專利名稱：一種玉米油份含量相關(guān)基因的分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米油份含量相關(guān)的基因的分子標(biāo)記的應(yīng)用，屬于玉米育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高油玉米的籽粒油份含量超過6%，高油玉米不僅是人類健康食品與優(yōu)質(zhì)動物飼料，而且還是重要的工業(yè)原料。玉米油富含較多的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，對人體健康具有重要作用，因此又稱為健康油。同時利用高油玉米籽粒作為飼料可以顯著提高牲畜的產(chǎn)肉率。而且高油玉米秸桿富含粗蛋白和其他營養(yǎng)成分，也是食草動物良好的青貯飼料。玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式存在。其基本過程乙酰輔酶A經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰單酰輔酶A.這是脂 肪酸合成的第一關(guān)鍵步驟，也是調(diào)控整個脂肪酸合成的限速步驟。然后脂肪酸合成酶(FAS)以丙二酰單酰輔酶A為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)增加2個碳鏈的頻率合成酰基碳鏈。而不斷增加的?；兼溣峙c?；d體蛋白(ACP)結(jié)合，ACP負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸合成途徑中的中間產(chǎn)物。經(jīng)過數(shù)次聚合反應(yīng)后，脂肪酸的合成在?；?ACP硫酯酶或?；D(zhuǎn)移酶的作用下終止。終止聚合反應(yīng)后，不同碳鏈長度的?；鵄CP，在?；o酶A合成酶的作用下生成?；o酶A，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中。最后利用儲存在胞質(zhì)中的?；o酶A，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過3種不同的酰基轉(zhuǎn)移酶(甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶GPAT、溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶LPAAT、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT)。在甘油上附連脂肪酸以合成三酰甘油，并儲存在不連續(xù)分布的亞細(xì)胞器油體中。另外，脂肪酸合成后經(jīng)過不同的修飾方式合成長鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸。近年來，隨著大量植物全基因組測序的完成，植物基因組學(xué)的研究已經(jīng)呈現(xiàn)出由簡單質(zhì)量性狀向復(fù)雜的數(shù)量性狀轉(zhuǎn)移的趨勢，特別是大量SNP標(biāo)記的開發(fā)以及生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析方法發(fā)掘植物數(shù)量性狀基因已成為目前國際植物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。關(guān)聯(lián)分析(Association Analysis),又稱連鎖不平衡作圖(LDMapping)或關(guān)聯(lián)作圖(Association Mapping),是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法(Flint-Garcia et al，2003)。跟連鎖分析相比，關(guān)聯(lián)分析具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)連鎖分析需要構(gòu)建基于兩親本雜交的Fl衍生群體(F2、BC、RIL等)，關(guān)聯(lián)分析可用現(xiàn)有的群體，大大縮短研究年限；(2)連鎖分析每次只能分析同一位點(diǎn)的2個等位基因，關(guān)聯(lián)分析可以同時分析同一位點(diǎn)的多個等位基因；(3)連鎖分析所用的群體小，加上群體來自兩親本，在群體內(nèi)發(fā)生的重組次數(shù)少，這樣往往導(dǎo)致連鎖作圖的精度低，例如玉米的作圖精度一般為10 30cM(Salvi，2005 ;Flint_Garcia，2005，而關(guān)聯(lián)分析的精度可大大提高，例如玉米自交系的精度為1500bp，達(dá)到單基因水平(Remington，2001)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成(所述的群體材料，均為常見的玉米市售材料，可通過常規(guī)商業(yè)渠道購買得到)。候選基因重測序材料155份我國骨干自交系材料。從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508群體為材料,利用IlluminaMaizeSNP50 BeadChip對56，110個位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機(jī)選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高質(zhì)量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進(jìn)行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個群體 的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(diǎn)(建議水平顯著性閾值為1/N =I. 78X IO-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94X10^)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計(jì)算同一染色體上的顯著性信號位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號中。玉米編碼?；d體蛋白(ACP)基因(GRMZM2G110298)的位于玉米第一條染色體上，利用368份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于玉米參考基因組chrl. S_248149904的SNP位點(diǎn)與玉米油分含量顯著關(guān)聯(lián)，解釋了 6. 58%的表型變異，該位點(diǎn)突變?yōu)門/C，其中T為主要等位基因，C為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 05，該SNP位點(diǎn)與玉米編碼酰基載體蛋白(ACP)基因(GRMZM2G110298)緊密連鎖。玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得，利用Primer Premier 5和Primer3設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進(jìn)行多序列處理和比對，利用TASSEL2. O. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗(yàn)計(jì)算多態(tài)性間的r2值，采用F測驗(yàn)計(jì)算兩個顯著性信號位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡。根據(jù)ACP基因的InDel_8功能位點(diǎn)開發(fā)的標(biāo)記序列如下PCR分子標(biāo)記序列5' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3'5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3'測序引物序列ZmACP Rl5' -GAAAGCGTCGTTTGAGTT-3' /5' -ATAGCCAATCTAACCGTCCAAG-3'ZmACP R25' -GAAGGCGAACAAGAGGAAGC-3' /5' -AGCCAACCATTTCCATTCG-3'ZmACPR35' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3' /5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3'


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
圖IZmACP基因內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)與不同地區(qū)的油脂表型的關(guān)聯(lián)分析；圖2ZmACP基因的結(jié)構(gòu)及其功能結(jié)構(gòu)域圖示圖3顯著關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記間兩兩配對的連鎖不平衡展示4授粉15天后ZmACP基因表達(dá)水平與油脂含量的相關(guān)性分析5InDel_8位點(diǎn)不同等位基因型對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化后的ZmACP基因的表達(dá)水平
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述；應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成，已在參考 文獻(xiàn) Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasmcoI lection and itspotential utilization for analysis of complex quantitativetraits in maize. Mol.Breeding 121，417-431 公開過。候選基因重測序材料155份我國骨干自交系材料，已在參考文獻(xiàn)Yang,X. H. et al.Genetic analysis and characterization of a new maizeassociationmapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121，417-431 (2010a).公開過。轉(zhuǎn)錄組測序材料從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。表型變異AM508群體包含508個自交系(其中包括35個高油品系)油含量相關(guān)的變異豐富，軟脂肪酸含量差異2. 3倍，硬脂肪酸含量差異達(dá)8倍。軟脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亞麻油酸(18:2,51. 2% )和亞麻酸(18:3,1.4%)這五種脂肪酸占98. 4%的油含量。4個環(huán)境聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)十個油份相關(guān)性狀的遺傳力均在90%以上。全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508 群體為材料，利用 Illumina MaizeSNP50 BeadChip 對 56，110 個位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機(jī)選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。研究使用了 106萬個高質(zhì)量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進(jìn)行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(diǎn)(建議水平顯著性閾值為1/N= 1.78X10-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計(jì)算同一染色體上的顯著性信號位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于0. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號中，有若干個位點(diǎn)位于或者臨近于(50Kb)被前人證實(shí)報(bào)道過的已知基因內(nèi)，它們在本研究中再次得到了驗(yàn)證。與已知的油脂代謝相關(guān)基因較遠(yuǎn)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)很可能是與油脂代謝相關(guān)基因緊密連鎖，則距離最近的油脂代謝基因很可能就是本研究的候選基因。玉米編碼酰基載體蛋白(ACP)基因(GRMZM2G110298)的位于玉米第一條染色體上。利用368份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于玉米參考基因組chrl. S_248149904的SNP位點(diǎn)，突變?yōu)門/C，其中T為主要等位基因，C為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 05，該位點(diǎn)與油份含量顯著關(guān)聯(lián)，解釋了 6. 58%的表型變異。
候選基因染色SNp主要貢獻(xiàn)P基因注
a體性狀e率<釋」
Acyl
GRMZM24814 chrl.S 24 油份1.33E carrier
I~T/C/0.05 6.58
2G1102989904 8149904 含量-06 protein,
_ACPa表中給出的基因的名稱是所定位的顯著位點(diǎn)內(nèi)的極可能相關(guān)的功能候選基因或者與最顯著關(guān)聯(lián)SNP (主效SNP)最近的已注釋基因。b主效SNP的位置根據(jù)玉米5a. 60版本的參考序列確定(www. maizesequence.org)c在檢測到的顯著的油脂相關(guān)性狀中最顯著相關(guān)的性狀。e主等位基因(第一個)，次等位基因以及次等位基因頻率f線性混合模型的計(jì)算過程使用tassel軟件完成j 所有的候選基因基于 Interproscan(http://www. ebi. ac. uk/interpro)所注釋的基因。候選基因重測序玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得(www. maizesequence. org),利用Primer Premier5(www. PremierBiosoft. com)和 Primer 3(http://frodo. wi. mit. edu/primer3/)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進(jìn)行多序列處理和比對，利用TASSEL 2. O. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗(yàn)計(jì)算多態(tài)性間的r2值，采用F測驗(yàn)計(jì)算兩個顯著性信號位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡。測序引物序列ZmACP Rl5' -GAAAGCGTCGTTTGAGTT-3' /5' -ATAGCCAATCTAACCGTCCAAG-3'ZmACP R25' -GAAGGCGAACAAGAGGAAGC-3; /5' -AGCCAACCATTTCCATTCG-3'ZmACPR35' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3' /5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3'根據(jù)ACP基因的功能位點(diǎn)InDel_8開發(fā)的標(biāo)記序列如下PCR分子標(biāo)記序列5' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3'5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3'玉米ACP基因多態(tài)性位點(diǎn)及AM508群體關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種玉米油份含量相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于，所述的分子標(biāo)記為玉米編碼酰基載體蛋白(ACP)基因，該分子標(biāo)記的具體位點(diǎn)位于玉米參考基因組(WWW. maizesequence.org, 5a. 60版)chrl. S_248149904的SNP，該位點(diǎn)突變?yōu)門/C，以及位于玉米ACP基因(GRMZM2G110298)3，UTR 處的 InDel_8 位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用包括以下步驟 a)由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成AM508群體； b)從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系,構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。
3.如權(quán)利要求I所述的玉米油份含量相關(guān)的分子標(biāo)記的特異性擴(kuò)增引物序列，其特征在于所述ACP基因的InDel_8功能位點(diǎn)開發(fā)的PCR分子標(biāo)記序列為5' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3'5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3。
4.如權(quán)利要求I或2所述的玉米油份含量相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，其特征在于玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得,利用Primer Premier5和P rimer3設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進(jìn)行多序列處理和比對，利用TASSEL 2. O. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗(yàn)計(jì)算多態(tài)性間的r2值，采用F測驗(yàn)計(jì)算兩個顯著性信號位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡。
5.如權(quán)利要求I或2所述的玉米油份含量相關(guān)的分子標(biāo)記在玉米育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米油份含量相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于植物分子育種領(lǐng)域。本發(fā)明的玉米油份相關(guān)的位點(diǎn)為玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr1.S_248149904的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變?yōu)門/C；以及位于玉米ACP基因(GRMZM2G110298)3’UTR處的InDel_8位點(diǎn)?？蓪⒎肿訕?biāo)記用于玉米品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系油份含量的大小。本發(fā)明采用分子標(biāo)記輔助選擇不僅準(zhǔn)確性高，加快選擇進(jìn)度，同時也將大大減少了育種的工作量，提高了育種效率。
文檔編號C12N15/29GK102925457SQ20121044471
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者嚴(yán)建兵, 楊小紅, 李建生, 李慧 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)