表A、T或C，S代表G或C，N代表A、T、C 或G。其中，第一對引物有2*2*2*2*2*3*2*2*3*2*2*3*3=41472種組合形式，第二對引物有 3*3* 2*4*2*2*3*3*4*3*4=124416種組合形式。在進行巢式PCR時，第一輪PCR使用的是第一對引物的41472種排列組合的混合物，第二輪PCR使用的是第二對引物的124416種排列組合的混合物。
實施例2 土壤線蟲的分類鑒定
1. 土壤線蟲的分離
土壤樣品來源于河南安陽。在直徑為12cm的玻璃漏斗末端接一段橡皮管，橡皮管末端用鐵夾夾緊，固定于鐵架臺上，在漏斗內(nèi)加入一定量的去離子水。將200g 土壤樣品分別用一層紙巾和一層紗布包裹，放置于漏斗內(nèi)，并補入足量的去離子水使土壤完全浸沒，置于室溫條件下分離。24小時后，打開鐵夾，放出橡皮管末端內(nèi)2mL左右的水，解剖鏡下觀察， 用移液槍隨機吸取20條土壤線蟲，分別放入20個1. 5mL離心管中。
2. 土壤線蟲的DNA提取
使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit (血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒)中的部分試劑。
I)在每個含有線蟲的1. 5mL離心管中加入200 μ L緩沖液GA，加入20 μ L蛋白酶 K溶液，混勻，在56 °C消化3h。
2)加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin。
3)加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)，混勻，于12，OOOrpm離心IOmin0
4)將上層水相吸入一個新的1. 5mL離心管中，加入兩倍體積無水乙醇，_20°C沉淀 30mino
5) 12，OOOrpm離心IOmin,棄上清，加入600 μ L漂洗液PW，混勻，于12，OOOrpm離心 IOmin0
6)棄去上層的漂洗液，并在室溫徹底晾干。
7)加入50 μ L去離子水溶解DNA。
3.巢式PCR擴增目的片段
PCR反應時使用去離子水作為空白對照。
第一輪PCR:
第一輪PCR 反應體系為 25yL，包括5’ 端引物 7C0X1JB-F1 (10 μ M) 2 μ L，3’ 端引物 7C0X1 JB-Rl (10 μ Μ) 2 μ L，10XLA Taq 緩沖液 2· 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 2. 5 μ L, LA Taq 酶(5U/y L) O. 3μ L,線蟲 DNA2y L，ddH2013. 7 μ L0
PCR 條件94°C 預變性 5min ;94°C 20s,60°C -50 °C (每循環(huán)降低 0. 5 °C ) 20s， 72°C lmin，20 個循環(huán)；94°C 20s, 50°C 20s, 72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
第二輪PCR:
第二輪PCR 反應體系為 50yL，包括5’ 端引物 7C0X1JB-F2 (10 μ M) 4 μ L，3，端引物 7C0X1JB-R2 (10 μ Μ) 4 μ L，10XLA Taq 緩沖液 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 5 μ L, LA Taq 酶 (5U/ μ L) O. 5 μ L，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2 μ L，ddH2029. 5 μ L。
PCR 條件94°C預變性 5min ；94°C 20s，56°C 20s，72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
第二輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定片段大小，結(jié)果如圖1所示，全部線蟲樣品均可擴增出條帶，片段大小符合預期。
4. BLAST 檢索結(jié)果
將PCR產(chǎn)物送公司測序，獲得序列后在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對鑒定序列信息。結(jié)果顯示，從土壤中隨機分離出來的20條線蟲，分屬于5種線蟲，包括秀麗隱桿線蟲 Caenorhabditis elegans、與線蟲 Cooperia oncophora 相似度為 90% 的一種線蟲、與線蟲 Stronngyloides mirzai 相似度為 89% 的一種線蟲、與線蟲 Stronngyloides mirzai 相似度為89%的另一種線蟲、與線蟲Ancylostoma caninum相似度為81%的一種線蟲。
以上結(jié)果表明，根據(jù)從土壤中隨機分離出的20條線蟲，利用本發(fā)明的簡并引物組合，采用巢式PCR的方法全部可以擴增出條帶，經(jīng)過序列鑒定可分為5個種，特異性強。即使單條線蟲的DNA樣品，也可實現(xiàn)精準檢測，靈敏度高。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人 員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.用于擴增土壤線蟲COI基因的簡并引物組合，其特征在于，包括第一對引物7C0X1JB-F1:5’ -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3’，7C0X1JB-R1:5’ -AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3’ ；以及第二對引物7C0X1JB-F2:5， -GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3，，7C0X1JB-R2:5’ -ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3’ ；其中，Y代表堿基C或T，W代表堿基A或T，K代表堿基G或T，D代表堿基G、A或T，R 代表堿基A或G，M代表堿基A或C，H代表A、T或C，S代表G或C，N代表A、T、C或G。
2.含有權(quán)利要求1所述簡并引物組合的用于檢測或進行分類學鑒定土壤線蟲的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、LATaq DNA 聚合酶、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述簡并引物組合或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測或進行分類學鑒定土壤線蟲中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟1)提取樣品中的DNA；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行巢式PCR擴增反應；3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應用，其特征在于，第一輪PCR反應體系以25μ L計為10μΜ5，端引物 7C0XlJB-F12yL, 10μΜ3> 端引物 7C0X1JB-R12 μ L，10 X LA Taq 緩沖液2.5 μ L，2. 5mM dNTP2. 5 μ L, 5U/ μ L LA Taq 酶 0· 3 μ L，線蟲 DNA2 μ L, ddH2013. 7 μ L ;第二輪PCR反應體系以50 μ L計為:10μΜ5’端引物7C0X1JB-F24 μ L，10 μ M3’端引物 7C0X1JB-R24 μ L，10 X LA Taq 緩沖液 5 μ L，2. 5mM dNTP5 μ L, 5U/ μ L LA Taq 酶 0· 5 μ L，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2 μ L，ddH2029. 5 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，第一輪PCR反應條件為94°C5min ； 94°C 20s, 60°C -50°C (每循環(huán)降低 O. 5°C) 20s，72°C lmin,20 個循環(huán)；94°C 20s, 50°C 20s, 72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C IOmin0
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，第二輪PCR反應條件為94°C5min ； 94°C 20s, 56°C 20s, 72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于擴增土壤線蟲CO I基因的簡并引物組合，所述引物組合包括7COX1JB-F1和7COX1JB-R1以及7COX1JB-F2和7COX1JB-R2(如Seq ID No.1-4所示)。本發(fā)明利用巢式PCR的方法擴增出土壤線蟲的部分COI基因片段，利用該片段可以有效地對土壤線蟲進行分類鑒定，對操作人員要求不高，只需熟練PCR操作即可，即使完全沒有線蟲形態(tài)分類鑒定知識的人也可輕松完成，且一次巢式PCR就可以同時完成大量樣品的分類鑒定，節(jié)約了鑒定時間，與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明選擇了CO I基因，分辨率更高，可以更有效地對土壤線蟲進行種的區(qū)分，同時填補了土壤線蟲分類鑒定領(lǐng)域的空白。
文檔編號C12Q1/68GK103045589SQ201210571488
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者許崇任, 王戎疆, 李家練, 雷瑩 申請人:北京大學