專利名稱：鮑魚內臟多糖替代血清在細胞培養(yǎng)基中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然高分子領域，具體地涉及鮑魚內臟多糖替代血清在細胞培養(yǎng)基中的應用。
背景技術：
鮑魚(Haliotis spp.)屬軟體動物門，腹足綱,原始腹足目，鮑科,鮑屬，為藻食性動物，是我國傳統(tǒng)的海珍品，其氨基酸含量全面、脂肪和膽固醇的含量很低，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。鮑魚內臟占鮑魚總重的15 25%，作為鮑魚加工過程中的副產(chǎn)物，利用價值極低，亟待開發(fā)其高值化利用方法，提高經(jīng)濟價值，促進鮑魚養(yǎng)殖行業(yè)的良性持續(xù)發(fā)展。鮑魚內臟多糖是鮑魚內臟的主要組成部分，其結構受鮑魚種類和生長環(huán)境而有所不同。近年來，有研究報道從大連產(chǎn)鮑魚內臟中提取的鮑魚內臟多糖其具有抗腫瘤，提高機體免疫力，抗氧化等多種生理活性；而從青島產(chǎn)鮑魚內臟中提取的鮑魚內臟多糖具有改善 四氯化碳致急性肝損傷大鼠的肝功能等活性。伴隨著動物細胞培養(yǎng)和人工臟器工學的發(fā)展，培養(yǎng)基的質量要求越來越高。而大多數(shù)動物細胞的培養(yǎng)離不開血清，目前培養(yǎng)基中使用的血清主要來源于小?；蛱ヅ?，不僅價格昂貴，而且其成分復雜，含有激素類物質，易受到細菌、霉菌、支原體和病毒等的污染，特別是近年來動物源性疾病，如瘋牛病、口蹄疫等病毒性疾病的問題越來越嚴重，，因此血清成為細胞培養(yǎng)工學和人工臟器工學發(fā)展的瓶頸，急需一種安全可靠的血清替代物，以解決上述問題。本發(fā)明涉及到一種來源于鮑魚內臟的多糖，其替代血清用于細胞培養(yǎng)，為血清替代物及組織工學研究提供新的思路。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是在于需要提供一種用于替代血清的活性物質，其在保證不影響細胞的正常生長的條件下，不會帶來任何不良作用，從而彌補現(xiàn)有技術上的不足。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種鮑魚內臟多糖替代血清在細胞培養(yǎng)基中應用，鮑魚內臟多糖可替代血清保證細胞的正常生長，對細胞生長無不良作用。所述的鮑魚內臟多糖組成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述的鮑魚內臟多糖主鏈結構中含有一3)-β -D-GlcpA-(I — 4)-a -L-Rhap-(3S04)-(I —，一 3) - β -D-GlcpA-(l — 4)-α -L-Rhap-(2S04)-(1 —兩種結構單元，兩種單元數(shù)量比例為2:1。進一步，所述的鮑魚內臟多糖在細胞培養(yǎng)基中替代部分血清。


附圖I細胞計數(shù)法測定鮑魚內臟多糖對總細胞個數(shù)的影響。附圖2MTT法測定鮑魚內臟多糖對細胞存活率的影響a鮑魚內臟多糖加樣24h后對細胞存活率的影響；b鮑魚內臟多糖加樣48h后對細胞存活率的影響，c鮑魚內臟多糖加樣72h后對細胞存活率的影響，其中柱狀圖上的*表示與正常組相比差異顯著。附圖3不同鮑魚內臟多糖濃度梯度添加對替代血清的影響a鮑魚內臟多糖濃度梯度添加24h后對替代血清的影響；b鮑魚內臟多糖濃度梯度添加48h后對替代血清的影響，其中柱狀圖上的#表示與10%血清組相比，差異顯著；*表示與2%血清組相比，差異顯著;附圖4血清及鮑魚內臟多醣梯度添加對替代血清的影響
具體實施例方式下面通過實施例結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方式。但本發(fā)明的技術方案不受實施例任何形式的限制。 實施例I鮑魚內臟多糖的制備將干鮑魚內臟磨粉，加入O. IM乙酸鈉緩沖溶液(pH6. 0),0. I倍樣品質量的木瓜蛋白酶、5mM EDTA溶液和5mM半胱氨酸溶液，于60°C水浴下攪拌反應24h之后，反應混合物離心獲得上清液，即鮑魚內臟酶解液，隨后向上清液中加入終濃度為10%的陰離子表面活性劑溶液，室溫下放置24小時后，離心，棄上清，沉淀溶解于3MNaCl和乙醇以體積比為100 15的混合溶液中，再加入2倍體積的95%乙醇溶液，4°C放置24小時，離心，沉淀用80%和95%乙醇洗2-3次，最后將沉淀于60°C干燥2小時，蒸餾水溶解，用透析袋透析并脫鹽，濃縮，凍干，得鮑魚內臟粗多糖；隨后鮑魚內臟粗多糖經(jīng)過DEAE-52陰離子交換層析和S-200凝膠過濾層析進行分離純化，得到的物質即為所述鮑魚內臟多糖。通過化學分析和光譜分析確定本發(fā)明中的鮑魚內臟臟多糖成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述鮑魚內臟多糖主鏈有一3) - β -D-GlcpA-(I — 4) - a -L-Rhap- (3S04)-(I —，一 3)-β-D-GlcpA-(I — 4)-α-L-Rhap-(2S04)_ (I —兩種結構單元，兩種結構單元數(shù)量比例為2:1實施例2鮑魚內臟多糖對H印G2細胞的增殖作用(I)細胞計數(shù)將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)制成密度為5 X IO4個iL-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內，IOOyL/孔。待24h貼壁后加入 200 μ L/ 孔的濃度分別為 50 μ g · mL—1,100 μ g · mL—1, 200 μ g · mL—1 和 400 μ g · mL—1多糖的培養(yǎng)液，每個濃度設4個復孔?？瞻讓φ战M加等量不含多糖的完全培養(yǎng)基。在37、5%C02條件下培養(yǎng)24h后，用IX-51型倒置熒光顯微鏡計數(shù)。(2) MTT 法測定將處于對數(shù)生長期的H印G2細胞，用RPMI - 1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)制成密度為2 X IO4個iL-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內，IOOyL/孔。待24h貼壁后更換成濃度分別為50、100、200和400 μ g · mL—1多糖的完全培養(yǎng)基，每個濃度設4個復孔，200 μ L/孔?？瞻讓φ战M加等量不含多糖的完全培養(yǎng)基。37°C、5%C02條件下分別培養(yǎng)24h、48h和72h后，棄去培養(yǎng)基，加入MTT液(PBS液配制，終濃度為O. 5mg · mL—1)。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，加入酸化異丙醇，吹打至藍色結晶物完全溶解，酶標儀測570nm各孔吸光度(A)0 MTT/%=A570 (樣品組)/A570 (空白對照組)X 100%。(3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計
實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17. O統(tǒng)計軟件進行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值土標準差(M±SD)表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P < O. 05表示有統(tǒng)計學差異。(4)實驗結果結果見圖I和圖2a、2b、2c，細胞計數(shù)顯示，鮑魚內臟多糖組的總細胞個數(shù)明顯高于空白對照組；MTT數(shù)據(jù)也表明鮑魚內臟多糖處理組細胞存活率顯著高于對照組，兩組數(shù)據(jù)均且呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系，說明其對細胞的正常生長無副作用，且具有一定的細胞增殖效果。實施例3不同鮑魚內臟多糖濃度梯度添加對替代血清的影響(I)實驗方法細胞布板方式如實施例I。待24h貼壁后更換為含2%血清，濃度分別為50、20和IOyg- ml/1鮑魚內臟多糖的培養(yǎng)液，每個濃度設4個復孔，200 μ L/孔。分別以加等量含 10%血清的完全培養(yǎng)基組為空白對照組，加等量的含2%血清濃度的培養(yǎng)基組作為模型組。37°C、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24h和48h，測定各組細胞存活率。(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17. O統(tǒng)計軟件進行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值土標準差(M±SD)表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P < O. 05表示有統(tǒng)計學差異。(3)實驗結果結果見圖3a、3b，2%血清處理組細胞存活率低于正常組，加入鮑魚內臟多糖后，細胞存活率均呈現(xiàn)顯著的增加，且呈現(xiàn)顯著的劑量-效應關系。當多糖濃度降低到10 μ g -mL-1時，仍表現(xiàn)出促細胞增殖活性，增殖效率接近于正常組。以上結果顯示，在含2%牛血清培養(yǎng)基中，鮑魚內臟多糖在IOyg 添加量時細胞生長和增殖與10%血清相當，可替代8%牛血清。實施例4血清及多糖梯度添加對替代血清的影響(I)實驗方法細胞布板方式如實施例I。待24h貼壁后更換為含2%、4%、6%和8%血清且對應多糖含量分別為的培養(yǎng)液，每個濃度設4個復孔，200 μ L/孔。分別以加等量含10%血清的完全培養(yǎng)基組和對應血清含量組為空白對照組。37°C、5%C02條件下分別培養(yǎng)48h，測定各組細胞存活率。(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17. O統(tǒng)計軟件進行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值土標準差(M±SD)表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P < O. 05表示有統(tǒng)計學差異。(3)實驗結果結果見圖4，與10%血清處理組相比，單純的血清梯度遞減的細胞存活率呈現(xiàn)梯度減小的趨勢，但鮑魚內臟多糖在10、8、6、4μ g .mL-1添加量，血清含量分別為2%、4%、6%和8%時細胞生長和增殖與10%血清相當，細胞生長恢復正常。說明10、8、6、4μ gmr1的鮑魚內臟多糖分別可以替代8%、6%、4%和2%的血清，用于細胞培養(yǎng)。所有上述的首要實施這一知識產(chǎn)權，并沒有設定限制其他形式的實施這種新產(chǎn)品和/或新方法。本領域技術人員將利用這一重要信息，上述內容修改，以實現(xiàn)類似的執(zhí)行情況。但是，所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權利。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等 效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。
權利要求
1.一種鮑魚多糖替代血清在細胞培養(yǎng)基中的應用，該鮑魚內臟多糖組成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述的鮑魚內臟多糖主鏈結構中含有一3)-β -D-GlcpA-(I -4)-α -L-Rhap- (3S04) _ (I —，一 3) - β -D-GlcpA-(I — 4) _ a -L-Rhap- (2S04) - (I —兩種結構單元，兩種單元數(shù)量比例2:1。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種鮑魚多糖替代血清在細胞培養(yǎng)基中的應用，其特征在于鮑魚內臟多糖在細胞培養(yǎng)基中的替代部分血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鮑魚內臟多糖代替血清在細胞培養(yǎng)基中的應用，在細胞培養(yǎng)基中該鮑魚內臟多糖可以代替部分血清，且能維持細胞的正常生長，無毒副作用。
文檔編號C12N5/00GK102839149SQ20121035183
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權日2012年9月21日
發(fā)明者王玉明, 武風娟, 薛勇, 李兆杰, 王靜鳳, 常耀光, 徐杰, 唐慶娟, 薛長湖 申請人:中國海洋大學