專利名稱：一種從植物提取物中篩選1-脫氧-d-木酮糖5-磷酸合酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶抑制劑的篩選領(lǐng)域，具體涉及一種從植物提取物中篩選I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)抑制劑的簡便方法。
背景技術(shù)：
萜類化合物又稱類異戊二烯，是生物體內(nèi)廣泛存在的一類天然烴類化合物，它們在生物體中發(fā)揮著重要的作用，如植物甾醇參與生物膜的構(gòu)建；泛醌參與呼吸作用；類胡蘿卜素及葉綠素的側(cè)鏈和質(zhì)體醌參與光合作用；雌激素參與細(xì)胞間信號傳遞過程并可控制個體的生長發(fā)育；多萜醇和異戊二烯基團(tuán)參與蛋白修飾；甜椒醇(capsidiol)等可作為抗菌素及植物抗毒素用于物種間相互防御；赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素和油菜素內(nèi)酯調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育；維生素A的存在可促進(jìn)視網(wǎng)膜的正常功能，缺乏則導(dǎo)致夜盲癥；維生素D能促·進(jìn)鈣、磷在腸內(nèi)的吸收，維持血鈣血磷的平衡，促進(jìn)骨質(zhì)的鈣化等。同時，植物中所含的其它一些萜類化合物在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境的關(guān)系上發(fā)揮重要的生態(tài)功能，如防御食草動物和病原微生物，吸引傳粉動物和播種動物，作為中間感應(yīng)化合物參與中間競爭等。萜類物質(zhì)還具有抗氧化活性，在人體中可起著延緩衰老和增強(qiáng)免疫力的作用，其中不少萜類化合物還具有很好的藥理活性，是中藥和天然植物藥的主要有效成分，如目前廣泛使用的抗瘧藥物青蒿素、抗心血管疾病的銀杏內(nèi)酯及具有很強(qiáng)抗癌活性的化合物紫杉醇等。長期以來，生物體內(nèi)的萜類化合物被認(rèn)為是由乙酰輔酶A經(jīng)甲羥戊酸(MVA)而合成，并認(rèn)為MVA是萜類化合物生物合成的唯一前體，故該生物合成途徑被稱為MVA途徑。但到上世紀(jì)九十年代初，人們發(fā)現(xiàn)萜類化合物的生物合成除MVA途徑外，還存在一條非甲羥戊酸途徑，由于I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)和2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是這一新途徑中的兩個重要中間體，故稱為DXP/MEP途徑,現(xiàn)稱為MEP途徑。最新研究證明，動物(包括人類)主要通過經(jīng)典的MVA途徑來合成其所需的萜類化合物，而人類的一些主要致病菌及原蟲，則是利用MEP途徑來合成其所必需的萜類化合物，這種途徑完全不同于哺乳動物和植物胞漿中的MVA途徑。由于該途徑合成的類異戊二烯及其衍生物在微生物的代謝過程及其細(xì)胞壁合成中至關(guān)重要，抑制或切斷該途徑即可達(dá)到抑菌或殺菌的目的，這就為人們提供了一個利用MEP途徑中的酶為靶標(biāo)進(jìn)行新抗菌活性化合物篩選的強(qiáng)有力的方法，而使用該方法進(jìn)行篩選的最大優(yōu)點在于篩選的過程不需考慮選擇性。因此，這條新發(fā)現(xiàn)的MEP途徑在新類型抗菌素的發(fā)現(xiàn)方面將具有非常廣闊的應(yīng)用前景，尤其是在當(dāng)前病菌對現(xiàn)存的各種抗菌素的耐受性日益提高的情況下。目前，對該生物合成途徑中的酶及它們的作用機(jī)理的研究已成為一個熱點，由于I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)是MEP途徑中的第一個酶，也是該途徑的第一個關(guān)鍵調(diào)控位點，所以對其的研究也倍受重視。Zenk,Bacher等人(US2009199313等)曾對MEP途徑中酶的抑制劑篩選方法進(jìn)行了嘗試，但是他們所建立的方法使用的底物都是含有同位素標(biāo)記的化合物，通過測定產(chǎn)物的生成情況來判斷抑制大小，所采用的檢測方法包括放射性測定法及核磁共振法等，而使用及測定具有放射性的物質(zhì)時要求有單獨的放射性物質(zhì)操作室及專門的測定儀器，核磁共振法更是需要昂貴的核磁共振儀，這都使得這些方法不適合于在普通實驗室開展相關(guān)的研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單快速的從植物提取物中篩選DXS酶抑制劑的方法，該方法適用于在實驗室中以常見的反相高效液相色譜法這種檢測手段，從植物提取物中篩選DXS酶的抑制劑，解決了背景技術(shù)中篩選DXS酶抑制劑的方法中需要大型昂貴的儀器，如核磁共振儀等，或需要進(jìn)行放射性檢測等技術(shù)問題。本發(fā)明的解決方案的原理是=D-GAP在DXS酶的催化作用下異構(gòu)化為DHAP，D-GAP及其異構(gòu)化產(chǎn)物DHAP經(jīng)磷酸酶水解后所生成的D-甘油醛(D-GA)和1，3_二羥基丙酮(DHA)都含有羰基，含有羰基的化合物可與2，4- 二硝基苯肼(2，4-DNPH)發(fā)生衍生化反應(yīng)，分別生成D-GA-腙和DHA-腙，利用HPLC分離并紫外檢測此二化合物，然后從檢測結(jié)果判斷所添加 植物提取物是否具有DXS酶抑制活性。過程如下
權(quán)利要求
1.一種從植物提取物中篩選DXS酶抑制劑的方法，其特征在于該方法包括以下環(huán)節(jié) (1)建立篩選反應(yīng)體系 采用D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羥丙酮(DHAP)作為底物，與二價金屬離子和I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)加入到緩沖液中，再加入所要檢測的植物提取物樣品，在25-45°C下孵育；所述二價金屬陽離子為Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+ ;然后加入磷酸酶，在30-45°C下孵肓，水解磷酸酯；然后加入色譜純試劑和衍生化試劑進(jìn)行衍生化； (2)按照以上環(huán)節(jié)(I)建立對照反應(yīng)體系 采用D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羥丙酮(DHAP)作為底物，與二價金屬離子和DXS酶加入到緩沖液中，在25-45°C下孵育；所述二價金屬陽離子為Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+ ；然后加入磷酸酶，在30-45°C下孵育，水解磷酸酯；然后加入色譜純試劑和衍生化試劑進(jìn)行衍生化； (3)反相高效液相色譜檢測 以環(huán)節(jié)⑵的對照樣為參比，用HPLC方法檢測環(huán)節(jié)(I)的樣品中D-GAP或DHAP的轉(zhuǎn)化情況 采用的底物為D-GAP，則根據(jù)底物D-GAP的轉(zhuǎn)化量或產(chǎn)物DHAP的生成量是否改變來判斷所加樣品對DXS酶活性有無影響；或者，采用的底物為DHAP，則根據(jù)底物DHAP的轉(zhuǎn)化量或產(chǎn)物D-GAP的生成量是否改變來判斷所加樣品對DXS酶活性有無影響； 進(jìn)而篩選出DXS酶的有效抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從植物提取物中篩選DXS酶抑制劑的方法，其特征在于 在環(huán)節(jié)⑴和(2)，加入的底物D-GAP或DHAP的濃度為2-10mM，二價金屬陽離子的濃度為 5-20mM，DXS 酶用量為 O. 2_2mg/ml，所用緩沖液為 40_400mM、pH = 5. 0-9. O 的 Tris-HCl或PBS或檸檬酸或MOPS緩沖液；水解磷酸酯過程中加入的磷酸酶的用量為O. 5-2units/μ 1，30-45°C下孵育時間為l-4h ； 在環(huán)節(jié)(I)的篩選反應(yīng)體系中，樣品的終濃度為l-100yg/ml，25-45°C下孵肓?xí)r間為l-8h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從植物提取物中篩選DXS酶抑制劑的方法，其特征在于環(huán)節(jié)(I)和(2)的反應(yīng)體系中，衍生化時加入的色譜純試劑為甲醇，衍生化試劑為2，4_ 二硝基苯肼(2，4-DNPH)或3，5_ 二氨基苯甲酸(3，5-DABA)，濃度為50_120mM，孵肓溫度為20-40°C，孵肓?xí)r間為O. 5-2h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從植物提取物中篩選DXS酶抑制劑的方法，其特征在于環(huán)節(jié)(3)的檢測體系中，高效液相色譜法所使用的儀器為Agilent Technologiesl200系列或島津高效液相色譜儀，色譜柱為4. 6 X 250_ C-18低碳反相色譜柱，檢測器為二極管陣列檢測器；進(jìn)樣量為1-50 μ I ;流速為O. 3-2. Oml/min ;檢測波長為240_400nm ;柱溫為20_40°C;流動相為甲醇/水、乙腈/水或四氫呋喃/水，采用梯度洗脫模式，洗脫時間為15-30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從植物提取物中篩選DXS酶抑制劑的方法，其特征在于 環(huán)節(jié)(3)采用甲醇/水作為流動相，則梯度洗脫條件為流動相A :水，流動相B :甲醇；梯度為Omin, 40%流動相B流動相B !ISminJO1^流動相B ;20min, 40%流動相B ；或者，環(huán)節(jié)(3)采用乙腈/水作為流動相，則梯度洗脫條件為流動相A :水，流動相B 乙腈；梯度為Omin, 40%流動相B ;20min, 80%流動相B ;23min, 40%流動相B ； 或者，環(huán)節(jié)(3)采用四氫呋喃/水作為流動相，則梯度洗脫條件為流動相A :水，流動相B :四氫呋喃；梯度為Omin,35%流動相B ; 15min, 60 %流動相B ; 18min, 35 %流動相B ；20min, 35%流動相 B。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從植物提取物中篩選1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)抑制劑的方法。通過采用柱前衍生-高效液相色譜法檢測底物的轉(zhuǎn)化量來評價所添加的植物提取物對DXS酶的磷酸丙糖異構(gòu)化活性的抑制作用。主要涉及到將植物提取物加入到DXS酶催化的磷酸丙糖異構(gòu)化反應(yīng)體系中，在一定溫度下反應(yīng)后，以磷酸酶水解反應(yīng)體系中的磷酸丙糖，再加入2，4-二硝基苯肼進(jìn)行衍生化，然后以高效液相色譜法利用甲醇-水或乙腈-水為流動相梯度，紫外檢測儀檢測。本方法在篩選過程中，所用底物D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羥丙酮(DHAP)均不含同位素標(biāo)記；篩選過程簡單、快速、可行性強(qiáng)，不需要用昂貴的大型儀器檢測。
文檔編號C12Q1/42GK102899389SQ20121038573
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者高文運, 李恒, 李瑾, 胡玥, 秦巍 申請人:西北大學(xué)