專利名稱：一種雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌提取及深加工領(lǐng)域，具體地涉及一種雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
毛頭鬼傘[Coprinuscomatus (Mueller, ex Fr. ) S. F. Gray],俗稱雞腿燕、雞腿蘑，是一種食、藥用真菌，其肉質(zhì)細(xì)嫩，鮮美可口，色香味俱全。藥用味甘滑，性平，有益脾胃，清心安神，治痔等功效。據(jù)文獻(xiàn)報道，毛頭鬼傘主要具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抑菌等作用。雞腿菇多糖作為雞腿菇中最重要的活性成分之一，具有多種生物活性和藥理作用，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等作用。
目前關(guān)于雞腿菇提取及深加工的研究，大多集中在雞腿菇多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及生物活性作用探討等方面，而對雞腿菇中香氣、鮮味等風(fēng)味物質(zhì)的研究較少，風(fēng)味成分丟棄，造成雞腿菇原料利用率低、產(chǎn)品附加值低的現(xiàn)狀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先提供了一種雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)，其是用如下方法制備得到的復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0% (w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ;水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ；醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%, 4-20°C下，靜置8-12h，離心，沉淀即為雞腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即為呈味物質(zhì)。具體的說，本發(fā)明的雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)，是用如下方法制備得到的①提取將雞腿菇子實體于50-60°C烘干后粉碎過200目篩網(wǎng)，按料液比1:15-1:20加入蒸餾水充分浸泡20-30min，然后添加O. 5%_3. 0% (w/v)的復(fù)合酶，于500C -60°C反應(yīng)l_4h，沸水滅酶活15-20min，過濾得到濾渣和濾液I ;②濾渣再按1:15-1:20添加蒸餾水，于1001反應(yīng)l_2h，過濾，收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ； ③提取液濃縮將濾液2按照濃縮比1:3進(jìn)行濃縮；④乙醇醇沉向上述濃縮液里添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，充分?jǐn)噭蚝笥?-20°C，靜置8-12h，離心，沉淀用70%乙醇洗滌1_2次，即為雞腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即得雞腿菇中呈味物質(zhì)；⑤干燥將沉淀用5-10倍蒸餾水溶解后，水浴揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得雞腿菇粗多糖；呈味物質(zhì)按料液比1:25濃縮備用。
其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶三種酶的復(fù)合酶，三者復(fù)合的質(zhì)量比例為1:1-2:1-9。本發(fā)明具體的說提供了一種雞腿菇子實體多糖，其是用如下方法制備得到的復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0% (w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ;水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ； 醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%, 4-20°C下，靜置8-12h，離心，沉淀即為雞腿菇多糖；其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三者質(zhì)量比例為1:1-2:1-9。本發(fā)明還提供了一種雞腿菇子實體呈味物質(zhì)，其是用如下方法制備得到的復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0% (w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ;水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ；醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%, 4-20°C下，靜置8-12h，離心，上清液回收乙醇，水相部分即為呈味物質(zhì)；其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三者質(zhì)量比例為1:1-2:1-9。其中所得到的呈味物質(zhì)主要為游離氨基酸和可溶性固形物；其中可溶性固形物是指液體或流體食品中所有溶解于水的化合物的總稱。包括糖、酸、維生素、礦物質(zhì)等，主要是指可溶性糖類，包括單糖、雙糖，多糖(除淀粉，纖維素、幾丁質(zhì)、半纖維素不溶于水)，本實驗中主要用來衡量液體中可溶性糖的含量，因為可溶性糖及糖醇也是風(fēng)味物質(zhì)的一部分。其中的游離氨基酸的量可采用茚三酮比色法測定。其中的可溶性固形物可采用手持式數(shù)顯糖度計測定。本發(fā)明還提供了制備上述雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)的方法，該方法為本發(fā)明首先提供了一種雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)，其是用如下方法制備得到的復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0% (w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ;水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ；醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，4-20°C下，靜置8-12h，離心，沉淀即為雞腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即為呈味物質(zhì)。本發(fā)明制備的雞腿菇多糖提取物得率達(dá)7. 7%，游離氨基酸的量達(dá)34. 7mg/g，可溶性固形物1.8° Brix，實現(xiàn)了多糖和呈味物質(zhì)的同時制備，提高了雞腿菇子實體原料的利用率，且制備的雞腿菇子實體多糖能夠顯著地刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO活性。食用菌中含有豐富的氨基酸、呈味核苷酸等呈味物質(zhì)，具有濃郁的鮮香風(fēng)味而且營養(yǎng)豐富、食用安全，作為新型保健食品調(diào)味料，具有調(diào)味增香的作用，適用于日式、西式和中式烹調(diào)的調(diào)味料，具有廣闊前景，因此此方法制備的呈味物質(zhì)對于食用菌調(diào)味品的開發(fā)有極其重要的作用，同時也有利于提高食用菌的經(jīng)濟(jì)效益。本方法從雞腿菇綜合利用的角度出發(fā)，同時制備雞腿菇多糖和呈味物質(zhì)，有利于提高雞腿菇的利用率，提高其原料的附加值。
具體實施例方式本發(fā)明使用的雞腿菇子實體購于上海百信生物科技有限公司；本發(fā)明使用的風(fēng)味酶購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司； 本發(fā)明使用的木瓜蛋白酶購于Sigma-Aldrich公司(批號039kl451)；本發(fā)明使用的纖維素酶購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號F20110526)實施例I稱取雞腿菇干粉2g于50mL錐形瓶中，按照料液比I :20加入蒸餾水，充分浸泡25min后，風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶添加量為O. 5% (W/V) (I: I: I )，50°C反應(yīng)4h，酶解完畢后沸水浴滅酶活20min，離心過濾，收集濾液，按濃縮比1:3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，然后加無水乙醇至乙醇終濃度分別為40%、60%、70%，4°C靜置12h，4000rpm離心15min，沉淀用相應(yīng)濃度乙醇洗滌2次，冷凍干燥，測定粗多糖含量與得率。實驗結(jié)果40%、60%、70% 多糖含量分別為 89. 7%, 72. 2%, 59. 9% ;得率分別為 3. 1%、4· 6%、6. 8% ;游離氨基酸的量分別為39. 5,28. 3,32. 2mg/g ;可溶性固形物的量分別為I. 5、I. 2、1.3。Brix0其中的游離氨基酸的量可采用茚三酮比色法測定。其中的可溶性固形物可采用手持式數(shù)顯糖度計測定實施例2稱取雞腿菇干粉2g于50mL錐形瓶中，按照料液比I :20加入蒸餾水，充分浸泡30min后，添加風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，置于一定溫度水浴反應(yīng)一定時間，酶解完畢后沸水浴滅酶活15min，離心過濾，收集濾液，按濃縮比1:3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，然后加無水乙醇至乙醇終濃度為70%，4°C靜置8h，4000rpm離心15min，上清定容至50mL，測定可溶性固形物的量，然后再稀釋至合適濃度測定游離氨基酸的量，沉淀70%乙醇洗滌一次，冷凍干燥，測定粗多糖得率。按O. 5% (W/V)量添加風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三種酶的質(zhì)量比例為1: 1: 1，先50°c反應(yīng)2h，沸水滅酶活后，過濾，收集濾液，濾渣按料液比1:15加蒸餾水，于100°C反應(yīng)2h，4000rpm離心15min合并濾液。實驗結(jié)果游離氨基酸量為34. 7mg/g，可溶性固形物量在I. 7° Brix ;粗多糖得率為7. 7%。實施例3體外刺激巨噬細(xì)胞生成NO實驗本實施例中RAW264. 7骨髓巨噬細(xì)胞株，購自美國國家菌種保藏中心(ATCC numberTIB-71 )；本實施例中DMEM、RPMI1640購于GIBCO公司。供試樣品的配制精確稱取實例2制備的雞腿菇子實體粗多糖樣品于滅菌的印pendorf管中，用PBS緩沖液配置成濃度5mg/mL。充分溶解后以12000rpm/min離心30min,無菌條件下轉(zhuǎn)移至新的無菌印pendorf管中，將樣品稀釋成50、200、500 μ g/mL待用。陰性對照為PBS緩沖液，陽性對照為10 μ g/mL LPS溶液。小鼠RAW264. 7巨噬細(xì)胞的制備用DMEM培養(yǎng)基在37 °C、5%C02條件下傳代培養(yǎng)后，用O. 25%胰蛋白酶消化，混懸液300 X g離心3min后收集細(xì)胞，用無色RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到一定濃度備用。巨噬細(xì)胞釋放NO活性的測定由于NO極不穩(wěn)定，在體內(nèi)很快生成亞硝酸基(N02—)和硝酸基(N03—)，故采用Griess法測定樣品中的N027N03—作為衡量NO水平的指標(biāo)。(I)用亞硝酸鈉制標(biāo)準(zhǔn)曲線配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μΜ共9個濃度梯度；取100μ L于96孔板，加入50 μ L Griess試劑，測定543nm吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線每個濃度3個重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) NO產(chǎn)量測定巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液消化完畢后用無色RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%抗生素液體)將細(xì)胞稀釋至5 X 105/ml，每孔180 μ L加入96孔板，然后再加入20 μ L各濃度待測樣品和陰性(PBS)、陽性(LPS，10 μ g/mL)對照，于37°C、含5%的C02條件下培養(yǎng)48h后，取100 μ L培養(yǎng)上清于96孔板，加入50 μ L Griess試劑，顯色I(xiàn)Omin后，于波長543nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的NO量。實驗結(jié)果雞腿菇子實體粗多糖在濃度50 μ g/mL時，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的量(單位μ moL/5. OX IO5Cells)為23. 91 ;在濃度 200 μ g/mL 時，產(chǎn)生 NO 量為 42. 61 ;在濃度500 μ g/mL時，產(chǎn)生NO量為69. 68，陰性對照7. 89，陽性對照(濃度I μ g/mL) 63. 26，樣品組顯著高于陰性對照活性(P〈0. 05)，粗多糖在500 μ g/mL時活性高于陽性對照LPS，表現(xiàn)出良好的刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO活性。
權(quán)利要求
1.一種雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)，其特征在于是用如下方法制備得到的 復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0%(w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ; 水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ； 醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，4-20°C下，靜置8-12h，離心，沉淀即為雞腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即為呈味物質(zhì)； 其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三者質(zhì)量比例為
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)，其特征在于是用如下方法制備得到的 ①提取將雞腿菇子實體于50-60°C烘干后粉碎過200目篩網(wǎng)，按料液比1:15-1:20加入蒸餾水充分浸泡20-30min，然后添加O. 5%_3. 0%(w/v)的復(fù)合酶，于50°C _60°C反應(yīng)l_4h，沸水滅酶活15-20min，過濾得到濾渣和濾液I ; ②濾渣再按1:15-1:20添加蒸餾水，于1001反應(yīng)l_2h，過濾，收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ； ③提取液濃縮將濾液2按照濃縮比1:3進(jìn)行濃縮； ④乙醇醇沉向上述濃縮液里添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，充分?jǐn)噭蚝笥?-20°C，靜置8-12h，離心，沉淀用70%乙醇洗滌1_2次，即為雞腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即得雞腿菇中呈味物質(zhì)； ⑤干燥將沉淀用5-10倍蒸餾水溶解后，水浴揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得雞腿菇粗多糖；呈味物質(zhì)按料液比1:25濃縮備用。
3.一種制備權(quán)利要求I或2中任一項所述雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)的方法，其特征在于該方法為 復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0%(w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ; 水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ； 醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，4-20°C下，靜置8-12h，離心，沉淀即為雞腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即為呈味物質(zhì)； 其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三者質(zhì)量比例為
4.一種雞腿菇子實體多糖，其特征在于是用如下方法制備得到的 復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0%(w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ; 水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ；醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，4-20°C下，靜置8-12h，離心，沉淀即為雞腿菇多糖； 其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三者質(zhì)量比例為
5.一種雞腿菇子實體呈味物質(zhì)，其特征在于是用如下方法制備得到的 復(fù)合酶提取將雞腿菇子實體粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入O. 5%-3. 0%(w/v)的復(fù)合酶，于50°C -60°C反應(yīng)l_4h ;酶滅活，過濾得到濾渣和濾液I ; 水提濾渣再按1:15-1:20添加水，于90-1201反應(yīng)l_2h，過濾；收集濾液并與濾液I合并作為濾液2 ； 醇沉將濾液2進(jìn)行濃縮，然后添加無水乙醇，至乙醇的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到40-80%，4-20°C下，靜置8-12h，離心，上清液回收乙醇，水相部分即為呈味物質(zhì)； 其中所述的復(fù)合酶為風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶，三者質(zhì)量比例為
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞腿菇子實體多糖與呈味物質(zhì)及其制備方法，該多糖與呈味物質(zhì)是通過復(fù)合酶提取、水提、醇沉的方法制備得到的。該方法實現(xiàn)了多糖和呈味物質(zhì)的同時制備，提高了雞腿菇子實體原料的利用率，且制備的雞腿菇子實體多糖能夠顯著地刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO活性。
文檔編號A23L1/221GK102860494SQ201210362978
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者吳迪, 楊焱, 顏夢秋, 張勁松, 谷鎮(zhèn), 劉艷芳, 周帥, 馮娜 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院