專利名稱：一種調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的wrky轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物衰老是植物個(gè)體內(nèi)部一系列程序化的漸行性衰退，最終走向死亡的過程。葉片衰老是植物生長發(fā)育的組成部分，構(gòu)成了植物葉片發(fā)育的最后一個(gè)階段，被認(rèn)為是程序 性細(xì)胞死亡(PCD)的一種，以依賴葉齡的方式進(jìn)行，并由諸多環(huán)境因素誘導(dǎo)，受生長發(fā)育時(shí)期復(fù)雜的內(nèi)、外因素的相互作用影響。因此葉片衰老并不是被動的過程，而是一個(gè)主動調(diào)控的過程。葉片衰老過程中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理代謝、基因表達(dá)方面都經(jīng)歷一系列有序的變化。另外，由于葉片衰老過程中涉及營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用，對整個(gè)植株來說，葉片衰老是植物健康生長，繁育優(yōu)良后代的關(guān)鍵(Buchanan-Wollaston V等，Plant Biotechnol J,1(1):3-12,2003 ；Lim PO 和 Nam HG 等，Curr Top Dev Biol, 67:49-83，2005)。植物激素對植物發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境具有極其重要的作用。在眾多植物激素中，細(xì)胞分裂素(CK)對植物葉片衰老的延緩以及乙烯(ET)對葉片衰老的促進(jìn)作用是十分明確的，而且在不同物種中都得到了相對一致的結(jié)果。其它相關(guān)激素，如脫落酸(ABA)，赤霉素(GA)，茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)等都對葉片的衰老起到不同程度的促進(jìn)作用，但是對于它們的作用機(jī)理，特別是他們復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，仍知之甚少。茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)主要是參與植物防御反應(yīng)的激素，但是其在葉片衰老過程中也有一定的作用。對離體葉片外施JA可以加速其衰老進(jìn)程，但是在影響JA合成的突變體中并沒有觀察到葉片衰老延緩的現(xiàn)象，其中12%的葉片衰老相關(guān)基因并沒有發(fā)生變化(Xie DX 等，Science, 280:1091-1094,1998 ；Buchanan-ffolIaston V 等，PlantJournal, 42 :567_585，2005)。在葉片衰老過程中，植物體內(nèi)的SA含量急劇的上升，但在未衰老葉片中并不存在這樣的現(xiàn)象。此后，Morris等通過對'轉(zhuǎn)基因材料,及相關(guān)突變體pad4和的分析,發(fā)現(xiàn)這些突變體中衰老標(biāo)志基因SAGs表達(dá)有所改變(Morris K等，Plant Journal, 23 :677_685，2000)。SA對衰老的作用可能是影響了葉片衰老進(jìn)程中從衰老向細(xì)胞死亡變化的進(jìn)程。WRKY轉(zhuǎn)錄因子因其N端含有由WRKYGQK組成的高度保守的氨基酸序列而得名。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了 74個(gè)WRKY成員，而水稻中則含有105個(gè)完整的WRKY成員。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY結(jié)構(gòu)域及其專一結(jié)合的(T) (T)TGAC (C/T)序列(又稱W-box)更多地存在于與抗病、損傷、衰老相關(guān)基因和水楊酸誘導(dǎo)基因的上游調(diào)控區(qū)域。已有大量證據(jù)表明，WRKY與上述幾種生物和非生物逆境激發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切(Eulgem T等，EMBO J，18 =4689-4699,1999 ；Chen C等，Plant Physiol，129 :706_716，2002)。此外，在果實(shí)成熟、種子表皮毛發(fā)育、蔗糖信號傳導(dǎo)及赤霉素信號傳導(dǎo)等過程中均發(fā)現(xiàn)了 WRKY基因的表達(dá)(Johnson CS等，PlantCell, 14 :1359-1375,2002 ；Sun C 等，Plant Cell，15 :2076_2092，2003)。
Dong等研究了 72個(gè)擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病方面的作用，發(fā)現(xiàn)其中的49個(gè)受到病原菌syringae pv tomato (Α )和SA的誘導(dǎo)而產(chǎn)生表達(dá)變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來參與擬南芥的抗病過程。作為調(diào)控系統(tǒng)獲得性抗性SAR的關(guān)鍵基因 (Cao WH 等，Plant Physiol，143 :707_719，2007)和/^7 等，其啟動子中都含有W-box (Rushton PJ 等，Plant Mol Biol, 29:691-702,1995)。通常 NPRl 在植物中的表達(dá)水平很低，但用病原體感染或外施SA后，其表達(dá)量增加2-3倍(Cao WH等，Plant Physiol,143 :707-719,2007),同時(shí)抗多種病原體的能力顯著增加。DNA序列分析表明，似況7啟動子中28個(gè)核苷酸的序列內(nèi)含有3個(gè)W-box。這些W-box是WRKY蛋白結(jié)合所必需的，如果其中的某個(gè)核苷酸被替換，WRKY蛋白就不再與之結(jié)合，其SA誘導(dǎo)的表達(dá)即完全消除，此時(shí)，植物對病原體的反應(yīng)變得非常敏感。另有研究發(fā)現(xiàn)，WRKY18、WRKY59、WRKY70等8個(gè)基因是NPRl的直接目標(biāo)，參與了植物的SAR過程，顯示了 WRKY參與SAR的機(jī)理的復(fù)雜性(Wang D等，Science，308 :1036-1040，2005 ；ffang D 等，Plos Pathogens,2 :1042_1050，2006)。PRl基因啟動子驅(qū)動的^浴基因表達(dá)分析及Northern印跡分析都表明，其受到WRKY6的激活，且在防衛(wèi)反應(yīng)誘導(dǎo)條件下這種激活更快、更強(qiáng)(Robatzek S等，Genes Dev, 16 :1139-1149, 2002)。WRKY在信號交叉和對話中也有重要作用。Li等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtWRKY70受SA的誘導(dǎo)，而JA和乙烯則沒有誘導(dǎo)作用；相反，用JA處理葉片后，AtffRKY70不表達(dá)而AtCORl則被大量誘導(dǎo)；同樣，在^轉(zhuǎn)基因植株中，SA的合成及其對WRKY的誘導(dǎo)作用消失；在過表達(dá)AtWRKY70的植株中，與SAR相關(guān)的基因和PR-5高水平表達(dá)，植株的抗病性提高，而JA誘導(dǎo)的AOMV基因則被抑制，但體內(nèi)SA、JA和乙烯的含量卻沒有明顯的變化(Li J等，Plant Cell,16 :319-331,2004 ; Abuqamar S 等，Plant Journal,48 :28-44,2006)。在擬南芥中，除AtWRKY70外，AtffRKY25和AtWRKY33可能也是平衡植物SA、JA防衛(wèi)信號途徑的一個(gè)重要決定因子(Li J 等，Plant Cell, 16 :319-331,2004 ；Zheng XL 等，Plant CellReports, 26 :1195-1203, 2007)。此外在葉片衰老方面，參與植物抗病的WRKY因子的部分成員也參與了這個(gè)生理過程，說明WRKY家族的功能具有多元化的特征。Murray等(MurraySL等，MPMI，20 :1431-1438,2007)研究表明，AtWRKY53是一個(gè)抗病性相關(guān)的重要調(diào)控因子，其功能缺失突變體更易受到的感染，反而對青枯菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受力(Hu J等，PloS ONE, 3 :e2589，2008)，但是也有證據(jù)表明AtWRKY53是一個(gè)葉片衰老早期階段表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(Hinderhofer K 等，Planta，213 :469_473，2001 ；Miao Y 等，Plant Mol Biol, 55 853-867,2004)。目前對AtWRKY6的研究較少，主要停留在現(xiàn)象觀測階段；對于WRKY家族調(diào)控植物葉片衰老和多重抗逆性的研究也為數(shù)不多，特別是對其調(diào)控的遺傳和分子機(jī)制還幾乎一無所知。借助擬南芥模式體系，挖掘WRKY家族中調(diào)控植物葉片衰老和多重抗逆性的重要基因資源，對于作物的遺傳改良上具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與應(yīng)用。本發(fā)明提供的能夠調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，記為WRKY6蛋白，來源于擬南芥、油菜等物種(圖2),但不局限于這些物種,包括與擬南芥ClraAiiZoASi1S)中AtWRKY6 (NCBI基因登錄號為AT1G62300，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的同源性高于30%的類似蛋白。本發(fā)明所提供的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白，是SEQ ID NO: 2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子WRKY6的編碼基因，是下列核苷酸之一
(1)SEQ ID NO: I 所示的 DNA 序列；
(2)編碼SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO: I所示的DNA序列由1990個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第125位至1786位堿基；SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列由553個(gè)氨基酸殘基組成。 本發(fā)明還包括所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還包括含有所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6表達(dá)載體的細(xì)胞系。本發(fā)明還包括所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白的應(yīng)用，包括將含有所述的WRKY蛋白的編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻、小麥、棉花或玉米等作物，以過表達(dá)該蛋白從而促進(jìn)發(fā)育并增強(qiáng)多重抗逆性。還包括通過抑制WRKY6編碼基因的表達(dá)以延緩衰老增加產(chǎn)量潛力，或增強(qiáng)其表達(dá)以提高作物的多重抗逆性。轉(zhuǎn)有本發(fā)明蛋白的編碼基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的蛋白在延緩葉片衰老、提高作物產(chǎn)量及多重抗逆性方面有重要作用。


圖I為AtWRKY6和其它擬南芥WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)生樹。圖2為植物WRKY6的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖3為長日照生長30天野生型擬南芥、AtWRKY6突變體材料和水楊酸合成關(guān)鍵酶基因ICSl的突變體sid2-2在SA處理后的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY6插入突變體材料的獲得。I. I擬南芥材料準(zhǔn)備
取在16h L/8h D光照，23°C條件下培養(yǎng)30天擬南芥Col-O的葉片。1.2 RNA 提取
取擬南芥材料約O. lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到I. 5ml離心管，加Iml TRIzol (invitrogen公司),混勻后,室溫放置15分鐘,加O. 2ml氯仿:異戍醇(24:1),劇烈搖動15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng)O. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備用。I. 3 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR。采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2Pg制備的總RNA，0. 5μ1 Rnaseinhibitor,加 DEPC 處理過的去離子水至 8· 5μ1, 2μ1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C, 5min,室溫放置 IOmin, 13000rpm 簡短離心 5s。再依次加入 4μ1 5 XFirst-Strand buffer,O. 5M-1 RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-I dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄I小時(shí)，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于-20°C待用。I. 4 AtffRKY6插入突變體材料的鑒定
根據(jù) TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 AtWRKY6 全長 CDS 序列及插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了 三條引物 AtWRKY6-LB (5’ TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 3’)、AtffRKY6-LP (5’GAACGTATTAGCCAATCACGC 3’ )和 AtWRKY6_RP : (5，TGTGGACGTGTCATAATTTGG 3’ )作為 PCR反應(yīng)的引物。PCR反應(yīng)體系為50μ1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，55°C復(fù)性40s，72°C延伸70s，循環(huán)35次，72°C充分延伸5min。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，得到純合突變體材料。實(shí)施例2 :擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY6功能分析。 2. I序列比較分析
用Genedoc軟件分析了 AtWRKY6與其他擬南芥WRKY家族蛋白的同源性。分析結(jié)果表明AtWRKY6具有典型保守的WRKY domain(圖I)。使用MEGA軟件建立了 AtWRKY6同其它擬南芥WRKY家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明AtWRKY6屬于WRKY-IIa亞家族，與AtWRKY31、AtffRKY42和AtWRKY47親緣關(guān)系最近。在水稻、玉米、油菜、大豆等植物中也存在與AtWRKY6同源性較高的蛋白。圖2展示植物中WRKY6蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。2. 2.突變體葉片衰老指標(biāo)分析
2.2. I擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
基質(zhì)組分蛭石黑土 珍珠巖9 : 3 : 0. 5 營養(yǎng)液組分
權(quán)利要求
1.一種植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白，來源于擬南芥、油菜物種，包括與擬南芥中AtWRKY6的同源性聞于30%的類似蛋白；是SEQ ID NO: 2所不氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì),或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。
2.一種擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY6編碼基因，其特征在于，是下列核苷酸之一 (1)SEQ ID NO: I 所示的 DNA 序列； (2)編碼SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY6的編碼基因，其特征在于該基因的編碼框?yàn)樽?’端第125位到第1786位的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求I所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求4所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6表達(dá)載體的細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求I所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白的應(yīng)用，其特征在于，將含有權(quán)利要求I的WRKY6蛋白的編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻、小麥、棉花或玉米作物，以過表達(dá)該蛋白從而促進(jìn)發(fā)育并增強(qiáng)多重抗逆性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白的應(yīng)用，其特征在于，通過抑制WRKY6編碼基因的表達(dá)以延緩葉片衰老增加產(chǎn)量潛力，或增強(qiáng)其表達(dá)以提高作物的多重抗逆性。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的植物WRKY6蛋白，來源于擬南芥、油菜等物種，但不局限于這些物種，包括與擬南芥中AtWRKY6(氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的同源性高于30%的類似蛋白。擬南芥WRKY6蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQIDNO:1；(2)編碼序列表中SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明可為延緩葉片衰老、提高作物產(chǎn)量品質(zhì)及多重抗逆性方面提供了蛋白資源和方法。
文檔編號C12N15/29GK102964440SQ20121056510
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者蒯本科, 高炯, 朱政, 梁寧菁 申請人:復(fù)旦大學(xué)