一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系tt51-1的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的快速檢測(cè)方法及所用引物。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法，其原理是采用6條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在61℃對(duì)樣品模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)109-1010個(gè)拷貝。其結(jié)果鑒定可通過(guò)裸眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)的顏色變化判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有高效、快速、簡(jiǎn)操作、高特異性等特點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因水稻的快速檢測(cè)提供了便捷手段。
【專利說(shuō)明】—種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法，具體說(shuō)是一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1的方法，通過(guò)裸眼觀察反應(yīng)管顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來(lái)判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的成分。
【背景技術(shù)】
[0002]自1994年第一例商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物批準(zhǔn)上市以來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在全球農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展就一直穩(wěn)步增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已經(jīng)持續(xù)16年連續(xù)增長(zhǎng)，2011年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.6億公頃，是1996年的94倍，約占全球可用耕地面積的10%。1996年至2011年的15年間，占據(jù)世界60%人口的29個(gè)國(guó)家在種植轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，超過(guò)I億人次種植了轉(zhuǎn)基因作物，累計(jì)種植面積已超過(guò)12.5億公頃。
[0003]TT51-1轉(zhuǎn)基因水稻，即“華恢I號(hào)”品系，是由華中農(nóng)大自主研發(fā)的第一批獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書(shū)的轉(zhuǎn)基因水稻，其核心知識(shí)產(chǎn)權(quán)均屬于國(guó)內(nèi)研發(fā)單位。2009年，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻TT51-1獲得了農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室頒發(fā)的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書(shū)，批準(zhǔn)其在湖北省進(jìn)行生產(chǎn)和應(yīng)用，這標(biāo)志著我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)業(yè)化的開(kāi)端。TT51-1所用受體品種為優(yōu)良恢復(fù)系“明恢63”，抗蟲(chóng)基因CrylAb/Ac為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院取得專利的融合基因，TT51-1轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法也已在我國(guó)獲得了專利授權(quán)，目前“華恢I號(hào)”已向有關(guān)部門申請(qǐng)植物新品種權(quán)。
[0004]隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的激增和全球轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)的加速，針對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品成分的安全性問(wèn)題也日益?zhèn)涫荜P(guān)注。轉(zhuǎn)基因生物安全主要包括兩方面內(nèi)容:一方面是針對(duì)食用安全的，包括轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品成分中營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化，特異表達(dá)蛋白的毒性和致敏性，以及目標(biāo)基因漂移至腸道微生物或人體后引發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)等；另外一方面是關(guān)注由轉(zhuǎn)基因作物種植過(guò)程中對(duì)生態(tài)環(huán)境安全的影響，包括對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)以及系統(tǒng)外生物多樣性的影響，外源基因向非轉(zhuǎn)基因植物和野生近緣種橫向漂移及其可能帶來(lái)的影響，抗生物脅迫基因?qū)Ψ前袠?biāo)生物的影響等。
[0005]目前國(guó)際上對(duì)轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品檢測(cè)及食品標(biāo)識(shí)管理方面已形成部分共識(shí)性文件、評(píng)價(jià)原則及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但不同的國(guó)家和地區(qū)因國(guó)情和政策導(dǎo)向不同，導(dǎo)致對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽的閾值范圍、標(biāo)識(shí)方式等管理制度上存在較大差異。例如，歐盟和中國(guó)強(qiáng)制實(shí)施轉(zhuǎn)基因食品法規(guī)，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行嚴(yán)格的批準(zhǔn)、標(biāo)識(shí)和追蹤要求；而像美國(guó)等國(guó)家采取寬松政策，實(shí)行自愿標(biāo)識(shí)管理。
[0006]我國(guó)于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，于2002年I月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)、標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管理三個(gè)配套管理辦法，確定了第一批實(shí)施標(biāo)識(shí)管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實(shí)施。2007年9月，為了進(jìn)一步規(guī)范轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)內(nèi)容和方法，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室發(fā)布了“轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)指南”，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)內(nèi)容作了進(jìn)一步調(diào)整與擴(kuò)充。[0007]轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)要求方法要快速、準(zhǔn)確、靈敏，并且還得考慮適應(yīng)大樣品量、目標(biāo)基因種類眾多等特點(diǎn)。因此，目前轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的靶標(biāo)物主要是外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫學(xué)原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、試紙條檢測(cè)、Western雜交等方法檢測(cè)。一般從待測(cè)樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質(zhì)，利用抗體與目的蛋白(抗原)特異結(jié)合的特性，通過(guò)偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。轉(zhuǎn)基因作物的核酸檢測(cè)方法主要有兩種:核酸分子雜交技術(shù)(Sourthern blot)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)。其中PCR檢測(cè)方法包括定性PCR方法、復(fù)合PCR方法、巢式PCR方法、競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR方法、熒光定量PCR方法等。
[0008]目前，國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因檢測(cè)主要使用定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶使其在體外快速、特異地?cái)U(kuò)增目的片段。PCR檢測(cè)方法能將微量、特定的DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增至百萬(wàn)倍，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后很容易觀察，因而具備快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。PCR檢測(cè)方法雖然技術(shù)成熟穩(wěn)定，但反應(yīng)體系和操作過(guò)程比較繁雜，需要專業(yè)人員；PCR擴(kuò)增儀價(jià)格昂貴，對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求高并且移動(dòng)性差，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；定性PCR擴(kuò)增反應(yīng)與電泳檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，并且常用染料EB是強(qiáng)致癌物；定量PCR的儀器和耗材價(jià)格較高，并且需要連接電腦實(shí)時(shí)監(jiān)控檢測(cè)結(jié)果；以上因素均限制其作為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1的方法及根據(jù)外源基因交界序列設(shè)計(jì)一套引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)裸眼觀察顏色變化或通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷擴(kuò)增情況。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:`[0011]本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的邊界序列信息，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行環(huán)狀等溫?cái)U(kuò)增從而提供檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的方法。
[0012]用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的特異性引物，其特征在于包括:
[0013]外引物正向序列:AATGACCGCTGTTATGCG；
[0014]外引物反向序列:TITTGGAACATATGAGTGGTAG；
[0015]內(nèi)引物正向序列:CCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCATTGAITTGTAGAGAGAGAC；
[0016]內(nèi)引物反向序列:CGAGTGCTGGGGCAGATAAGCGTCCAGAAGGAAAAGGAAT；
[0017]環(huán)引物正向序列:CATGCCCGCTGAAATCACC；
[0018]環(huán)引物反向序列:GTAGTGGTGGGGCTACGAAC。
[0019]本發(fā)明采用上述一套引物進(jìn)行快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1的方法，其特征在于包括如下步驟:
[0020](I)采用權(quán)利要求1所述的6條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，61°C溫育60min，而后在80°C持續(xù)2min，可使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到IO9-1Oici個(gè)拷貝；
[0021]其中擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25yL，其各種成分分別為:10XBuffer 2.5 μ L, IOmMdNTPs 2μ L,50mM MgS042 μ L, 12.5 X BSA 2 μ L，625 μ M Calcein 2 μ L, 12.5mM MnCl2IyL,引物混合溶液lyL，8000U/ml Bst DNA聚合酶大片段I μ L，模板DNA 1-5 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至25 μ L ;
[0022](2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取反應(yīng)液3-25 μ L，采用不同方法判斷擴(kuò)增與否，包括:直接通過(guò)觀察顏色變化判斷有無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)；或通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。例如可以通過(guò)裸眼觀察反應(yīng)管顏色變化判斷結(jié)果，橙色為陰性，綠色為陽(yáng)性；或通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果，無(wú)梯度條帶為陰性，有梯度條帶為陽(yáng)性。
[0023]本發(fā)明所述的引物混合溶液指的是將合成的引物干粉分別配制濃度為100 μ M的母液，然后取外引物F3、B3各I μ L，內(nèi)引物FIP、BIP各8 μ L，環(huán)引物各LF、LB各I μ L，充分混合，制得引物混合溶液。
[0024]本發(fā)明所述的模板DNA指的是采用CTAB法提取純化樣品得到的基因組DNA。
[0025]為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的測(cè)定方法，下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以詳細(xì)的說(shuō)明。
[0026]1、原理
[0027]本方法應(yīng)用新型的核酸擴(kuò)增方法，其原理是采用6條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在61°C反應(yīng)60min，并且在80°C持續(xù)2min后終止，短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)到IO9-1Oltl個(gè)拷貝。具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)。
[0028]2、引物設(shè)計(jì)
[0029]本研究依據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計(jì)了 6條引物，分別是正向外引物F3、反向外引物B3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B。內(nèi)引物長(zhǎng)度通常超過(guò)40個(gè)堿基，外約為20個(gè)堿基。除了引物的長(zhǎng)度、堿基組成外，還要考慮引物與靶序列的結(jié)`構(gòu)因素，使引物能夠更好的與模板目的基因序列結(jié)合并形成環(huán)狀擴(kuò)增結(jié)構(gòu)。引物由上海生物工程公司合成。
[0030]表1引物序列表如下:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的特異性引物，其特征在于，由外引物正向序列:5’ -AATGACCGCTGTTATGCG-3’ ；外引物反向序列:5’ -TTTTGGAACATATGAGTGGTAG-3’ ；內(nèi)引物正向序列:5’ -CCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCATTGAITTGTAGAGAGAGAC-3’ ；內(nèi)引物反向序列:5’ -CGAGTGCTGGGGCAGATAAGCGTCCAGAAGGAAAAGGAAT-3’ ；環(huán)引物正向序列:5’ -CATGCCCGCTGAAATCACC-3’ ；環(huán)引物反向序列:5’ -GTAGTGGTGGGGCTACGAAC-3’ 組成。
2.一種采用權(quán)利要求1所述特異性引物快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)采用權(quán)利要求1所述的6條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，當(dāng)加入DNA模板后在61°C進(jìn)行60min的恒溫?cái)U(kuò)增，之后在80°C持續(xù)2min，可使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到109-1010個(gè)拷貝； 其中擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25 μ L，其各種成分分別為:10 XBuffer 2.5 μ L，IOmMdNTPs2μ L,50mM MgS04 2 μ L, 12.5XBSA 2μ L,625yM Calcein 2 μ L, 12.5mMMnC12 lyL，弓 I 物混合溶液I μ L，8000U/ml Bst DNA聚合酶大片段I μ L，模板DNA1-5 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至25yL ； (2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液3-25μ L，采用不同方法判斷擴(kuò)增與否，包括:直接通過(guò)裸眼觀察顏色變化判斷有無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)；或通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中所述的引物混合溶液指的是將合成引物干粉分別配制成濃度為100 μ M的母液，然后取外引物F3、Β3各I μ L，內(nèi)引物FIP、BIP各8 μ L，環(huán)引物L(fēng)F、LB各I μ L，充分混合，制得引物混合溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中所述的模板DNA指的是采用CTAB法提取純化樣品得到的DNA，體積為1-5` μ L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773836SQ201210408743
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月24日
【發(fā)明者】陳銳, 王永, 蘭青闊, 趙新, 朱珠, 郭永澤 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所