乙肝e抗原的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乙肝e抗原的純化方法，包括以下步驟：將含有5’端或3’端連接了多聚組氨酸編碼基因的乙肝e抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌本體，得到重組細(xì)菌；加入誘導(dǎo)劑進行重組細(xì)菌培養(yǎng)；將重組細(xì)菌裂解，并將裂解液進行離心；將固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)與離心所得上清液或用高濃度變性劑溶解離心所得沉淀制備的沉淀溶解液在允許多聚組氨酸融合乙肝e抗原結(jié)合或吸附至所述介質(zhì)的條件下接觸；從所述介質(zhì)選擇性洗脫所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原。本發(fā)明利用融合標(biāo)簽技術(shù)與親和層析結(jié)合，操作簡單方便；以多聚組氨酸作為融合標(biāo)簽，對乙肝e抗原的結(jié)構(gòu)無影響。
【專利說明】乙肝e抗原的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種乙肝e抗原的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的乙肝e抗原主要來自感染者的血清，來源困難，每個批次的抗原效價具有差異，作用效果穩(wěn)定性差，生產(chǎn)人員具有一定的操作風(fēng)險，且難以純化。
[0003]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多利用基因工程技術(shù)制備乙肝e抗原的方法，通過構(gòu)建基因工程菌，大量生產(chǎn)乙肝e抗原。然而，這些基因工程技術(shù)生產(chǎn)的乙肝e抗原存在產(chǎn)品效價差，免疫原性低等問題，并且，基因工程菌產(chǎn)物中除了乙肝e抗原，還包括多種雜質(zhì)。
[0004]在乙肝e抗原在達到藥學(xué)或免疫學(xué)上可接受的要求之前需要去除雜質(zhì)，這些雜質(zhì)一般包括基因工程菌其他代謝產(chǎn)物，如蛋白或DNA分子，以及乙肝e抗原的變體或錯誤折疊的形式。這些雜質(zhì)在給藥或免疫過程中可能會引起過敏性反應(yīng)而對產(chǎn)物的安全性產(chǎn)生負(fù)面影響。這些雜質(zhì)在不同的色譜模式可能具有寬泛的停留模式，因此去除較困難，通常需要涉及多個不同的色譜純化的步驟。
[0005]通常的乙肝e抗原純化方法大多基于乙肝e抗原蛋白和雜質(zhì)之間在大小、電荷及溶解性上的差異來進行選擇，主要方法包括親和色譜、離子交換色譜、體積排阻色譜和疏水相互作用色譜等。這些方法存在一定的技術(shù)瓶頸，如離子交換和疏水相互作用色譜等技術(shù)可能在洗脫過程中因為蛋白質(zhì)濃度的增加、緩沖液濃度的變化或PH值的變化造成目標(biāo)產(chǎn)物乙肝e抗原活性的改變。
[0006]另外，在多種情況下，目標(biāo)產(chǎn)物與雜志在等電點上顯示出的差異太小，通過離子交換色譜無法將它們進行分離。體積排阻色譜的操作步驟繁瑣，且存在對目標(biāo)產(chǎn)物嚴(yán)重稀釋的不足，不適合大規(guī)模，高效率的乙肝e抗原生產(chǎn)工藝。親和色譜易發(fā)生滲漏，導(dǎo)致對洗脫目標(biāo)產(chǎn)物的污染。
[0007]近年來出現(xiàn)的融合標(biāo)簽技術(shù)，利用親和純化定向設(shè)計目標(biāo)蛋白，與純化基質(zhì)不發(fā)生任何直接相互作用，避免這種直接的相互作用導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的活性變化?，F(xiàn)有技術(shù)中用GST (Glutathione S_transferase,谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)融合乙肝e抗原,但是GST的相對分子量為26000，對乙肝e抗原的蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，在達到藥學(xué)或免疫學(xué)上應(yīng)用的要求前要將GST標(biāo)簽去除，操作繁瑣，去除GST標(biāo)簽的乙肝e抗原還需重新進行純化去除新的雜質(zhì)。
[0008]開發(fā)減少操作步驟，并且不破壞或降低乙肝e抗原蛋白活性的純化方法成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明旨在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出一種乙肝e抗原的純化方法，包括以下步驟:[0010]將含有重組乙肝e抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌本體，得到重組細(xì)菌，所述重組乙肝e抗原基因包括乙肝e抗原基因和連接于乙肝e抗原基因5’端或3’端的多聚組氨酸編碼基因；
[0011]加入誘導(dǎo)劑進行重組細(xì)菌培養(yǎng)；
[0012]將重組細(xì)菌裂解，并將裂解液進行離心，收集離心所得上清液，將離心所得沉淀用高濃度變性劑溶解制備沉淀溶解液；
[0013]將固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)與上清液或沉淀溶解液在允許多聚組氨酸融合乙肝e抗原結(jié)合或吸附至所述介質(zhì)的條件下接觸；
[0014]從所述介質(zhì)選擇性洗脫所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原。
[0015]優(yōu)選地，在洗脫之前還包括以下步驟:在所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原保持與所述介質(zhì)結(jié)合的條件下清洗所述結(jié)合的介質(zhì)。[0016]優(yōu)選地，所述清洗的步驟包括用至少一種多聚組氨酸融合乙肝e抗原清洗緩沖液清洗所述結(jié)合的介質(zhì)，其中所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原清洗緩沖液包含100至200mmol/L NaCl 和 30 至 IOOmmoI/L Tris, pH 范圍在 6.5-7.5。
[0017]優(yōu)選地，所述細(xì)菌本體選自Escherichia coli, Shigella sonnei,Shige11adysenteriae, Shingella fIexner i, Salmonella typhimurium,Salmonellaenterica,Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Yersinia pestis,或者 Klebsiella pneumoniae。
[0018]優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒由重組乙肝e抗原基因轉(zhuǎn)入原核表達質(zhì)粒形成。
[0019]優(yōu)選地，所述介質(zhì)為載有過渡態(tài)金屬離子的固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)。
[0020]優(yōu)選地，所述過渡態(tài)金屬離子為Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+。
[0021]優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑為IPTG，所述重組細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為3h。
[0022]優(yōu)選地，所述洗脫的步驟包括用至少一種多聚組氨酸融合乙肝e抗原洗脫緩沖液洗脫吸附的多聚組氨酸融合乙肝e抗原，其中，所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原洗脫緩沖液包含 5 至 HOmmoI /I,咪唑或 5 至 20mmol/L EDTA ;和 30 至 10Ommol /T, Tris0
[0023]優(yōu)選地，在選擇性洗脫后還進一步包括以下的一種或多種:羥基磷灰石色譜、陽離子交換色譜、親和色譜、體積排阻色譜、疏水相互作用色譜、滲濾或超濾。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于，利用融合標(biāo)簽技術(shù)與親和層析結(jié)合，操作簡單方便；以多聚組氨酸作為融合標(biāo)簽，對乙肝e抗原的結(jié)構(gòu)無影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明的乙肝e抗原的純化方法的實現(xiàn)流程圖。
[0026]圖2是本發(fā)明的乙肝e抗原的純化方法的一個優(yōu)選方案的實現(xiàn)流程圖。
【具體實施方式】
[0027]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本申請的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請實施例中的附圖，對本申請實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。
[0028]本發(fā)明利用融合標(biāo)簽技術(shù)，將乙肝e抗原基因的5’端或3’端融合多聚組氨酸編碼基因，形成乙肝e抗原重組DNA，再通過細(xì)菌宿主來表達重組乙肝e抗原，表達的重組乙肝e抗原的5’端或3’端有多聚組氨酸(His標(biāo)簽)，利用His標(biāo)簽與固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)結(jié)合的親和色譜模式對乙肝e抗原進行純化，如圖1所示，具體步驟如下:
[0029]首先，將含有5’端或3’端連接了多聚組氨酸編碼基因的乙肝e抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌本體,得到重組細(xì)菌。
[0030]本發(fā)明的技術(shù)方案中選擇多聚組氨酸作為融合標(biāo)簽，多聚組氨酸由6-10個連續(xù)組氨酸組成，分子量較小，將其置于乙肝e抗原的氨基或羧基末端，不會影響乙肝e抗原的蛋白結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一個實施例中多聚組氨酸融合標(biāo)簽優(yōu)選為六聚組氨酸。
[0031]本發(fā)明將5’端或3’端連接了多聚組氨酸編碼基因的乙肝e抗原基因(乙肝e抗原重組DNA)進行原核表達，所述重組質(zhì)粒由乙肝e抗原重組DNA轉(zhuǎn)入原核表達質(zhì)粒形成。在本發(fā)明的一個實施例中原核表達質(zhì)粒選用PET質(zhì)粒，優(yōu)選為pET-28a-c ( + )質(zhì)粒。
[0032]所述細(xì)菌本體選自Escherichia coli, Shigella sonnei, Shigelladysenteriae,Shingella flexneri, Salmonella typhimurium, Salmonellaenterica, Enterobacteraerogenes, Serratia marcescens, Yersinia pestis,或者 Klebsiella pneumoniae。在本發(fā)明的一個實施例中優(yōu)選Escherichiacoli作為細(xì)菌本體。
[0033]接著，加入誘導(dǎo)劑進行重組細(xì)菌培養(yǎng)。為了增加重組DNA的表達量，在重組細(xì)菌培養(yǎng)時可加入誘導(dǎo)劑，在本發(fā)明的一個實施例中選用Escherichiacoli作為細(xì)菌本體，pET-28a-c ( + )質(zhì)粒作為原核表達質(zhì)粒，因此選擇乳糖操縱子誘導(dǎo)劑，如別乳糖、半乳糖或IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)，優(yōu)選為IPTG，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.6mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37°C。
[0034]接著，將重組細(xì)菌裂解，并將裂解液進行離心。重組細(xì)菌的裂解可以采用物理或化學(xué)方式，如進行超聲波裂解或加入裂解液使重組細(xì)菌裂解。
[0035]在本發(fā)明的一個實施例中采用超聲波處理重組細(xì)胞，使重組細(xì)胞裂解。在本發(fā)明的另一個實施例中，采用如下配方的裂解液對重組細(xì)菌進行處理:含有l(wèi)mg/mL溶菌酶、
0.2% 脫氧膽酸鈉、lmmol/L PMSF 和 50mmol/LTris-HCl。
[0036]重組細(xì)菌裂解后，氨基端或羧基端連接有多聚組氨酸的重組乙肝e抗原從細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)釋放出來。原核表達過程中，正確折疊的乙肝e抗原具有蛋白活性，為可溶性蛋白，一部分乙肝e抗原會發(fā)生錯誤折疊，不具有蛋白活性，并且會發(fā)生聚集，成為包涵體，包涵體是錯誤折疊的乙肝e抗原聚集形成的，是一種不溶性的物質(zhì)，當(dāng)對裂解液進行離心時，可溶性的正確折疊抗原不會被沉淀而存在于上清液中，錯誤折疊的抗原發(fā)生聚集，以不溶的包涵體形式存在于沉淀中。
[0037]離心所得上清液中含有正確折疊的乙肝e抗原，可直接進行純化。離心所得沉淀中含有錯誤折疊的乙肝e抗原形成的包涵體，將所述沉淀用高濃度變性劑溶解，高濃度的變性劑可以溶解包涵體，所述變性劑可選用任何可使包涵體溶解的蛋白變性劑，如尿素或胍。在本實施例中優(yōu)選為尿素溶液，所述尿素溶液濃度優(yōu)選為l_8mol/L (pH=8.0)。
[0038]然后，將固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)與上清液或沉淀溶解液在允許多聚組氨酸融合乙肝e抗原結(jié)合或吸附至所述介質(zhì)的條件下接觸。
[0039]固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)中載有過渡態(tài)金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+，過渡態(tài)金屬離子能夠與多聚組氨酸的氮原子以配位鍵結(jié)合，本實施例中使用的介質(zhì)的金屬離子優(yōu)選為Ni2+或Co2+。[0040]將所述過渡態(tài)金屬離子固定于所述親和介質(zhì)中。所述親和層析介質(zhì)可以采用瓊脂糖凝膠；以及纖維素、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚羥乙基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚丙烯環(huán)氧烷、樹脂及上述物質(zhì)的衍生物或共聚物；及多孔玻璃珠、大孔硅膠、磷灰石等無機材料；或親和層析色譜也是常用的技術(shù)手段，如色譜柱、擴張柱床(膨脹床)等。
[0041]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中選用固定Ni2+或Co2+螯合親和層析色譜柱，如鎳離子金屬螯合親和層析柱(N1-ΝΤΑ層析柱)。
[0042]在離心所得上清液與固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)接觸的過程中，上清液中的乙肝e抗原被吸附于所述介質(zhì)上。在用高濃度變性劑溶解離心所得沉淀制備的沉淀溶解液與固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)接觸的過程中，沉淀溶解液中的乙肝e抗原被吸附于所述介質(zhì)上，同時變性劑被除去，發(fā)生變性的乙肝e抗原可以逐步折疊復(fù)性，因此，在包涵體的純化過程中，同時實現(xiàn)了乙肝e抗原的復(fù)性。
[0043]最后，從所述介質(zhì)選擇性洗脫所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原。
[0044]所述洗脫的步驟包括用至少一種多聚組氨酸融合乙肝e抗原洗脫緩沖液洗脫吸附的多聚組氨酸融合乙肝e抗原，其中，所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原洗脫緩沖液包含約5 至 HOmmoI /I,咪唑或約 5 至 20mmol/L EDTA ;和約 30 至約 10Ommol /T, Tris0
[0045]在本實施例的一個優(yōu)選方案中，在洗脫之前還包括以下步驟(圖2所示):在所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原保持與所述介質(zhì)結(jié)合的條件下清洗所述結(jié)合的介質(zhì)。
[0046]將與乙肝e抗原一起吸附于所述介質(zhì)上的其他污染物(其他蛋白或DNA)去除，可以使用平衡溶液對所述介質(zhì)進行平衡，所述平衡溶液包括約10至約200mmol/L NaCl和約30至約100mmol/L Tris，pH范圍在6.5-7.5。例如，在本發(fā)明的一個實施例中，所述平衡溶液(多聚組氨酸融合乙肝e抗原清洗緩沖液)包含約100至約200mmol/L NaCl和約30至約100mmol/L Tris, pH 范圍在約 7。
[0047]本發(fā)明的純化方法還可以與至少一種其他的純化方法組合使用，如與羥基磷灰石色譜、陽離子交換色譜、親和色譜、體積排阻色譜、疏水相互作用色譜、滲濾或超濾中的一種或幾種組合。
[0048]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0049]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0050]溶液配制
[0051]緩沖液A:50mmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 8.0 ；
[0052]緩沖液B:用緩沖液A配制濃度為5mmol/L的咪唑溶液；
[0053]緩沖液C:用緩沖液A配成50mmol/L的咪唑溶液，pH 8.0 ；
[0054]緩沖液D:用緩沖液A配成80mmol/L咪唑溶液，pH8.0 ；
[0055]變性液1:緩沖液A配成lmol/L尿素溶液，pH 8.0 ；
[0056]變性液2:緩沖液A配成8mol/L尿素溶液，pH 8.0 ；
[0057]清洗液I: 10mmol/T, NaCl 和 30mmol/L Tris ；
[0058]清洗液2: 100mmol/L NaCl 和 SOmmoI/T, Tris0 [0059]實施例1
[0060]乙肝e抗原(HBeAg)基因目的序列的獲取
[0061]以實驗室保存的含HbeAg基因的pADR-Ι質(zhì)粒為模板，以含有XmaI酶切位點的SEQID N0.1為上游引物，以含有Not I酶切位點的SEQ IDN0.2為下游引物進行PCR擴增，得到HBeAg基因。擴增產(chǎn)物回收純化后在HBeAg基因的3’端引入六聚組氨酸編碼基因形成重組HBeAg基因，將重組HBeAg基因經(jīng)Xma I和Not I雙酶切，插入同樣經(jīng)雙酶切的pET-28a_c(+ )中，得到含有重組HBeAg基因的重組質(zhì)粒pET-28a-c ( + )_HBeAg。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿囷中保存。
[0062]重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
[0063]對重組細(xì)菌進行搖菌培養(yǎng)，使用IPTG誘導(dǎo)重組HbeAg抗原的表達，IPTG的最適誘導(dǎo)濃度為0.6mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37°C，在上述條件下誘導(dǎo)3h，收集重組細(xì)菌沉淀，超聲裂解重組細(xì)菌，將裂解液置于4°C，1000Orpm下離心15min，分別收集裂解液離心后的上清液和沉淀。
[0064]可溶件重纟目Hbe Ag杭原鈍化
[0065]1、將N1-NTA樹脂裝入合適的層析柱，用10倍N1-NTA層析柱體積的緩沖液A清洗樹脂；
[0066]2、把離心所得上清液加到N1-NTA層析柱中，流速控制在15ml/h，收集漏過部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況；
[0067]3、用5倍柱體積的緩沖液B對N1-NTA層析柱進行洗脫，pH 8.0，流速控制在30ml/h，收集洗脫液；用1.5倍N1-NTA層析柱體積的緩沖液C對N1-NTA層析柱進行連續(xù)兩次洗脫，流速控制在15ml/h，收集洗脫液；再用1.5倍N1-NTA層析柱體積緩沖液D對N1-NTA層析柱進行連續(xù)三次洗脫，收集洗脫液；
[0068]4、用SDS/PAGE確定重組HbeAg抗原在洗脫液中的分布情況。
[0069]結(jié)果顯示，重組HbeAg抗原純度較高。
[0070]不溶性重組HbeAg抗原包涵體的復(fù)性純化
[0071]用變性液I洗滌離心所得沉淀兩次；再用變性液2對重懸沉淀，室溫下作用lh，后于15000rpm，4°C下離心30min，收集上清液用于重組HbeAg抗原包涵體的純化。
[0072]以下步驟與上述可溶性重組HbeAg抗原純化的步驟相同。
[0073]結(jié)果顯示，洗脫液中含有復(fù)性的重組HbeAg抗原。
[0074]實施例2
[0075]乙肝e抗原(HBeAg)基因目的序列的獲取
[0076]以實驗室保存的含HbeAg基因的pADR-Ι質(zhì)粒為模板，以含有XmaI酶切位點的SEQID N0.1為上游引物，以含有Not I酶切位點的SEQ IDN0.2為下游引物進行PCR擴增，得到HBeAg基因。擴增產(chǎn)物回收純化后在HBeAg基因的5’端引入六聚組氨酸編碼基因形成重組HBeAg基因，將重組HBeAg基因經(jīng)Xma I和Not I雙酶切，插入同樣經(jīng)雙酶切的pET-28a_c(+ )中，得到含有重組HBeAg基因的重組質(zhì)粒pET-28a-c ( + )_HBeAg。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿囷中保存。
[0077]重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
[0078]對重組細(xì)菌進行搖菌培養(yǎng)，使用IPTG誘導(dǎo)重組HbeAg抗原的表達，IPTG的最適誘導(dǎo)濃度為0.6mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37°C，在上述條件下誘導(dǎo)3h，收集重組細(xì)菌沉淀，用配方為lmg/mL溶菌酶、0.2%脫氧膽酸鈉、lmmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl的裂解液處理重組細(xì)菌沉淀得到裂解液，將裂解 液置于4V，1000Orpm下離心15min，分別收集裂解液離心后的上清液和沉淀。
[0079]可溶件重纟目HbeAg杭原鈍化
[0080]1、將N1-NTA樹脂裝入合適的層析柱，用10倍N1-NTA層析柱體積的緩沖液A清洗樹脂；
[0081]2、把離心所得上清液加到N1-NTA層析柱中，流速控制在15ml/h，收集漏過部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況；
[0082]3、用1.5倍N1-NTA層析柱體積的清洗液I對對N1-NTA層析柱進行連續(xù)兩次清洗；再用1.5倍N1-NTA層析柱體積的清洗液2對N1-NTA層析柱進行連續(xù)三次清洗；
[0083]4、用5倍柱體積的緩沖液B對N1-NTA層析柱進行洗脫，pH 8.0，流速控制在30ml/h，收集洗脫液；用1.5倍N1-NTA層析柱體積的緩沖液C對N1-NTA層析柱進行連續(xù)兩次洗脫，流速控制在15ml/h，收集洗脫液；再用1.5倍N1-NTA層析柱體積緩沖液D對N1-NTA層析柱進行連續(xù)三次洗脫，收集洗脫液；
[0084]5、用SDS/PAGE確定重組HbeAg抗原在洗脫液中的分布情況。
[0085]結(jié)果顯示，重組HbeAg抗原純度略高于實施例1中此步驟所得重組HbeAg抗原的純度。
[0086]不溶性重組HbeAg抗原包涵體的復(fù)性純化
[0087]用變性液I洗滌離心所得沉淀兩次；再用變性液2對重懸沉淀，室溫下作用lh，后于15000rpm，4°C下離心30min，收集上清液用于重組HbeAg抗原包涵體的純化。
[0088]以下步驟與上述可溶性重組HbeAg抗原純化的步驟相同。
[0089]結(jié)果顯示，洗脫液中含有復(fù)性的重組HbeAg抗原。
[0090]雖然本發(fā)明參照當(dāng)前的較佳實施方式進行了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解，上述較佳實施方式僅用來 說明本發(fā)明，并非用來限定本發(fā)明的保護范圍，任何在本發(fā)明的精神和原則范圍之內(nèi)，所做的任何修飾、等效替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種乙肝e抗原的純化方法，其特征在于，包括以下步驟: 將含有重組乙肝e抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌本體，得到重組細(xì)菌，所述重組乙肝e抗原基因包括乙肝e抗原基因和連接于乙肝e抗原基因5’端或3’端的多聚組氨酸編碼基因； 加入誘導(dǎo)劑進行重組細(xì)菌培養(yǎng)； 將重組細(xì)菌裂解，并將裂解液進行離心，收集離心所得上清液，將離心所得沉淀用高濃度變性劑溶解制備沉淀溶解液； 將固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)與上清液或沉淀溶解液在允許多聚組氨酸融合乙肝e抗原結(jié)合或吸附至所述介質(zhì)的條件下接觸； 從所述介質(zhì)選擇性洗脫所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，在洗脫之前還包括以下步驟:在所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原保持與所述介質(zhì)結(jié)合的條件下清洗所述結(jié)合的介質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，所述清洗的步驟包括用至少一種多聚組氨酸融合乙肝e抗原清洗緩沖液清洗所述結(jié)合的介質(zhì)，其中所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原清洗緩沖液包含100至200mmol/L NaCl和30至100mmol/L Tris，pH范圍在6.5-7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化方法，其特征在于，所述細(xì)菌本體選自Escherichia coli, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, ShingellafIexneri,Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Enterobacteraerogenes, Serratiamarcescens, Yersinia pestis,或者 Kleb siellapneumoniae。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒由重組乙肝e抗原基因轉(zhuǎn)入原核表達質(zhì)粒形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化方法，其特征在于，所述介質(zhì)為載有過渡態(tài)金屬離子的固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化方法，其特征在于，所述過渡態(tài)金屬離子為Cu2+、Zn2+、Ni2+ 或 Co2+。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)劑為IPTG，所述重組細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為3h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化方法，其特征在于，所述洗脫的步驟包括用至少一種多聚組氨酸融合乙肝e抗原洗脫緩沖液洗脫吸附的多聚組氨酸融合乙肝e抗原，其中，所述多聚組氨酸融合乙肝e抗原洗脫緩沖液包含5至80mmol/L咪唑或5至20mmol/L EDTA ;和 30 至 IOOmmoI/LTris ο
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的純化方法，其特征在于，在選擇性洗脫后還進一步包括以下的一種或多種:羥基磷灰石色譜、陽離子交換色譜、親和色譜、體積排阻色譜、疏水相互作用色譜、滲濾或超濾。
【文檔編號】C12N15/51GK103882042SQ201210566412
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】萬曉春, 田永帥 申請人:深圳先進技術(shù)研究院