專利名稱：用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別涉及到一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌及其用途。
背景技術(shù)：
Y-聚谷氨酸(Poly (y-glutamic acid), Y -PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通過α-氨基和Y-羧基聚合而成的ー種獨特的生物高分子。通常是由500-5000個谷氨酸單體聚合而成，分子量在IOO-IOOOkDa之間。Y -聚谷氨酸分子中的谷氨酸殘基上帶有大量游離的親水性羧基，可在分子內(nèi)部或分子間形成氫鍵，具有極高的水溶性和吸水保濕性；這些游離羧基同時提供了陽離子結(jié)合的基團，使其對金屬離子具有良好的吸附性。除此之外，Y-聚谷氨酸作為ー種環(huán)境友好型生物高分子，還具有一些獨特的優(yōu)良特性，如可食用、可降解、生物兼容性、對人體和環(huán)境無毒害等。因此，其被作為冷凍保護劑、祛苦劑、增稠劑和礦物質(zhì)吸附劑應用于食品領(lǐng)域；作為藥物輸送劑、基因載體、醫(yī)用生物粘合劑應用于醫(yī)藥領(lǐng)域；作為熱塑性材料、水凝膠等應用于エ業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域；作為金屬吸附劑和生物絮凝劑應用于環(huán)保領(lǐng)域；作為保濕劑應用于化妝品領(lǐng)域。Y-聚谷氨酸于1937年由IWnovics等人首先在炭疽芽胞桿菌莢膜中發(fā)現(xiàn)(Ivanovics and Brucknerl937; Ivanovics and Erd5sl937);并在 1942年被證實可作為發(fā)酵產(chǎn)物由枯草芽孢桿菌分泌至液體培養(yǎng)基中(BoVamickl942)。由此，枯草芽孢桿菌和地衣芽胞桿菌被作為主要的Y-聚谷氨酸產(chǎn)生菌引起了廣泛的研究。尤其是近十年來，國內(nèi)外對微生物發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸進行了廣泛深入地研究。目前，日本和韓國已進行了エ業(yè)化試生產(chǎn)。國內(nèi)開展Y-聚谷氨酸的研究相對較晚，ー些科研院校主要對Y-聚谷氨酸產(chǎn)生菌篩選、發(fā)酵エ藝優(yōu)化、分批發(fā)酵生產(chǎn)等進行了研究，取得了一些可喜的研究成果。Y-聚谷氨酸經(jīng)過近二十年的研究和發(fā)展，菌種的發(fā)酵生產(chǎn)能力得到了較大幅度的提高，但是菌株發(fā)酵周期長、生產(chǎn)效率低、發(fā)酵エ藝成本高等嚴重制約了 Y-聚谷氨酸發(fā)酵エ業(yè)化的進程。因此，尋找具有優(yōu)良發(fā)酵特性的Y-聚谷氨酸產(chǎn)生菌具有重要的生產(chǎn)意義。海沙是由巖石經(jīng)過風和水的侵蝕和沖刷形成的小顆粒，主要成分是ニ氧化硅。廣西北海海沙因長期浸于高鹽濃度的海水中，且廣西北海地處亞熱帶地區(qū)，日照時間長，海沙長期處于高溫日照條件下，因此從這種海沙樣品中可分離到ー些較其他材料來源發(fā)酵特性更加優(yōu)良的菌種，如耐高鹽、耐高溫菌種。目前用于生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其分離菌種材料大多來源于土壌、豆腐乳、醬蘿卜條、醬黃瓜、醬大蒜、豆醬、西瓜醬、醬菜、臘腸、豆鼓、納豆、臘肉，關(guān)于以海沙為分離菌種材料，尚未有公開文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷
4氨酸的枯草芽孢桿菌及其用途，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌是從海沙中分離得到，可在較高溫度下高效合成Y-聚谷氨酸，最高溫度可為50°C，發(fā)酵時間18 25h，產(chǎn)量最高可達2(T30g/1，生產(chǎn)速率可達O. iTl.3g/l *h，具有優(yōu)良的溫度特性、營養(yǎng)要求簡單和培養(yǎng)方法簡便易行等優(yōu)點，這些優(yōu)良特性為エ業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) GXA-28，保藏編號為 CCTCC NO :M2012347，保藏日期為 2012 年 9月14日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學。以上所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) GXA-28的培養(yǎng)方法包括如下步驟(I)制備菌懸液將海沙樣品接入裝有80 120ml無菌生理鹽水的250ml三角瓶中，室溫下磁力攪拌25 40分鐘，制成菌懸液，于9(T110°C處理8 15min ；(2)菌懸液稀釋、菌落挑取將步驟(I)的菌懸液采用10倍稀釋法梯度稀釋成不同濃度的菌懸液，選擇105、106和IO7倍的菌懸液100 μ L涂布于固體分離培養(yǎng)基平板上,45飛(TC恒溫培養(yǎng)2(T25h后，挑取菌落表面粘稠、用牙簽能挑起拉絲的單菌落；(3)劃線純化用平整、圓滑的接種環(huán)，在無菌操作條件下，挑取少量步驟(2)中的單菌落，在固體分離培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線，將劃線后的平板至于45飛(TC恒溫培養(yǎng)15^20h后，挑取平板上的純種單菌落至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后保存；(4)傳代培養(yǎng)用平整、圓滑的接種環(huán)，在無菌操作條件下，挑取少量斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接至另ー支新鮮試管斜面上，45飛(TC恒溫條件下，傳代培養(yǎng)15 20h ；(5)搖瓶檢測發(fā)酵性能獲取目標菌株用平整、圓滑的接種環(huán)挑取斜面上長度為f 2cm的菌苔接入裝有25 30ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速16(T250rpm，4(T50°C培養(yǎng)l(Tl5h至菌株對數(shù)生長中期，將種子液按1 10%接種量接入裝有2(T80ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速16(T250rpm，4(T5(rC培養(yǎng)18 25h后，檢測發(fā)酵液中Y-聚谷氨酸產(chǎn)量，選取產(chǎn)量最高者為目標菌株，即枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) GXA-28 ο以上所述固體分離培養(yǎng)基的濃度組分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飛g/Ι，谷氨酸和 / 或谷氨酸鹽 3 6g/l，MgSO4 · 7H20 O. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，瓊脂 10 15g/I, pH值6. 5^7. 5,蒸懼水配制。以上所述液體種子培養(yǎng)基的濃度組分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飛g/Ι，谷氨酸和 / 或谷氨酸鹽 3 6g/l，MgSO4 · 7H20 O. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6. 5 7· 5，蒸餾水配制。以上所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組分如下葡萄糖2(T50g/l，酵母膏2飛g/Ι，谷氨酸和 / 或谷氨酸鹽 15 30g/l，MgS04 ·7Η20 O. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸餾水配制。作為進一歩限定，以上所述谷氨酸為L-谷氨酸。作為進一歩限定，以上所述谷氨酸鹽為谷氨酸鈉和市售味精中的任意ー種或幾種混合物。如上所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y -聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌的用途，是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) GXA-28在高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y -聚谷氨酸方面的應用，其高溫發(fā)酵的溫度為4(T50°C。作為優(yōu)選，以上所述高溫發(fā)酵的溫度為45 50°C。本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) GXA-28,以下稱為CCTCC NO M2012347，其性狀特征如下(I)菌體形態(tài)特征菌株CCTCC NO M2012347在固體斜面培養(yǎng)基上50°C培養(yǎng)16h后電鏡觀察，菌體呈桿狀,大小O. 7-0. 9X2. 0-3. O μ m，可運動，革蘭氏染色陽性。菌株CCTCC NO :M2012347在固體斜面培養(yǎng)基上50°C培養(yǎng)30h后芽孢染色觀察，可見明顯芽抱。(2)菌落形態(tài)特征菌株CCTCC NO M2012347在固體分離培養(yǎng)基平板上50°C培養(yǎng)24h后，在添加谷氨酸的平板上，菌落圓形、表面呈樹突狀、邊緣分泌粘稠物、菌落直徑達I. 5-2. Ocm ;在不添加谷氨酸的平板上，菌落干燥、扁平、中央凹陷、邊緣不規(guī)則。菌株CCTCC NO M2012347在液體分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在液體表面可形成菌膜，培養(yǎng)液略顯渾濁。(3) CCTCC NO M2012347生理生化性質(zhì)如下表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在干所述菌的分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GXA_28，保藏編號為CCTCC NO M 2012347，保藏日期為2012年9月14日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) GXA-28的培養(yǎng)方法包括如下步驟 制備菌懸液將海沙樣品接入裝有8(Tl20ml無菌生理鹽水的250ml三角瓶中，室溫下磁力攪拌25 40分鐘，制成菌懸液，于9(TllO°C處理8 15min ； 菌懸液稀釋、菌落挑取將步驟(I)的菌懸液采用10倍稀釋法梯度稀釋成不同濃度的菌懸液，選擇IO5UO6和IO7倍的菌懸液100 μ L涂布于固體分離培養(yǎng)基平板上，45飛(TC恒溫培養(yǎng)2(T25h后，挑取菌落表面粘稠、用牙簽能挑起拉絲的單菌落； 劃線純化用平整、圓滑的接種環(huán)，在無菌操作條件下，挑取少量步驟(2)中的單菌落，在固體分離培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線，將劃線后的平板至于45飛(TC恒溫培養(yǎng)15 20h后，挑取平板上的純種單菌落至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后保存； 傳代培養(yǎng)用平整、圓滑的接種環(huán)，在無菌操作條件下，挑取少量斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接至另ー支新鮮試管斜面上，45飛(TC恒溫條件下，傳代培養(yǎng)15 20h ； 搖瓶檢測發(fā)酵性能獲取目標菌株用平整、圓滑的接種環(huán)挑取斜面上長度為f2cm的菌苔接入裝有25 30ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速16(T250rpm，40 50で培養(yǎng)l(Tl5h至菌株對數(shù)生長中期；將所得種子液按廣10%接種量接入裝有2(T80ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速16(T250rpm，4(T5(rC培養(yǎng)18 25h后，檢測發(fā)酵液中Y -聚谷氨酸產(chǎn)量，選取產(chǎn)量最高者為目標菌株，即枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GXA-28ο
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述固體分離培養(yǎng)基的濃度組分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飛g/Ι，谷氨酸和/或谷氨酸鹽 3 6g/l，MgSO4*7Η200. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，瓊脂 10 15g/l，pH 值 6· 5 7. 5,蒸懼水配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述液體種子培養(yǎng)基的濃度組分如下葡萄糖8 12g/l，酵母膏3飛g/Ι，谷氨酸和/或谷氨酸鹽 3 6g/l，MgSO4·7Η200. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸餾水配制。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組分如下葡萄糖2(T50g/l，酵母膏2飛g/Ι，谷氨酸和/或谷氨酸鹽 15 30g/l，MgSO4·7Η200. Γθ. 2g/l，KH2PO4 0. 3 0. 5g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸餾水配制。
6.根據(jù)權(quán)利要求:Γ5中任一項所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述谷氨酸為L-谷氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求:Γ5中任一項所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述谷氨酸鹽為谷氨酸鈉和市售味精中的任意ー種或幾種混合物。
8.—種如權(quán)利要求f 7中任一項所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌的用途，其特征在于所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) GXA-28是在高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸方面的應用，其高溫發(fā)酵的溫度為40 50°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌的用途，其特征在干所述高溫發(fā)酵的溫度為45 50°C。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GXA-28，保藏編號為CCTCCNOM2012347，保藏日期為2012年9月14日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。該枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GXA-28是在高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸方面的應用，高溫發(fā)酵的溫度為40~50℃。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌是從海沙中分離得到，可在較高溫度下高效合成γ-聚谷氨酸，最高溫度可為50℃，發(fā)酵時間18~25h，產(chǎn)量最高可達20~30g/l，生產(chǎn)速率可達0.9~1.3g/l h，具有優(yōu)良的溫度特性、營養(yǎng)要求簡單和培養(yǎng)方法簡便易行等優(yōu)點，這些優(yōu)良特性為工業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。
文檔編號C12P13/02GK102911896SQ20121037176
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者梁智群, 曾偉, 陳桂光, 張云開 申請人:廣西南寧智天生物科技有限公司