專利名稱：肺炎支原體p1-rflp分型檢測引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及一種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測引物及方法。
背景技術(shù)：
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)是社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要致病菌之一，其感染后的臨床表現(xiàn)可以從輕度的咽喉炎、支氣管炎到重癥間質(zhì)性肺炎(原發(fā)性非典型肺炎)及神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)并發(fā)癥等。Mp流行具有周期性，每3-7年在不同地區(qū)出現(xiàn)發(fā)病率高峰。兒童肺炎中10-30%的病例是Mp引起的，在流行高峰年Mp肺炎可高達(dá)30-50%，且流行可持續(xù)1-2年。進(jìn)入21世紀(jì)以來，全球性的Mp感染暴發(fā)流行已出現(xiàn)了兩次，分別在2005-2007年和2010-2012年初發(fā)生。Mp感染暴發(fā)流行對家庭、學(xué)校、部隊(duì)、社會都會產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)損失和社會不良影響。Pl基因作為一種重要的毒力因子，其編碼的產(chǎn)物是Pl蛋白，是Mp的主要黏附素及毒力因子，并能作為一種重要的免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。在Pl結(jié)構(gòu)基因中包含有R印MP2/3和R印MP4，這些重復(fù)序列在Mp的進(jìn)化上起重要作用，不同位置的重復(fù)序列會發(fā)生基因的重組或置換。根據(jù)不同菌株P(guān)l基因上R印MP重復(fù)序列的多態(tài)性，采用PCR-RFLP可以將其分為以國 際標(biāo)準(zhǔn)株M129為代表的Pl-1和以國際標(biāo)準(zhǔn)株為代表的Pl-1I兩型。Pl基因在國際標(biāo)準(zhǔn)株M129中位于Mp基因組的第180858-185741位，由4884個堿基組成，在國際標(biāo)準(zhǔn)株ra株中位于179293-184197位，由4905個堿基組成?，F(xiàn)有此種分型方法采用PCR擴(kuò)增Pl基因的R印MP2/3和R印MP4，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為2532bp及2201bp，然后對這些擴(kuò)增產(chǎn)物用HaeIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切產(chǎn)物圖譜的不同來判斷不同的型別。由于此方法擴(kuò)增的產(chǎn)物較長，對標(biāo)本DNA的質(zhì)量要求較高，通常適用于肺炎支原體菌株的檢測，由于肺炎支原體很難分離培養(yǎng)，且時間較長，臨床標(biāo)本中DNA的含量通常較少又含有較多的抑制物，因此急需一種新的能夠適用于臨床標(biāo)本及菌株直接檢測的分型方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測引物和方法，分別對R印MP2/3和R印MP4序列設(shè)計(jì)4條內(nèi)套引物，通過擴(kuò)增較短片段，可直接對肺炎支原體感染標(biāo)本進(jìn)行基因分型，以解決目前肺炎支原體Pl-RFLP基因分型擴(kuò)增片段較長，不易被擴(kuò)增，費(fèi)時、費(fèi)力且不能在臨床上大規(guī)模檢測的問題。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種肺炎支原體P1-RFLP分型檢測引物，分析兩個已知的Mp標(biāo)準(zhǔn)株Ml 29 (I型)和(2型)Pl基因RepMP4和RepMP2/3序列，在序列的中間部位包含HaeIII酶切位點(diǎn)(GGCC)區(qū)域設(shè)計(jì)8條內(nèi)套引物，RepMP4序列的4條內(nèi)套引物為上游引物ADHlin :ATTCTCATCCTCACCGCCA,下游引物 ADHlM CCTTGGGATCCAAGTGATCA 以及上游引物 ADH2M TGATCACTTGGATCCCAAGG,下游弓丨物 ADH2in :CTGCTAACAATTCCGGATTGAG ;R印MP2/3 序列的4條內(nèi)套引物為上游引物ADH3in TTGCTGCTAACGAGTACGAG,下游引物ADH3M CAAATCCCACACACTCTCCA 以及下游引物 ADH4in TGACTGATACCTGTGCGG,上游引物 ADH4M TGGAGAGTGTGTGGGATTTG。本發(fā)明還提供一種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測方法，具體包括如下步驟(I)提取待測樣本DNA ；(2)首先利用目前已發(fā)表的2對外套引物ADHl及ADH2、ADH3及ADH4，樣本DNA及其它PCR組份構(gòu)建PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，所述2對外套引物的序列分別為ADHl CTGCCTTGTCCAAGTCCACT ；ADH2 AACCTTGTCGGGAAGAGCTG ；ADH3 CGAGTTTGCTGCTAACGAGT ；ADH4 CTTGACTGATACCTGTGCGG ;其次利用上述設(shè)計(jì)的八條內(nèi)套引物、外套引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物DNA及其它PCR組份構(gòu)建PCR反應(yīng)體系進(jìn)行內(nèi)套引物擴(kuò)增，其中外套引物物ADH1/ADH2擴(kuò)增后的DNA，作為內(nèi)套引物ADHlin/ADHlm和ADH2m/ADH2in的擴(kuò)增模板，外套引物ADH3/ADH4擴(kuò)增后的DNA，作為內(nèi)套引物ADH3in/ADH3m和ADH4m/ADH4in的擴(kuò)增模板，。(3)對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所有陽性產(chǎn)物混合后進(jìn)行HaeIII酶切來判斷型別。進(jìn)一步，所述的步驟(2)中的外套引物PCR反應(yīng)體系為25 μ1:10 XPCRreactionbuffer2. 5 μ l,25mM 的 MgCl2 2μ 1,2. 5mM 的 dNTPs2 μ 1，上游引物 10 μ Ml. 5 μ 1，下游引物10 μ Ml. 5 μ I, 2. 5U 的 Taq DNA polymerasel μ I, DNA 模板 3 μ1、雙蒸水 11. 5 μ I。進(jìn)一步，所述的步驟⑵中的內(nèi)套引物PCR反應(yīng)體系為25 μ I =IOXPCR reactionbuffer2. 5 μ l,25mM 的 MgCl2 2μ 1,2. 5mM 的 dNTPs2 μ 1，上游引物 10 μ Ml. O μ 1，下游引物10 μ Ml. O μ 1,2. 5U的Taq DNA polymerasel μ 1，外套引物擴(kuò)增后產(chǎn)物為DNA模板3 μ1、雙蒸水 12. 5 μ I。進(jìn)一步，所述的 步驟(3)中的外套引物PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C lOmin，接著94°C lmin,55°C lmin,72°C 3min，30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。內(nèi)套引物 PCR 擴(kuò)增條件為預(yù)變性 94°C lOmin，接著 94°C lmin,55°C lmin,72°C 2min，30 個循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin。本發(fā)明的原理是根據(jù)已知的Mp兩個國際標(biāo)準(zhǔn)株M129和Pl基因的R印MP4和RepMP2/3序列，分析其中的HaeIII酶切位點(diǎn)所在區(qū)域，在序列中間部位包含酶切位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)套引物分別向兩端進(jìn)行特異性擴(kuò)增，將原來很難擴(kuò)增的RepMP4全序列2201bp和RepMP2/3序列2501bp分別分成兩個較短的片段分別進(jìn)行擴(kuò)增，RepMP4序列的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1150bp及1061bp ；RepMP2/3序列的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1265bp及1249bp。然后分別將這些內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物混合后用HaeIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切產(chǎn)物圖譜的不同來判斷不同的型別，如果臨床產(chǎn)物酶切圖譜與I型標(biāo)準(zhǔn)株M129相同，則此標(biāo)本為I型，如果臨床產(chǎn)物酶切圖譜與II型標(biāo)準(zhǔn)株FH相同，則此標(biāo)本為II型，。RepMP4包含酶切位點(diǎn)序列(以下DNA標(biāo)記部分為HaeIII酶切位點(diǎn)ggcc)GgccactggttcttcaaccacatctggatctggccaatccacccaacgtgggggttcgtcaggggacaccaaagtcaaggctttaaaaatagaggtgaaaaagaaatcggactcggaggacaatggtcagctgcagttagaaaaaaatgatctcgccaacgctcccattaagcggagcgaggagtcgggtcagtccgtccaactcaaggcggacgattttggtactgccctttccagttcgggatcaggcggcaactccaatcccggttcccccaccccctgaaggccgtggcttgcgactgagcaaattcacaaggacctccccaaatgatccgcctcgatcctgattctgtacgatgcgccttatgcgcgcaaccgtaccgccattgaccgcgttgatcacttggatcccaaggccatgaccgcgaactatccgcccagttgaagaacgcccaagtgaaaccaccacggtttgtgggactgaaaggcgcgcgatgttttgctccaaaccaccgggttcttcaacccgcgccgccaccccgagtggtttgatggcgggcagacggtcgcggataacgaaaagaccgggtttgatgtggataactctgaaaacaccaagcagggctttcaaaaggaagctgactccgacaagtcggccccgatcgccctcccgtttgaagcgtacttcgccaacattggcaacctcacctggttcgggcaagcgcttttggtgtttggtggcaatggccatgttaccaagtcggccRepMP2/3包含酶切位點(diǎn)序列(以下DNA標(biāo)記部分為HaeIII酶切位點(diǎn)ggcc)ggccaccaactacaccaacctcccccccaacctcacccccaccgctgattgaccgaacgcgctgtcattcaccaacaagaacaacgcgcagcgcgcccagctcttcctccgcggcttgttgggcagcatcccggtgttggtgaatcgaagtgggtccgattccaacaaattccaagccaccgaccaaaaatggtcctacaccgacttacattcggaccaaaccaaactgaacctccccgcttacggtgaggtgaatgggttgttgaatccggcgttggtggaaacctattttgggaacacgcgagcgggtggttcggggtccaacacgaccagttcacccggtatcggttttaaaattcccgaacaaaataatgattccaaagccaccctgatcacccccgggttggcttgaacgccccaggacgtcggtaacctcgttgtcagtggcaccacggtgagcttccagctcggcgggtggctggtcaccttcacggactttgtcaaaccccgcgcgggttacctcggtctccagttaacgggcttggatgcaagtgatgcgacgcagcgcgccctcatttgggccccccggccctgagcggcctttcgtggcagttgggtcaaccggttgggccgcgtggagagtgtgtgggatttgaagggggtgtgggcggatcaagctcagtccgactcgcaaggatctaccaccaccgcaacaaggaacgccttaccggagcacccgaatgctttggcctttcaggtgagtgtggtggaagcgagtgcttacaagccaaacacgagctccggccaaacccaatccactaacagttccccctacctgcacttggtgaagcctaagaaagttacccaatccgacaagttagacgacgatcttaaaaacctgttggaccccaaccaggttcgcaccaag



圖1肺炎支原體Pl-RFLP分型示意圖；圖2 8條內(nèi)套引物對樣本經(jīng)外套引物擴(kuò)增后再進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜M =Marker,1:ADH1_ADH2擴(kuò)增后的產(chǎn)物，2 =ADHlin-ADHlm擴(kuò)增后的產(chǎn)物，3 :ADH2m-ADH2in擴(kuò)增后的產(chǎn)物，4 :ADH3_ADH4擴(kuò)增后的產(chǎn)物，5 :ADH3in_ADH3m擴(kuò)增后的產(chǎn)物，6 ADH4m-ADH4in擴(kuò)增后的產(chǎn)物，N :陰性對照。圖3所有內(nèi)套引物陽性擴(kuò)增產(chǎn)物混合后經(jīng)HaeIII酶切后結(jié)果圖M =Marker, I FH標(biāo)準(zhǔn)株；2 M129標(biāo)準(zhǔn)株；3-8 :臨床標(biāo)本；
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步解釋。根據(jù)已知的Mp兩個國際標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)l基因的RepMP4及R印MP2/3序列，分析其中的HaeIII酶切位點(diǎn)所在區(qū)域，在序列中間部位包含酶切位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)套引物分別向兩端進(jìn)行特異性擴(kuò)增，將原來很難擴(kuò)增的全序列R印MP4序列的2201bp及R印MP2/3序列2501bp分別分成兩個較短的片段分別進(jìn)行擴(kuò)增，RepMP4序列的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1150bp及1061bp ；RepMP2/3序列的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1265bp及1249bp。然后對這些擴(kuò)增產(chǎn)物用HaeIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切產(chǎn)物圖譜的不同來判斷不同的型別。
一種肺炎支原體肺炎支原體Pl-RFLP基因分型引物，分析兩個已知的Mp標(biāo)準(zhǔn)株M129 (I型)和!7H(II型)Pl基因R印MP4及R印MP2/3序列，分別在這兩個序列的中間部位包含HaeIII酶切位點(diǎn)(GGCC)區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)套引物分別向兩端擴(kuò)增，原來的ADH1-ADH2及ADH3-ADH4擴(kuò)增產(chǎn)物分別為2201bp及2501bp，很難在臨床標(biāo)本中進(jìn)行直接擴(kuò)增，新設(shè)計(jì)的R印MP4序列內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1150bp及106Ibp，RepMP2/3序列內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1265bp及1249bp。而且內(nèi)套引物設(shè)計(jì)在HaeIII酶切處，不影響擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行酶切分型。8條內(nèi)套引物序列見表I。表1.用于Pl-RFLP基因分型的引物
權(quán)利要求
1.ー種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測引物，分析兩個已知的Mp標(biāo)準(zhǔn)株M129和Pl基因R印MP4和R印MP2/3序列，在序列的中間部位包含HaeIII酶切位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)8條內(nèi)套弓I物，其特征在于R印MP4序列的4條內(nèi)套引物為上游引物ADHlin ATTCTCATCCTCACCGCCA,下游引物 ADHlM CCTTGGGATCCAAGTGATCA 以及上游引物 ADH2M TGATCACTTGGATCCCAAGG,下游引物ADH2in CTGCTAACAATTCCGGATTGAG ；R印MP2/3序列的4條內(nèi)套引物為上游引物ADH3in TTGCTGCTAACGAGTACGAG,下游引物 ADH3M CAAATCCCACACACTCTCCA 以及下游引物ADH4in :TGACTGATACCTGTGCGG，上游引物 ADH4M :TGGAGAGTGTGTGGGATTTG。
2.ー種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測方法，其特征在于具體包括如下步驟 (1)提取待測樣本DNA； (2)首先利用目前已發(fā)表的2對外套引物ADHl及ADH2、ADH3及ADH4，樣本DNA及其它PCR組份構(gòu)建PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，所述2對外套引物的序列分別為ADHl CTGCCTTGTCCAAGTCCACT ；ADH2 AACCTTGTCGGGAAGAGCTG ；ADH3 CGAGTTTGCTGCTAACGAGT ；ADH4 CTTGACTGATACCTGTGCGG ； 其次利用權(quán)利要求1所述的8條內(nèi)套引物、外套引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物DNA及其它PCR組份構(gòu)建PCR反應(yīng)體系進(jìn)行內(nèi)套引物擴(kuò)增，其中外套引物物ADH1/ADH2擴(kuò)增后的DNA，作為內(nèi)套引物ADHlin/ADHlm和ADH2m/ADH2in的擴(kuò)增模板，外套引物ADH3/ADH4擴(kuò)增后的DNA，作為內(nèi)套引物ADH3in/ADH3m和ADH4m/ADH4in的擴(kuò)增模板； (3)對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所有陽性產(chǎn)物混合后進(jìn)行HaeIII酶切來判斷型別。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測方法，其特征在于所述的步驟(2)中的外套引物PCR反應(yīng)體系為25 ii I 10 X PCR reaction buffer2. 5 y 1，25mM的MgCl2 2u 1,2. 5mM 的 dNTPs2 u 1，上游引物 lOuMl. 5u 1，下游引物 lOuMl. 5u 1,2. 5U 的Taq DNA polymerasel U I, DNA 模板 3 U1、雙蒸水 11. 5 U I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測方法，其特征在于所述的步驟(2)中的內(nèi)套引物PCR反應(yīng)體系為25 ii I 10 X PCR reaction buffer2. 5 y 1，25mM的MgCl2 2iil，2. 5mM 的 dNTPs2 u 1，上游引物 10 y Ml. 0 yl，下游引物 10 y Ml. 0 yl，2. 5U 的Taq DNA polymerasel yl，外套引物擴(kuò)增后產(chǎn)物為DNA模板3 yl、雙蒸水12. 5u I0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種肺炎支原體Pl-RFLP分型檢測方法，其特征在于所述的步驟(3)中的外套引物PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C lOmin，接著94°C lmin，55°C lmin,72°C 3min，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ;內(nèi)套引物PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C IOmin,接著 94°C lmin,55°C lmin,72°C 2min，30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。
全文摘要
一種肺炎支原體P1-RFLP基因分型檢測引物及方法，根據(jù)已知的Mp兩個國際標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)1基因的RepMP4和RepMP2/3序列，分析其中的HaeIII酶切位點(diǎn)所在區(qū)域，在序列中間部位包含酶切位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)相鄰的內(nèi)套引物分別向兩端進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后分別將這些內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物混合后用HaeIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切產(chǎn)物圖譜的不同來判斷不同的型別，解決了目前肺炎支原體P1-RFLP基因分型擴(kuò)增片段較長，不易被擴(kuò)增，費(fèi)時、費(fèi)力且不能在臨床上大規(guī)模檢測的問題。
文檔編號C12Q1/68GK103031373SQ20121041170
公開日2013年4月10日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者孫紅妹, 薛冠華, 李少麗, 趙漢青, 馮燕玲 申請人:首都兒科研究所