專利名稱：一株太空環(huán)境下的褪色沙雷菌lct-sm262菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的微生物菌株以及其生物學(xué)特性、基因組DNA序列、轉(zhuǎn)錄組和差異蛋白組學(xué)，利用生物信息學(xué)技術(shù)獲得其比較基因組學(xué)信息、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的差異表達(dá)基因以及差異蛋白組學(xué)鑒定的蛋白質(zhì)分子。
背景技術(shù)：
隨著我國神舟飛船和空間站等龐大航天計(jì)劃的實(shí)施，載人航天的醫(yī)學(xué)保障需求日益突出，空間醫(yī)學(xué)的研究日益重要。微生物在自然界普遍存在，航天活動(dòng)也不可避免，人體及太空部件均會(huì)攜帶微生物至太空。既往在空間環(huán)境對(duì)微生物影響的研究中發(fā)現(xiàn)外太空環(huán)境下，微生物的生長(zhǎng)曲線遲滯期將縮短、生長(zhǎng)與繁殖速度將增加、并具有增加次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的潛力。更為重要的是，病原微生物對(duì)藥物抗性、毒力及其致病性也可能增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)在模擬微重力作用下，大腸桿菌無論是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期還是平穩(wěn)生長(zhǎng)期，其耐高滲能力及耐酸能力都顯著增強(qiáng)。在模擬微重力條件下培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌對(duì)小鼠感染的毒力會(huì)增強(qiáng)。美國航天局一些研究顯示肺炎鏈球菌等機(jī)會(huì)致病菌在模擬微重力條件下毒力增強(qiáng)。因此迫切需要研究太空環(huán)境對(duì)微生物尤其是條件致病菌的作用及其機(jī)制。褪色沙雷菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界，是水和土壤中的常居菌群。褪色沙雷菌也是臨床常見的條件致病菌，近幾年在臨床的檢出率增高，而且因?yàn)閺V譜抗生素的廣泛使用，多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥的菌株顯著增多，臨床抗感染治療手段已十分有限。既往針對(duì)該菌生物學(xué)特性、致病性等研究均局限于地面。對(duì)空間環(huán)境下褪色沙雷菌的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株，通過表型研究揭示其生物學(xué)特性及致病性變化，以基因組學(xué)法明確空間環(huán)境對(duì)細(xì)菌遺傳性狀的作用，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)，研究細(xì)菌對(duì)空間環(huán)境適應(yīng)性變化的機(jī)制。本發(fā)明提供的菌株LCT-SM262，其保藏號(hào)為CGMCC N0.6529。所述的一株褪色沙雷菌，革蘭氏染色陰性，形態(tài)呈桿狀、單個(gè)、無芽孢；同地面株相t匕，抗生素的敏感性無明顯變化；無生長(zhǎng)速度的差異；同地面株均無溶血反應(yīng)；Biolog反應(yīng)板生化特征結(jié)果顯示與地面株比較LCT-SM262可以利用D-棉子糖，不能利用a-D-葡萄糖。所述的LCT-SM262菌株，通過全基因組測(cè)序方法獲得太空環(huán)境下的該菌株的突變基因包括:(I)、質(zhì)粒差異分析顯示LCT-SM262比對(duì)上糞腸球菌RE25plasmidpRE25上的二個(gè)片段:1996-3019bp和46311-48346bp。說明這段序列在菌株屎腸球菌LCT-EF301 (與LCT-SM262和同屬于上天的菌株)上也存在，則說明:LCT_SM262與屎腸球菌發(fā)生基因交流獲得了這段序列。這段序列為四環(huán)素耐藥基因上的轉(zhuǎn)座子。
(2)、耐藥基因分析提示LCT-SM262缺失tet41基因，該耐藥基因編碼蛋白的功能為四環(huán)素的外排泵。(3)、毒力基因分析結(jié)果顯示LCT-SM262發(fā)生了毒力基因flil和flgl的缺失。flil是鞭毛特異性ATP合成酶，flgl是鞭毛P-環(huán)蛋白前體。鞭毛同細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和粘附能力有關(guān)，表明該菌對(duì)宿主的粘附功能下降。(4)、SNP差異分析顯示雜合SNP位點(diǎn)有58個(gè)，其中有意義的有13個(gè)。所述的LCT-SM262菌株，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定獲得該菌株的差異表達(dá)基因有20個(gè)發(fā)生上調(diào)，5個(gè)發(fā)生下調(diào)。所述的LCT-SM262菌株，采用差異蛋白組學(xué)方法鑒定得到該菌株的差異表達(dá)蛋白分子，其中上調(diào)的有32個(gè)，下調(diào)的35個(gè)，其中變化超過兩倍以上的有12個(gè)上調(diào)，15個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)分子。GO功能富集分析提示這些差異表達(dá)蛋白主要與氧化還原酶活性有關(guān)，Pathway富集分析顯示這些差異蛋白`主要集中在淀粉和蔗糖的代謝通路。所述的LCT-SM262菌株，存在靈菌紅素合成基因(pigB-pigP)，其編碼的代謝產(chǎn)物靈菌紅素是一類含甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)的天然色素，具有免疫抑制、抗細(xì)菌、抗真菌和抗瘧疾等多種生物活性。此外有研究發(fā)現(xiàn)靈菌紅素具有很強(qiáng)的抗腫瘤及免疫抑制活性具有抗腫瘤、免疫抑制作用。


圖1為褪色沙雷菌LCT-SM262菌株革蘭氏染色圖2為褪色沙雷菌LCT-SM262菌株Biolog生化特征圖3為褪色沙雷菌LCT-SM262菌株生長(zhǎng)曲線圖4為褪色沙雷菌LCT-SM262質(zhì)粒鑒定5為褪色沙雷菌LCT-SM262的GC含量與D^th關(guān)聯(lián)分析6為褪色沙雷菌LCT-SM262的15-mer分析7為褪色沙雷菌LCT-SM262的轉(zhuǎn)錄組基因覆蓋度圖8為褪色沙雷菌LCT-SM262的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因圖9為褪色沙雷菌LCT-SM262的蛋白質(zhì)組差異表達(dá)蛋白
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。本項(xiàng)目研究人員采用自制的樣本管搭載細(xì)菌，依據(jù):HYK_GF15《航天員系統(tǒng)載人運(yùn)輸飛船/目標(biāo)飛行器艙載產(chǎn)品環(huán)境試驗(yàn)技術(shù)條件》，該樣本管通過了沖擊、快速減壓、震動(dòng)實(shí)驗(yàn)。褪色沙雷菌接種至樣本管中，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B瓊脂半固體培養(yǎng)基。然后封裝入代號(hào)為20111001的樣品包(材料為藍(lán)色美塔斯阻燃布料)。經(jīng)過神舟八號(hào)搭載，獲得太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株。具體實(shí)施實(shí)例一、LCT-SM262的表型特征分析:1.形態(tài)特征:取50ul樣品離心,棄上清,加入無菌水50ul,吸取20ul于載玻片上進(jìn)行固定；初染，吸取革蘭氏染色I(xiàn) (結(jié)晶紫)2滴于載玻片樣品上進(jìn)行初染lmin，然后用自來水沖洗染液；媒染，吸取革蘭氏染色I(xiàn)I (碘液)2滴覆蓋涂面染約lmin，然后用自來水沖洗染液，用吸水紙吸取涂面上的水分；脫色，吸取革蘭氏染色I(xiàn)II (酒精)2滴滴在涂面上約30s,用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；復(fù)染，吸取革蘭氏染色I(xiàn)V (番紅)2滴滴在涂面上約lmin，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；觀察，先用顯微鏡低倍鏡找到目標(biāo)視野，然后再用油鏡(100X)進(jìn)行觀察，判定并記錄結(jié)果、拍照，見圖1。2.菌株的16s rDNA鑒定:16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長(zhǎng)約1.5kb。將已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴(kuò)增的單菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組后擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物序列如下:SgF:AGAGTTTGATCATGGCTCAGSgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT16S rDNA PCR產(chǎn)物用96孔mi I Ipore純化系統(tǒng)純化后準(zhǔn)確定量，經(jīng)AB13730xl全自動(dòng)序列分析儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測(cè)序結(jié)果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp (雙向測(cè)序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server2.1數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì),確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導(dǎo)入seqman,輸出single file (fasta)后，經(jīng)Mega5.0軟件clusterW多重比對(duì)，輸出meg文件重新導(dǎo)入構(gòu)建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny testmethod為bootstrap參數(shù)設(shè)置為1000。16s rDNA鑒定結(jié)果為該菌株屬于褪色沙雷菌。3.耐藥性檢測(cè):經(jīng)過16s rDNA測(cè)序分析后，取出這些單菌的斜面，用滅菌的竹簽從斜面上蘸取適量菌種于1.5ml離心管中，混勻，調(diào)菌濃度約107 108。吸取備好的菌懸液IOOul進(jìn)行涂布，盡可能地涂布均勻，每株單菌涂6個(gè)平板，每涂完一株菌，就進(jìn)行下一步(粘貼藥敏片)。粘貼藥敏片，選擇的抗生素為青霉素G、氨芐青霉素、頭孢唑林、復(fù)達(dá)欣(頭孢他啶)(頭孢噻甲羧肟)、菌必治(頭孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、環(huán)丙沙星(奔克)(悉復(fù)歡)(丙氟哌酸)、潔霉素(林可霉素)、萬古霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、舒普深(先鋒必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、鏈霉素、美滿霉素(二甲胺四環(huán)素)(米諾環(huán)素)、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。將平板放置在37°C下培養(yǎng)18 24h培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈大小。結(jié)果示LCT-SM262較地面株耐藥性無明顯變化。4.溶血試驗(yàn):采用點(diǎn)種法，將太空株和地面株點(diǎn)種于同一血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)24-48h后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示其無溶血反應(yīng)。5.生化代謝(Biolog)實(shí)驗(yàn):菌懸液制備，取出菌株的斜面，用滅菌竹簽蘸取菌種接種在LB液體培養(yǎng)基中(4ml體系)，培養(yǎng)24h。然后取2ml菌液6000r/s離心5min，棄上清培養(yǎng)基，留下離心的菌體，然后用滅菌的生理鹽水洗漆菌體，6000r/s離心5min,再次棄去上清，再用Biolog接種液進(jìn)行懸浮菌體，最后再轉(zhuǎn)至15ml的接種液中。調(diào)至濃度約IO7 IO8;接種，將以上菌懸液倒至接種皿中，震蕩均勻，用12道(或8道)排槍進(jìn)行加樣，每個(gè)Biolog板孔加樣lOOul，共96孔，加完樣后，蓋上Biolog板蓋，放置在37°C下培養(yǎng)，24h和48h進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果，結(jié)果見表I,圖2。表I褪色沙雷菌LCT_SM262Biolog反應(yīng)板生化特征
權(quán)利要求
1.一株太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株，其保藏號(hào)為:CGMCC N0.6529。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株褪色沙雷菌，其特征在于:革蘭氏染色陰性，形態(tài)呈桿狀、單個(gè)、無芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性無明顯變化，無生長(zhǎng)速度的差異；同地面株均無溶血反應(yīng)；Biolog反應(yīng)板生化特征結(jié)果顯示與地面株比較可以利用D-棉子糖，不能利用a_D_匍萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LCT-SM262菌株，通過全基因組測(cè)序方法獲得太空環(huán)境下的該菌株的突變基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LCT-SM262菌株，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定獲得該菌株的差異表達(dá)基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LCT-SM262菌株，采用差異蛋白組學(xué)方法鑒定得到該菌株的差異表達(dá)蛋白分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LCT-SM262菌株，存在靈菌紅素合成基因(pigB-pigP)，其編碼的代謝產(chǎn)物靈菌紅素 具有抗腫瘤、免疫抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株及其生物學(xué)特性、基因組DNA序列、轉(zhuǎn)錄組和差異蛋白組學(xué)，特別是同地面褪色沙雷菌比較分析鑒定出的功能序列和分子，本發(fā)明可獲得全面、準(zhǔn)確的太空環(huán)境褪色沙雷菌菌株突變的基因、差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)分子，有助于研究太空環(huán)境對(duì)微生物的作用和機(jī)制，保障太空環(huán)境安全；有助于發(fā)現(xiàn)新的毒力和耐藥靶點(diǎn)，為臨床感染性疾病提供新的治療靶點(diǎn)；其代謝產(chǎn)物靈菌紅素具有抗腫瘤、免疫抑制作用，具有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/425GK103173374SQ201210379779
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者劉長(zhǎng)庭, 常德, 王雅娟, 方向群, 李天志, 王俊峰, 郭英華, 蘇龍翔, 陳振鴻, 徐國綱 申請(qǐng)人:中國人民解放軍總醫(yī)院