專利名稱：制備、分離及超低溫保存子宮內(nèi)膜/月經(jīng)細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本案主張美國臨時(shí)申請案2007年3月I日申請的第60/904，836，2007年3月20日申請的第60/918，961號，2007年9月17日申請的第60/994，166號，2007年10月9日申請的第60/998，255號，2008年I月22日申請的第61/011，881號及2008年2月29日申請的第—號的優(yōu)先權(quán)，前述姆一案的名稱為"Procurement, Isolation, and Cryopreservationof Endometrial/Menstrual Cells"其整體內(nèi)容系以引用方式并入本文。本發(fā)明通常涉及關(guān)于獲得月經(jīng)干細(xì)胞(MSC)的方法、制程及系統(tǒng)。本發(fā)明尤其涉及關(guān)于取得及處理月經(jīng)期間所獲得的血液、體液及組織以分離及收集月經(jīng)干細(xì)胞群的方法、制程及系統(tǒng)，這些月經(jīng)干細(xì)胞可經(jīng)超低溫保存或經(jīng)由各種培養(yǎng)及選擇步驟進(jìn)ー步處理以獲得為超低溫保存或?yàn)橹委熁蛩帄y用途作準(zhǔn)備的MSC。本發(fā)明還涉及關(guān)于包含至少ー個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)組合物。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞固有地具有經(jīng)由控制細(xì)胞與細(xì)胞接觸及內(nèi)在信號而經(jīng)歷活體內(nèi)細(xì)胞分裂及細(xì)胞分化的能力。已顯示干細(xì)胞能藉由經(jīng)局部環(huán)境因子刺激來控制細(xì)胞接觸及內(nèi)在信號而活體外分裂及分化成多種細(xì)胞。應(yīng)了解，干細(xì)胞可獲自若干來源，包括多種成人組織(諸如骨髄)以及胚胎組織。某些干細(xì)胞表達(dá)為c-kit受體、青灰因子(Steel factor)受體及干細(xì)胞因子受體的抗原因子CD117。c-kit的基因編碼干細(xì)胞因子(SCF)的酪胺酸激酶生長因子，其亦稱為肥大細(xì)胞生長因子且為血細(xì)胞生成、黑素生成及生育力所必需。應(yīng)了解，⑶117在造血干細(xì)胞、肥大細(xì)胞、生殖細(xì)胞、黑素細(xì)胞、某些基底上皮細(xì)胞、乳房的腔室上皮細(xì)胞及胃腸道的Cajal間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。⑶117在生殖細(xì)胞確立、維持及功能方面具有關(guān)鍵作用。研究指示在胚胎性腺中，CD117及其相應(yīng)配位體SCF為原胚生殖細(xì)胞存活及増殖所必需。另外，研究指示CD117及其相應(yīng)配位體SCF為響應(yīng)促性腺激素產(chǎn)生配子所必需。換言之，與配位體SCF組合的CD117為睪丸生殖細(xì)胞、精原細(xì)胞的存活和増殖以及為卵母細(xì)胞的生長和成熟所必需。研究還指示⑶117為活體外原始造血細(xì)胞増殖的有效生長因子。干細(xì)胞的治療應(yīng)用以骨髓的早期實(shí)驗(yàn)起始。近一個(gè)世紀(jì)前，醫(yī)師將骨髓經(jīng)ロ投于患有貧血及白血病的患者。盡管該療法并不成功，但實(shí)驗(yàn)室研究者最終證實(shí)可以將取自其它小鼠的骨髓輸注至具有缺陷性骨髄的小鼠的血流中而使其恢復(fù)健康。這促使醫(yī)師推測將骨髓自一人移植至另一人(同種異體移植)是否可行。來自骨髓及臍帶的干細(xì)胞已廣泛地主要用于造血移植以治療多種疾病。自利用骨髄的第一干細(xì)胞移植出發(fā)，已鑒別出干細(xì)胞的其它來源，包括羊水、胎盤、臍帶、帶內(nèi)膜、花頓氏膠(Wharton' s Jelly)、脂肪及上皮細(xì)胞。
當(dāng)研究者遇到由細(xì)胞的身體排斥反應(yīng)(稍后表征為移植物抗宿主疾病(GVHD))所引起的疾病及/或死亡時(shí)，人類免疫系統(tǒng)的作用，亦即防衛(wèi)本身免受感染及外來物質(zhì)的身體固有機(jī)制，成為早期移植中的關(guān)鍵考慮因素。直至發(fā)現(xiàn)人類組織兼容性抗原與人類免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系之后才以較大規(guī)模嘗試在人類中進(jìn)行骨髄移植。體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞表面上所發(fā)現(xiàn)的這些蛋白質(zhì)被稱為人類白血球抗原或HLA抗原。身體免疫系統(tǒng)使用這些HLA抗原以鑒別哪些細(xì)胞屬于體內(nèi)且哪些不屬干。每當(dāng)免疫系統(tǒng)不識別細(xì)胞上的抗原時(shí)，其即產(chǎn)生抗體及破壞細(xì)胞的其它物質(zhì)。身體尋找且破壞的對象為致感染細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞及外來對象(諸如碎片)。以此方式，免疫系統(tǒng)防衛(wèi)身體抵抗可進(jìn)入體內(nèi)且引起損害的物質(zhì)。視治療所靶向的疾病病況而定，利用個(gè)體自身干細(xì)胞的自體移植可具有由準(zhǔn)確HLA匹配效益所產(chǎn)生的某些潛在優(yōu)勢。供體與受體的HL A抗原匹配愈接近，所捐贈骨髄的T細(xì)胞(免疫系統(tǒng)細(xì)胞)將反抗患者身體的可能性愈小。
來源于骨髓的成人干細(xì)胞的移植已成功用于治療人類疾病，諸如范康尼氏貧血(Fanconi / s Anemia)、再生障礙性貧血、急性及慢性白血病、脊髓增生性病癥、骨髄發(fā)育不良癥候群、淋巴增生性病癥及其它惡性疾病。骨髄成人干細(xì)胞的替代性來源包括外周血液祖細(xì)胞、臍帶血及自這些來源收集的間質(zhì)干細(xì)胞。然而，存在與成人干細(xì)胞的治療用途相關(guān)的若干缺點(diǎn)。已顯示成人干細(xì)胞具有有限功效，諸如在培養(yǎng)中的若干繼代后生長緩慢及多能性損失。胚胎干細(xì)胞已證實(shí)増殖潛力使其適合于細(xì)胞療法。然而，已顯示人類胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生畸胎瘤。另外，自胚胎收集干細(xì)胞部分由于在收集過程中破壞生長中的胚胎而受到倫
通關(guān)注。已鑒別干細(xì)胞的其它來源，其克服至少ー些與成人及胚胎干細(xì)胞相關(guān)的問題。ー種來源為含有人類成人干細(xì)胞的臍帶血。臍帶血已出于若干原因而證實(shí)為干細(xì)胞的可行來源。臍帶血相對容易在分娩小孩期間取得且經(jīng)處理以供超低溫保存。臍帶血提供能細(xì)胞分裂及分化成多種細(xì)胞類型的干細(xì)胞的合適來源。來源于臍帶血的干細(xì)胞已在臨床背景下使用以作為骨髓替代者來治療若干已知人類病癥及疾病。詳言之，來源于臍帶血的干細(xì)胞已成功用于造血移植、造血重建及治療脊髓損傷。另外，已顯示來源于臍帶血的干細(xì)胞在動物模型中逆轉(zhuǎn)中風(fēng)及心肌梗塞的效應(yīng)。已確定子宮內(nèi)膜/月經(jīng)干細(xì)胞(MSC)證實(shí)在培養(yǎng)物中與胚胎干細(xì)胞類似的増殖能力。MSC亦展現(xiàn)某些間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記及某些胚胎干細(xì)胞標(biāo)記，其證實(shí)活體外及活體內(nèi)多能性能力的潛力。MSC用作干細(xì)胞來源出于若干原因系有益的。首先，MSC證實(shí)分化成特定細(xì)胞譜系的能力。其次，任何倫理關(guān)注或考慮因素系藉由收集另外視為廢棄的MSC而得以緩和。最后，在月經(jīng)周期期間取得MSC的制程對供體相對不賦予危險(xiǎn)性。相信，不存在關(guān)于收集MSC抑或取得合適樣本量的MSC的已知方法，及適用于獲得表現(xiàn)某些間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記及/或某些胚胎樣抗原因子(尤其由MSC表現(xiàn)的細(xì)胞表面因子)的活的、最大產(chǎn)量MSC的相關(guān)處理及細(xì)胞收集方法。因此，目前需要收集合適量的存在于月經(jīng)期間排出的體液、血液及組織中的MSC以為即期運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室作準(zhǔn)備的方法，該實(shí)驗(yàn)室處理月經(jīng)體液、血液及組織以分離及超低溫保存或處理MSC。目前亦需要處理月經(jīng)體液、血液及組織以獲得來源于月經(jīng)血液、體液及組織的MSC的細(xì)胞制劑的方法。亦進(jìn)ー步需要自月經(jīng)流分離、選擇及/或培養(yǎng)MSC以為超低溫保存、進(jìn)ー步處理或治療用途作準(zhǔn)備，諸如，可表現(xiàn)包含⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的細(xì)胞表面標(biāo)記或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記中的至少ー者，而表現(xiàn)較低量或不表現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記CD3及HLA II類中的至少ー者的細(xì)胞。其它細(xì)胞標(biāo)記特征系以實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施例的結(jié)果提供。更進(jìn)一歩需要超低溫保存獲得及收集自月經(jīng)血液、體液及組織的MSC或特異性MSC的群。

發(fā)明內(nèi)容
目前需要易于收集、處理及超低溫保存且具有治療、藥妝或其它用途的潛力的干細(xì)胞來源。本發(fā)明的方法、制程及組合物滿足此需要。本發(fā)明提供獲得月經(jīng)干細(xì)胞的方法。在一實(shí)施例中，該方法包含自月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含以離心、密度梯度離心、過濾或沉降的至少ー個(gè)步驟處理該月經(jīng)流。分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟亦可視情況包
含以包含至少ー種抗生素的溶液凈化該等月經(jīng)干細(xì)胞。在該實(shí)施例中，該方法包含處理分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的另一步驟。處理分離自月經(jīng)流樣本的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟可包含至少ー個(gè)以下步驟針對某些細(xì)胞表面標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞，或培養(yǎng)來自月經(jīng)干細(xì)胞的處理后樣本、所選樣本或解凍樣本的月經(jīng)干細(xì)胞。在一實(shí)施例中，處理分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含針對至少ー種包含CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 類的細(xì)胞標(biāo)
記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。所選細(xì)胞可藉由培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞來進(jìn)ー步處理。可接著使所培養(yǎng)的月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受針對至少ー種包含⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的又一步驟?？墒顾x月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受培養(yǎng)該等月經(jīng)干細(xì)胞的又ー步驟。在選擇或培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟之后的任ー時(shí)亥IJ，可使該等月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受制備供超低溫保存或供治療或藥妝用的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。可接著將已準(zhǔn)備超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞超低溫保存且稍后解凍以供使用。在另ー實(shí)施例中，處理自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞?？山又顾囵B(yǎng)的月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受針對某些細(xì)胞表面標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。可接著使所選月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受培養(yǎng)該等月經(jīng)干細(xì)胞的又ー步驟?？山又惯M(jìn)ー步培養(yǎng)的月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受針對細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的另ー步驟。在選擇或培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟之后的任ー時(shí)刻，可使該等月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受制備供超低溫保存或供治療或藥妝用的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟?？山又鴮⒁褱?zhǔn)備超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞超低溫保存且稍后解凍以供使用。在又一實(shí)施例中，處理自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。在另ー實(shí)施例中，處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含制備包含月經(jīng)干細(xì)胞及維持月經(jīng)干細(xì)胞的生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物的又一步驟。在又一實(shí)施例中，處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含制備包含月經(jīng)干細(xì)胞及藥妝制劑的組合物的又一步驟。在又一實(shí)施例中，可將經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞解凍以為進(jìn)一步處理作準(zhǔn)備，該進(jìn)ー步處理包含培養(yǎng)或選擇月經(jīng)干細(xì)胞的至少ー個(gè)步驟?；蛘撸蓪⒔?jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞解凍以為治療或藥妝用途作準(zhǔn)備。
本發(fā)明亦提供自月經(jīng)流收集月經(jīng)干細(xì)胞的制程。在一實(shí)施例中，該制程包含在月經(jīng)周期期間取得月經(jīng)流，將該月經(jīng)流輸送至處理設(shè)施中，將月經(jīng)干細(xì)胞自月經(jīng)流分離成細(xì)胞制劑，及處理月經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞制劑。本發(fā)明亦提供自月經(jīng)流收集月經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)。在一實(shí)施例中，該系統(tǒng)包含一月經(jīng)干細(xì)胞分離器，其中月經(jīng)干細(xì)胞分離器將月經(jīng)干細(xì)胞自月經(jīng)流分離；一月經(jīng)干細(xì)胞收集器，其中該月經(jīng)干細(xì)胞收集器收集月經(jīng)干細(xì)胞；及一月經(jīng)干細(xì)胞處理器，其中該月經(jīng)干細(xì)胞處理器制備供治療用或供超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明提供超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的方法。在一實(shí)施例中，該方法包含以下步驟自月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞，收集自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞，及超低溫保存自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞。包括自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟的超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的方法包含由離心、密度梯度離心、過濾或沉降的至少ー個(gè)步驟處理月經(jīng)流。分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟亦可視 情況包含以包含至少ー種抗生素的溶液凈化該等月經(jīng)干細(xì)胞。該方法可包含在至少ー個(gè)超低溫保存或進(jìn)ー步細(xì)胞培養(yǎng)的步驟之前的至少ー個(gè)針對細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。該方法可包含至少又ー培養(yǎng)所選月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。包括收集自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟的超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的方法包含至少ー個(gè)培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。該方法可包含至少ー個(gè)自細(xì)胞培養(yǎng)物選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。本發(fā)明提供藉由包含以下步驟的制程所獲得的月經(jīng)干細(xì)胞的群自月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞及收集自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明提供富集自月經(jīng)流所收集的月經(jīng)干細(xì)胞群的制程。在一實(shí)施例中，該制程包含自月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞及收集自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。該制程包含至少ー個(gè)針對包含 CD9、CD 10、CD 13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、⑶105、⑶166及HLA I類的群的至少ー個(gè)細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。該制程可包含至少ー個(gè)培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。該制程可包含至少ー個(gè)選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟及至少ー個(gè)培養(yǎng)所選月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟亦可視情況包含以包含至少ー種抗生素的溶液凈化該等月經(jīng)干細(xì)胞。在替代者中，該制程可包含至少ー個(gè)培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟及至少ー個(gè)自細(xì)胞培養(yǎng)物選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。本發(fā)明提供富集月經(jīng)干細(xì)胞群的制程。在一實(shí)施例中，該制程包含以下步驟自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞，收集自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞及選擇表現(xiàn)與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記的月經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明提供包含細(xì)胞標(biāo)記中的至少ー者的月經(jīng)干細(xì)胞群，該等細(xì)胞標(biāo)記包含⑶9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 類。本發(fā)明提供包含月經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞富集群，該等月經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)包含⑶9、⑶10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類的細(xì)胞標(biāo)記中的至少一者，且較低表現(xiàn)或不表現(xiàn)包含細(xì)胞標(biāo)記⑶3及HLAII類中的至少ー者的細(xì)胞標(biāo)記。本發(fā)明提供包含至少ー個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及超低溫保存劑的組合物。本發(fā)明提供包含至少ー個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物。本發(fā)明提供包含至少ー個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及藥妝劑的組合物。
本發(fā)明提供包含至少ー個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及維持細(xì)胞生存力的保存劑的組合物。本發(fā)明提供包含至少ー個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物，其系于容器中以為該至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞的治療用途作準(zhǔn)備。
根據(jù)本發(fā)明所收集的細(xì)胞可在治療、藥妝或再生醫(yī)學(xué)或其它合適應(yīng)用中使用。本發(fā)明提供以下方法及制程收集包含月經(jīng)血液、體液、細(xì)胞及組織的月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本；藉由將月經(jīng)流樣本與收集培養(yǎng)基組合來制備供輸送用的月經(jīng)流；及將該月經(jīng)流樣本輸送至處理設(shè)施中，在此處理月經(jīng)流樣本以分離、收集及處理供超低溫保存或供治療或藥妝用的MSC。本發(fā)明亦提供以產(chǎn)生高產(chǎn)量的活MSC的方式分離、收集及濃縮MSC的方法及制程。
在一實(shí)施例中，選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟可包括陽性選擇表現(xiàn)與月經(jīng)干細(xì)胞一起存在的細(xì)胞標(biāo)記中的至少ー者的細(xì)胞。在一替代者中，選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟可包含藉由移除表現(xiàn)不與月經(jīng)干細(xì)胞一起存在的細(xì)胞標(biāo)記的不合需要細(xì)胞來陰性選擇細(xì)胞。陰性選擇可包含選擇表現(xiàn)(例如)CD45或不存在于月經(jīng)干細(xì)胞上的其它細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞。在又一實(shí)施例中，選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟可包含使用市售耗盡或濃縮套組，諸如來目 btem Cell i'echnologies, Inc.的 RosetteSep、Easybep、Robobep > btemSep 或SpinSep0在又一實(shí)施例中，選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟可包含使用ALDEFLUOR (Aldagen, Inc.)選擇月經(jīng)干細(xì)胞以選擇MSC且排除無完整細(xì)胞膜的死亡及/或?yàn)l死細(xì)胞。ALDEFLUOR 套組可用于選擇對與月經(jīng)干細(xì)胞一起存在的表面標(biāo)記呈陽性的ALDHblr細(xì)胞、譜系-抗原陰性(LirT)細(xì)胞、群落形成細(xì)胞、長期培養(yǎng)起始細(xì)胞及N0D/SCID再生細(xì)胞。在又一實(shí)施例中，選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟可包含使該等月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受血清脫除歷時(shí)約2周至約4周以濃縮表現(xiàn)相關(guān)MSC標(biāo)記的MSC。一旦收集且培養(yǎng)細(xì)胞，即應(yīng)消除造血干細(xì)胞。


圖I為一般說明本發(fā)明的總體方法及制程的流程圖；圖2為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的一實(shí)施例的流程圖；圖3為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖4為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖5為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖6為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖7為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖8為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖9為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖10為展示收集及超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖11為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的一實(shí)施例的流程圖；圖12為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又ー實(shí)施例的流程圖；圖13為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又ー實(shí)施例的流程圖；圖14為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又ー實(shí)施例的流程圖；圖15為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又ー實(shí)施例的流程
圖16為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖17為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖18為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又ー實(shí)施例的流程圖；圖19為展示收集月經(jīng)干細(xì)胞及制備供治療用的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖20為展示解凍超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞以為治療用途作準(zhǔn)備的本發(fā)明的ー實(shí)施例的流程圖；圖21為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖22為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖23為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖24為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖25為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖26為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖27為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的另ー實(shí)施例的流程圖；圖28為展示制備供治療用的經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明的又一實(shí)施例的流程圖；圖29a至圖29j展示處理后樣本及關(guān)于如下所述的M2-01的同型的流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。自M2-01收集約Iml細(xì)胞懸浮液形式的處理后樣本且將其置于分析管中以供流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果指示占TNC群O. 4%的⑶117+細(xì)胞的濃度、占TNC群17. 7%的⑶44+細(xì)胞的濃度、占TNC群3. 6%的⑶166+細(xì)胞的濃度、占TNC群8. 0%的⑶105+細(xì)胞的濃度、占TNC群6. 8%的⑶90+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. I %的⑶29+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. I %的⑶34+細(xì)胞的濃度，及如由7AAD所測定的95. 4%細(xì)胞生存力；
圖30a至圖30e展示關(guān)于經(jīng)由本發(fā)明的CD117選擇方法所獲得的陽性溶離份中的細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。CD117選擇的后，收集約Iml細(xì)胞懸浮液且將其置于分析管中以供流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果指示占TNC群7. 2%的⑶117+細(xì)胞的濃度、占TNC群93. 6%的CD44+細(xì)胞的濃度及由7AAD所測定的95. 8%細(xì)胞生存力。結(jié)果系藉由根據(jù)本發(fā)明的流式細(xì)胞儀分析來運(yùn)作處理樣本且減去以與IgG抗體的同型一起運(yùn)作的處理后樣本所獲得的背景計(jì)算值來計(jì)算；圖31a至圖31cc說明處理后樣本及關(guān)于如下所述的M2-02C的同型的流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。收集約Iml細(xì)胞懸浮液形式的處理后樣本且將其置于分析管中以供流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果指示占TNC群O. 2%的⑶117+細(xì)胞的濃度、占TNC群I. 8%的⑶44+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. 1%的⑶166+細(xì)胞的濃度、占TNC群I. I %的⑶105+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. 4%的⑶90+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. 5%的⑶29+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. 0%的⑶34+細(xì)胞的濃度，及如由7AAD所測定的99. 5%細(xì)胞生存力；圖32a至圖32cc說明關(guān)于經(jīng)由本發(fā)明的⑶117選擇方法所獲得的陽性溶離份中 的細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。收集約Iml細(xì)胞懸浮液形式的陽性溶離份且將其置于分析管中以供流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果指示占TNC群18. 40%的CDl 17+細(xì)胞的濃度、占TNC群93. 0%的CD44+細(xì)胞的濃度、占TNC群89. 2%的CD166+細(xì)胞的濃度、占TNC群81. 4%的⑶105+細(xì)胞的濃度、占TNC群78. I %的⑶90+細(xì)胞的濃度、占TNC群73. 6%的⑶29+細(xì)胞的濃度、占TNC群O. 1%的⑶34+細(xì)胞的濃度及如由7AAD所測定的91. 9%細(xì)胞生存力。結(jié)果系藉由根據(jù)本發(fā)明的流式細(xì)胞儀分析來運(yùn)作處理樣本且減去以與IgG抗體的同型一起運(yùn)作的處理后樣本所獲得的背景計(jì)算值來計(jì)算；圖33a至圖33r說明在如本文進(jìn)ー步詳述的培養(yǎng)、超低溫保存、解凍及解凍后繼代中的若干繼代后關(guān)于M2-03E的細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。如藉此所示，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示該等細(xì)胞表現(xiàn) MHC I、CD44、CD29、CD90、SSEA-4、CD105、CD49f、CD9、CD166、CD166 及CXCR4且較低表現(xiàn)或不表現(xiàn)⑶133、MHC II、⑶34、⑶45及⑶38 ；圖34a至圖34f展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E對如圖34a所示的CDl 17及如圖34c所示的SSEA-4以及如圖34e所示的⑶117與SSEA-4共定位呈陽性染色。陰性對照對如圖34b所示的CDl 17、如圖34d所示的SSEA-4或如圖34f所示的CDl 17與SSEA-4共定位不呈陽性染色。圖35a及圖35b展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E快速生長且表現(xiàn)多能性標(biāo)記。圖35a展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E以約24小時(shí)至約36小時(shí)的倍增時(shí)間在超低溫保存前培養(yǎng)中快速生長。此快速生長允許以八次倍增自50，000個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增至48，000, 000個(gè)細(xì)胞。如由RT-PCR所測定，圖35b展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E以于培養(yǎng)中至多約12個(gè)繼代的RNA水平表現(xiàn)0ct_4，L，梯帶；水；ESC，胚胎干細(xì)胞；P12，第12代；圖36a至圖36g展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E分化成神經(jīng)組織。月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)以分化成表現(xiàn)如圖36a至圖36c所示的04及GalC的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。月經(jīng)干細(xì)胞亦表現(xiàn)如圖36d所示的Map-2、如圖36e所示的Tub_3及如圖36f所示的波形蛋白(Vimentin)。分化細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果展示通常對于神經(jīng)細(xì)胞的RNA水平表現(xiàn)，RT-PCR L,梯帶；W，水；B，腦對照；神經(jīng)誘導(dǎo)的月經(jīng)干細(xì)胞；圖37a至圖37d展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E分化成心臟組織。月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)8 μ M Aza處理且經(jīng)圖37b的免疫細(xì)胞化學(xué)所示展現(xiàn)肌動蛋白的強(qiáng)表現(xiàn)。如圖37a所示的肌鈣蛋白表現(xiàn)及如圖37c所示的連接蛋白43 (connexin 43)表現(xiàn)系藉由用800 μ M SNAP處理細(xì)胞來刺激。RT-PCR確認(rèn)如圖37d所示的心臟分化，RT-PCR :L，梯帶；W，水；H，心臟對照；心臟誘導(dǎo)；圖38a至圖38f展示月經(jīng)干細(xì)胞M2-03E分化成中胚層型組織。與圖38a所示的對照相比，如圖38b所示誘導(dǎo)經(jīng)針對脂肪空泡的油紅O染色而指示分化成脂肪組織的細(xì)胞。與如圖38c所示的對照相比，當(dāng)如圖38d所示誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞經(jīng)艾爾遜藍(lán)(alcian blue)染色而指示分化成成軟骨組織。與圖38e相比，如圖38f所示細(xì)胞經(jīng)茜素紅S染色而指示鈣沈積物存在；圖39為展示在解凍后培養(yǎng)的第12代，M2-03E的月經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)端粒酶活性的圖；hESC，人類胚胎干細(xì)胞；MEF，小鼠胚胎纖維母細(xì)胞；MenSCs P12 ；圖40為展示以分成3組且在預(yù)設(shè)條件下收集的161個(gè)樣本進(jìn)行 研究的結(jié)果的圖，其系為了分析與本發(fā)明的月經(jīng)干細(xì)胞收集方法相關(guān)的變量。進(jìn)行該研究以測定使用有及無抗生素的收集培養(yǎng)基及在有及無冰的情況下運(yùn)送月經(jīng)流樣本的影響。圖40展示總成核細(xì)胞計(jì)數(shù)分析平均在對于三組所收集的所有樣本中收集的每個(gè)樣本為約7，900，000個(gè)細(xì)胞；圖41為展示圖40所涉及的研究結(jié)果的圖。圖41展示處理后樣本的細(xì)胞生存力平均在對于三組所收集的所有樣本中為約74%的生存力；圖42為展示圖40所涉及的研究結(jié)果的圖。圖42展示對于三組所收集的所有樣本的平均溫度平均為約15°C ；圖43為展示圖40所涉及的研究結(jié)果的圖。圖43展示對于三組所收集的所有樣本的平均樣本體積平均為約Ilml，其包含約Iml月經(jīng)流樣本及約IOml收集培養(yǎng)基 '及圖44為展示圖40所涉及的研究結(jié)果的圖。圖44展示自收集至處理設(shè)施處接收所計(jì)算的平均樣本齡期處于約小于5小時(shí)至大于140小時(shí)的范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將藉由考慮本發(fā)明的實(shí)施例的以下詳細(xì)描述連同如附隨描述及圖式中所述的特定例示性實(shí)施例而便于理解。應(yīng)了解，本發(fā)明的圖式及描述已經(jīng)簡化以出于清楚理解本發(fā)明的目的來說明相關(guān)要素。現(xiàn)參看圖I至圖44，本發(fā)明提供與自月經(jīng)期間排出的血液、細(xì)胞、體液及組織(本掲示案中于本文中亦稱作"月經(jīng)流")分離且根據(jù)本發(fā)明的方法、制程及系統(tǒng)收集的月經(jīng)干細(xì)胞的取得相關(guān)的方法、制程、系統(tǒng)及組合物。如貫穿本發(fā)明的掲示內(nèi)容所用的短語"子宮內(nèi)膜/月經(jīng)細(xì)胞"、"子宮內(nèi)膜/月經(jīng)干細(xì)胞"、"月經(jīng)干細(xì)胞"及"月經(jīng)細(xì)胞"及術(shù)i吾"MSC"及"細(xì)胞"一般關(guān)于表現(xiàn)包括(但不限于)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的細(xì)胞標(biāo)記或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記中的至少ー者而表現(xiàn)較低量或不表現(xiàn)CD3及MHC II的自月經(jīng)流收集的任意一或多個(gè)細(xì)胞而通篇使用。盡管術(shù)語"細(xì)胞"以單數(shù)含義使用，但其亦可以復(fù)數(shù)含義使用以指代本發(fā)明的ー個(gè)以上細(xì)胞。盡管細(xì)胞的上述特征系作為例示性特征提供，但月經(jīng)干細(xì)胞的其它細(xì)胞表面特征系于本文中貫穿本發(fā)明的掲示內(nèi)容提供(包括(但不限干)于此任何表及圖式上所提供的特征)且提供關(guān)于本發(fā)明的月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一歩掲示內(nèi)容?，F(xiàn)尤其參看圖36至圖38，應(yīng)了解，一些干細(xì)胞性質(zhì)上具有多能性，此系歸因于該等細(xì)胞分化成許多獨(dú)特細(xì)胞類型的能力。多能性細(xì)胞具有經(jīng)歷分化成許多不同哺乳動物細(xì)胞類型的能力。詳言之，如圖36至圖38中所說明，本發(fā)明的MSC亦表現(xiàn)分化成各種獨(dú)特細(xì)胞譜系的能力，該等細(xì)胞譜系系諸如神經(jīng)譜系、心臟譜系、成軟骨譜系、成脂譜系及成骨譜系O相信本發(fā)明的MSC可能夠分化成體內(nèi)260個(gè)體細(xì)胞中的任一者。舉例而言，細(xì)胞可至少能夠分化成肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肌源細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及心肌細(xì)胞。如共培養(yǎng)系統(tǒng)中所見，細(xì)胞亦可具有當(dāng)與諸如肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肌源細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及心肌細(xì)胞的其它預(yù)處理細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)分化的能力。自分化獲得的細(xì)胞及自共培養(yǎng)獲得的細(xì)胞亦可具有用于置換或再生療法、其它治療應(yīng)用、藥妝、器官排斥療法及其它應(yīng)用的處理中的潛力。
詳言之，MSC在治療、藥妝及其它應(yīng)用中的潛在用途出于許多原因是有益的，這是由于MSC:(a)易于自其它方面視為生物廢物的無爭議來源獲得，(b)在無需醫(yī)學(xué)培訓(xùn)的情況下由供體有效收集，(C)高度増殖，(d)能分化成所要細(xì)胞類型，(e)能自體應(yīng)用，⑴能同種異體應(yīng)用，(g)能提供可用作多個(gè)療法的潛在來源的單細(xì)胞株，(h)能與其它健康細(xì)胞潛在地共同培養(yǎng)，(i)能用作專用再生保健解決方案的來源，及(j)能經(jīng)十年在規(guī)則周期上即期及多次收集。自其它來源獲得的干細(xì)胞的用途已在用于以下病況的各種形式的再生醫(yī)學(xué)中使用糖尿病、心肌梗塞、瓣膜/動脈置換、帕金森氏病(Parkinson' S)、阿茲海默氏病(Alzheimer' s)、MS、中風(fēng)療法、胰島素再生、抗老化血清、燒傷/創(chuàng)傷愈合繃帶、痤瘡管理、白癲風(fēng)、假發(fā)、牙齒再生、假乳/豐乳、肝硬化、陰莖増大、運(yùn)動療法、貧血、白血病、淋巴瘤、肺纖維化、錸刀型細(xì)胞貧血、骨骼置換、骨質(zhì)疏松癥、脊柱側(cè)彎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊髄損傷、膝/髖/肘置換、激素置換療法、PMS/抑郁管理、自閉癥、不孕療法、視カ再生及晶狀體置換。一般而言及在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供自月經(jīng)流獲得及收集MSC的方法。在另ー實(shí)施例中，本發(fā)明提供自月經(jīng)流收集MSC的系統(tǒng)。在另ー實(shí)施例中，本發(fā)明提供超低溫保存自月經(jīng)流所收集的MSC的方法。在其它實(shí)施例中，包含MSC群的產(chǎn)物可藉由自月經(jīng)流獲得及分離MSC的各種制程來收集。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供MSC的富集群及富集自月經(jīng)流獲得的MSC群的制程。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含MSC及其它試劑的各種組合物，諸如，包含MSC及超低溫保存劑的組合物、包含MSC及至少ー種藥妝劑的組合物、及包含MSC及保存劑的組合物。本發(fā)明的這些各個(gè)實(shí)施例在下文中進(jìn)ー步詳述。本發(fā)明的總體方法及制程的例示性圖解于圖I中說明。一般而言，各個(gè)步驟可用于取得月經(jīng)流且處理該月經(jīng)流以獲得可經(jīng)進(jìn)ー步處理用于特定用途的MSC。詳言之，可將MSC超低溫保存，經(jīng)由細(xì)胞選擇或培養(yǎng)的單一或多個(gè)步驟富集，及/或準(zhǔn)備供治療或藥妝使用。貫穿本發(fā)明的實(shí)施，可藉由諸如表征所收集的MSC的流式細(xì)胞儀及鑒別樣本的任何可能污染的微生物分析的方法及制程對MSC及周圍環(huán)境進(jìn)行質(zhì)量控制分析。圖I所描繪的本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例系在圖2至圖28中以及本發(fā)明的工作實(shí)例的書面描述中進(jìn)一歩詳述。現(xiàn)參看圖2，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖2，可以收集制程來收集月經(jīng)流且接著將其轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可將MSC進(jìn)ー步處理且與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用。現(xiàn)參看圖3，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖3，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離且收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可由表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的所選MSC來進(jìn)ー步富集或濃縮MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者。可將經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC處理且與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存。可接著將經(jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用?，F(xiàn)參看圖4，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖4，可將月經(jīng)流收
集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可由表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的所選MSC來進(jìn)ー步富集或濃縮MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？山又囵B(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以使該等MSC擴(kuò)增?？山又鴮⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用?，F(xiàn)參看圖5，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖5，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可由表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的所選MSC來進(jìn)ー步富集或收集MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？山又囵B(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以使該等MSC擴(kuò)增。可接著針對特異性細(xì)胞表面標(biāo)記來進(jìn)ー步選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC以富集或收集特異性MSC。可將經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用?，F(xiàn)參看圖6，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖6，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可由表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的所選MSC來進(jìn)ー步富集或收集MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？山又囵B(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以使該等MSC擴(kuò)增?？山又槍μ禺愋约?xì)胞表面標(biāo)記來進(jìn)ー步選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC以富集或收集特異性MSC。可接著進(jìn)ー步培養(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目。可接著將MSC與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存。可接著將經(jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用?，F(xiàn)參看圖7，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖7，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？蓪⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC處理且與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用。現(xiàn)參看圖8，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖8，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目。可藉由選擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮經(jīng)培養(yǎng)的MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？山又鴮⒔?jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC分別與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用?，F(xiàn)參看圖9，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖9，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山逵蛇x擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮經(jīng)培養(yǎng)的MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？?接著培養(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以使該等MSC擴(kuò)增。可將MSC的經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的培養(yǎng)物分別與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供使用?，F(xiàn)參看圖10，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖10，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山逵蛇x擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮經(jīng)培養(yǎng)的MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者。可接著培養(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以使該等MSC擴(kuò)增?？舍槍μ禺愋约?xì)胞標(biāo)記來進(jìn)ー步選擇MSC的經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的培養(yǎng)物?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞分別與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準(zhǔn)備且接著超低溫保存?？山又鴮⒔?jīng)超低溫保存的MSC稍后解凍以供治療用。貫穿本發(fā)明的實(shí)施例的所有描述，短語"治療用途"包括使用MSC用于任何類型的干細(xì)胞療法且亦包括藥妝用途?，F(xiàn)參看圖11，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖11，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可將MSC處理且與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖12，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖12，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目。培養(yǎng)后，可將MSC處理且與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖13，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖13，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC分別與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖14，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖14，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又謩e培養(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目。可接著將經(jīng)培養(yǎng)的MSC分別與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖15，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖15，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可培養(yǎng)MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培 養(yǎng)的MSC?？山又謩e培養(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞表面標(biāo)記再次選擇經(jīng)分別培養(yǎng)的MSC。可接著將經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC分別與維持細(xì)胞生存カ的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖16，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖16，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可藉由選擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？山又鴮⒔?jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC分別與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖17，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖17，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可藉由選擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者。可接著分別培養(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目。可接著將經(jīng)培養(yǎng)的MSC與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖18，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖18，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可藉由選擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者?？山又謩e培養(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍μ禺愋约?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備?，F(xiàn)參看圖19，本發(fā)明提供超低溫保存MSC的方法及制程。根據(jù)圖19，可將月經(jīng)流收集且轉(zhuǎn)移至處理設(shè)施中，在此可接著處理該月經(jīng)流以分離及收集MSC。自月經(jīng)流分離及收集MSC可經(jīng)由用于使所收集的MSC數(shù)目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進(jìn)行。一旦收集，即可藉由選擇表現(xiàn)某些細(xì)胞標(biāo)記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細(xì)胞標(biāo)記系諸如與MSC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記中的任意一或多者。可接著分別培養(yǎng)經(jīng)選擇及甚至未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍μ禺愋约?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC。可接著進(jìn)ー步培養(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又鴮⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC與維持細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)基組合以為治療用途作準(zhǔn)備。本發(fā)明的其它實(shí)施例系于圖20至圖28中提供且描述。該等其它實(shí)施例包括在根據(jù)本發(fā)明的先前所述實(shí)施例中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存MSC的后處理MSC?，F(xiàn)參看圖20，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖20，將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用?，F(xiàn)參看圖21，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖21， 將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細(xì)胞表面標(biāo)記來選擇?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用?，F(xiàn)參看圖22，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖22，將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細(xì)胞表面標(biāo)記來選擇?？山又囵B(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又鴮⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用。現(xiàn)參看圖23，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖23，將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細(xì)胞表面標(biāo)記來選擇。可接著培養(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞以擴(kuò)增MSC數(shù)目。可接著針對某些MSC細(xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用。現(xiàn)參看圖24，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖24，可將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細(xì)胞表面標(biāo)記來選擇?？山又囵B(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞以擴(kuò)增MSC數(shù)目。可接著針對某些MSC細(xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又囵B(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的細(xì)胞以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又鴮⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用?，F(xiàn)參看圖25，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖25，可將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著培養(yǎng)以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又鴮⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用?，F(xiàn)參看圖26，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖26，可將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著培養(yǎng)以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC分別與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用。現(xiàn)參看圖27，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖27，可將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著培養(yǎng)以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又謩e培養(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又鴮⒔?jīng)培養(yǎng)的MSC與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用?，F(xiàn)參看圖28，本發(fā)明提供制備根據(jù)先前所述方法或制程中的任一者或任何其它細(xì)胞收集及/或超低溫保存方法或制程收集且超低溫保存的MSC的方法及制程。根據(jù)圖28，可將經(jīng)超低溫保存的MSC解凍且接著培養(yǎng)以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又謩e培養(yǎng)經(jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC以擴(kuò)增MSC數(shù)目?？山又槍δ承┘?xì)胞表面標(biāo)記來選擇經(jīng)培養(yǎng)的MSC?？山又鴮⒔?jīng)選擇及未經(jīng)選擇的MSC與細(xì)胞培養(yǎng)基組合以供治療用。如圖I至圖28中所涉及的本發(fā)明的上述實(shí)施例系如下文所提供及描述而進(jìn)一歩詳述。根據(jù)本發(fā)明，包含月經(jīng)干細(xì)胞及諸如超低溫保存劑、細(xì)胞培養(yǎng)基或藥妝劑的其它試劑 的組合物亦于下文提供且描述。收集及輸送月經(jīng)干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的方法及制程，月經(jīng)干細(xì)胞系藉由首先在月經(jīng)期間使用具備收集套組的收集裝置來收集包括月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流而獲得。月經(jīng)流可在月經(jīng)的任何時(shí)間收集，包括(但不限干)月經(jīng)時(shí)期的重度日、中度日或輕度日。視情況，可自供體收集外周血液的樣本以供比較傳染病分析用?？沙鲇谑占糜谔幚沓鲈陆?jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本的目的向供體提供收集套組。舉例而言，可提供月經(jīng)干細(xì)胞收集套組以收集、處理及封裝月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本以供運(yùn)送。該收集套組可包含輸送容器，諸如盒、袋或適合于(視情況)于低溫下運(yùn)送月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本的其它容器(例如Nanocool、Styrofoam或隔熱容器)；收集裝置，諸如Mooncup、Divacup、Instead杯或適合于收集月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本的任何其它衛(wèi)生收集裝置；至少ー個(gè)尺寸合適的無菌收集容器，諸如50ml管或其它合適尺寸的管；用于懸浮至少ー個(gè)月經(jīng)流樣本的收集培養(yǎng)基；至少ー個(gè)塑料拉鏈袋；至少一條吸收毛巾；至少ー個(gè)生物危害品袋；無菌4X4紗布；用于包覆至少ー個(gè)收集容器的封ロ膜；及消毒清潔小毛巾或抹布。在收集至少ー個(gè)包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流樣本之前，可對供體身份指定ー寄存編號，該編號可在本發(fā)明的實(shí)施中使用以鑒別由該供體所收集的任何樣本。用于收集套組的收集培養(yǎng)基可包含DPBS與肝素的混合物。具有必要pH值的合適的相當(dāng)組織培養(yǎng)基可替代DPBS使用。舉例而言，肝素可以約1000単位/毫升的濃度提供。在一實(shí)施例中，收集培養(yǎng)基可包含具有200単位的處于約1000単位/毫升濃度下的肝素的約10毫升DPBS。收集套組的培養(yǎng)基可藉由將約0. 20毫升肝素以1000単位/毫升的濃度添加至約10毫升DPBS中來制備?？捎谑占瘶颖厩皩⒋梭w積置于無菌收集容器中。在另ー實(shí)施例中，收集培養(yǎng)基可包含杜氏磷酸鹽緩沖生理食鹽水(Dulbecco' s PhosphateBuffer Saline,DPBS) (Mediatech或合適替代培養(yǎng)基的其它制造商)，其不含鈣、鎂或酚紅；抗生素，其可包括盤尼西林(Penicillin)(約100單位/毫升)、鏈霉素(Streptomyocin)(約100微克/毫升)、兩性霉素B (Amphotericin B)及/或其它合適的抗生素；及處于每毫升DPBS培養(yǎng)基或合適抗凝劑約10単位至約20単位的范圍內(nèi)的無保存劑肝素，該抗凝劑系諸如A⑶、CPD、CPDA或CPDA-1。收集培養(yǎng)基可使用無菌技術(shù)來制備。
可用消毒劑清潔陰道區(qū)域以為收集至少ー個(gè)包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流樣本作準(zhǔn)備。在一實(shí)施例中，消毒劑可提供于小毛巾上。供體接著可根據(jù)收集裝置的使用說明書將先前已用肥皂及水清潔的收集裝置置于陰道內(nèi)。須在供體的月經(jīng)期間將該收集裝置置于陰道內(nèi)以收集月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本。在一實(shí)施例中，可在月經(jīng)的重度日期間將收集裝置置于陰道內(nèi)。在一替代實(shí)施例中，可在月經(jīng)的中度日或輕度日期間將收集裝置置于陰道內(nèi)。應(yīng)將收集裝置在陰道內(nèi)維持一定時(shí)間以收集月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本。舉例而言，可將收集裝置在陰道內(nèi)維持約3小時(shí)或更短時(shí)間。收集樣本的額外時(shí)間可為必需的。在陰道內(nèi)維持約3小時(shí)后，可接著移除含有月經(jīng)流樣本的收集裝置。月經(jīng)流樣本可包含約O. Iml至約5ml體積的月經(jīng)血液、組織、 體液及月經(jīng)干細(xì)胞?？山又鴮⒃陆?jīng)流樣本轉(zhuǎn)移至無菌收集管中的收集培養(yǎng)基中。月經(jīng)流樣本向無菌容器中的轉(zhuǎn)移可藉由將月經(jīng)流樣本自收集裝置傾入容器中的培養(yǎng)基中來進(jìn)行以為將月經(jīng)流樣本運(yùn)送至處理設(shè)施作準(zhǔn)備。該容器應(yīng)加以封蓋或以其它方式密封以防止月經(jīng)流樣本與收集培養(yǎng)基的溶液泄漏。密封件亦應(yīng)防止空氣進(jìn)入收集容器內(nèi)部。在一實(shí)施例中，可將具有相應(yīng)密閉蓋的容器用封ロ膜包覆且封裝以供輸送。可將ー個(gè)以上月經(jīng)流樣本收集，轉(zhuǎn)移至容器且準(zhǔn)備運(yùn)送至處理設(shè)施。若收集ー個(gè)以上月經(jīng)流樣本，則可將于收集管中的收集培養(yǎng)基中的各所收集樣本維持于冰箱中直至收集最后ー個(gè)樣本為止。一旦收集所有月經(jīng)流樣本，即可接著封裝該等樣本以供運(yùn)送。在一實(shí)施例中，月經(jīng)干細(xì)胞可由在子宮內(nèi)膜或子宮頸區(qū)域中所進(jìn)行的帕帕尼科拉烏試驗(yàn)(Papanicolaou test)或任何活組織檢查來制備。取得后在運(yùn)送及于處理設(shè)施處處理的過程中，可將包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流的至少ー個(gè)樣本維持于低溫下?？蓪⑷菁{月經(jīng)流與培養(yǎng)基的溶液的任何密封容器封裝供運(yùn)送以在運(yùn)送至處理設(shè)施期間將各樣本維持于約rc至約25°C的范圍內(nèi)的溫度下。在一實(shí)施例中，在運(yùn)送至處理設(shè)施期間可將各樣本維持于約1°C至約15°C的溫度范圍內(nèi)。在另ー實(shí)施例中，在取得后及在整個(gè)運(yùn)送中，可將所收集的月經(jīng)流樣本維持于室溫或周圍空氣溫度下。含有包含月經(jīng)干細(xì)胞及收集培養(yǎng)基的月經(jīng)流樣本的各收集容器可藉由將該收集容器置于以袋子拉鏈功能密封的大塑料拉鏈袋中而封裝以供輸送?？蓪⒎庋b有殺菌容器的大塑料袋置于第二個(gè)大拉鏈袋中且亦密封?？蓪蓷l吸收毛巾置于輸送容器的底部。若正使用Nanocool裝置，則不需要額外冰。泡沫磚或其它裝置可用于冷卻載運(yùn)月經(jīng)流樣本的輸送容器?？蓪⒊錆M濕冰的袋置于吸收毛巾之上?？蓪⒚芊獯械臍⒕萜髦糜诒??？蓪⑵溆辔彰碇糜诒?。將輸送容器關(guān)閉，緊固且密封。其它合適的容器可用于容器的輸送，只要該容器在運(yùn)送期間將包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流樣本維持于約l°c與約25°C之間的溫度下即可。舉例而言，其它合適的容器包括(但不限于)由Therapak Corporation出售的冷卻及隔熱運(yùn)送容器、任何類型的隔熱容器或經(jīng)設(shè)計(jì)用于運(yùn)送的苯こ烯泡沫盒(Styrofoam box)。在運(yùn)送的至少兩個(gè)小時(shí)內(nèi)可接觸承運(yùn)方以獲取含有于收集培養(yǎng)基中的至少ー個(gè)月經(jīng)流樣本的輸送容器。承運(yùn)方可為AirNet或適合于輸送生物材料的其它較佳快遞或諸如FedEx或UPS的其它運(yùn)送公司。輸送容器應(yīng)在收集后約5個(gè)小時(shí)至約125個(gè)小時(shí)內(nèi)到達(dá)處理設(shè)施。在一實(shí)施例中，輸送容器可在收集后約24個(gè)小時(shí)至約72個(gè)小時(shí)的間到達(dá)處理設(shè)施。在另一實(shí)施例中，輸送容器可在約24個(gè)小時(shí)至約48個(gè)小時(shí)的間到達(dá)處理設(shè)施。輸送容器不應(yīng)儲存于熱環(huán)境中。
處理設(shè)施接收輸送容器且為各供體樣本的識別信息編目錄以在處理包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流樣本期間使用。適當(dāng)障壁及個(gè)人保護(hù)措施可在處理設(shè)施處處理包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流的任何樣本期間使用。一旦在處理設(shè)施處接收輸送容器，即可將具有月經(jīng)流樣本的各容器自輸送容器移除，置于冰盤中(或冰箱中)的冰上，且轉(zhuǎn)移至生物安全柜(BSC)中的清潔室中以自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞、收集月經(jīng)干細(xì)胞且稍后處理以供使用及/或超低溫保存。處理設(shè)施處的月經(jīng)流處理由處理設(shè)施接收月經(jīng)流樣本且記錄至處理設(shè)施系統(tǒng)中。一旦在處理設(shè)施處接收月經(jīng)流樣本，即可在整個(gè)處理期間將其維持于約1°C至約25°C的溫度下?？稍贐SC及離心機(jī)中使用無菌技術(shù)處理各月經(jīng)流樣本。當(dāng)在BSC中工作時(shí)以70% IPA頻繁擦拭手套。在處理月經(jīng)流樣本之前于無菌條件下置放BSC中處理所需的所有其它材料，包括(但不限干)紅色頂端管、針、注射器、紅色頂端管的托架、BacT瓶、酒精墊、50ml錐形管、50ml錐形管的托架及移液器。在已對BSC消毒后設(shè)置所有無菌供應(yīng)品。可將制程所使用的所有無菌供應(yīng)品 置于盤或無菌鋪巾中。無菌供應(yīng)品可包括針、注射器及置于BSC中的其它材料，該等材料包括紅色頂端管、紅色頂端管的托架、血液培養(yǎng)瓶、酒精墊、50ml錐形收集管、50ml錐形收集管的托架、移液管及冰盤?；谥圃焐痰恼f明書，將所有培養(yǎng)基及試劑較佳置于冰上且儲存于約1°C至約15°C之間下，但亦可為約2°C至約8°C。緩沖生理食鹽水培養(yǎng)基(DPBS)或合適的替代品可在月經(jīng)干細(xì)胞分離過程期間使用。DPBS培養(yǎng)基包含具有約5ml至約IOml肝素(肝素鈉1，000USP單位/毫升-AmericanPharmaceutical Partners)的約 100 毫升 DPBS。在處理設(shè)施處接收月經(jīng)流樣本的第一天，可對包含月經(jīng)干細(xì)胞的各月經(jīng)流試樣進(jìn)行第I階段處理。首先，可對容納月經(jīng)流樣本的收集容器外部進(jìn)行消毒，接著離心?？墒故占萜髦械脑陆?jīng)流樣本經(jīng)受離心、密度梯度離心、過濾及/或淀粉沉降。離心在一實(shí)施例中，在約4°C下月經(jīng)流樣本的離心可以約2000rpm進(jìn)行歷時(shí)約7分鐘。離心后，可接著自離心機(jī)移除月經(jīng)流樣本的各試樣?？蓪κ占萜魍獠肯?，接著將收集管轉(zhuǎn)移至BSC中以抽吸上清液?？墒闺x心塊再懸浮于約IOml DPBS或相當(dāng)替代品中，且接著對其進(jìn)行第2階段處理。亦可根據(jù)如本文所述的可選凈化步驟處理離心塊。密度梯度離心在另ー實(shí)施例中，月經(jīng)流樣本的離心可使用密度梯度液進(jìn)行。舉例而言，密度梯度液可為淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(約20°C下密度I. 077-1. 083g/ml-Cellgro)或?yàn)榭删哂休^高或較低密度的其它合適梯度液。使含有月經(jīng)流樣本、收集培養(yǎng)基及密度梯度液的錐形收集管經(jīng)受離心。舉例而言，可在約15°C至約30°C之間、較佳約20°C下將錐形收集管以約14，OOOrpm離心約30分鐘而無需應(yīng)用制動器以減緩離心機(jī)。作為密度梯度離心的結(jié)果，白血球?qū)有纬捎谏锨逡号c密度梯度液的界面處。該白血球?qū)雍邪栽陆?jīng)流樣本獲得的月經(jīng)干細(xì)胞的所要細(xì)胞群。將白血球?qū)由戏降纳锨逡撼槲涟籽驅(qū)由戏郊s5ml且摒棄。藉由使白血球?qū)泳従彍u旋且在白血球?qū)犹幱肐Oml移液管刮拭錐形管側(cè)面來移除白血球?qū)?。?yīng)盡可能與白血球?qū)右黄鹗占钚◇w積的密度梯度液。可摒棄剩余密度梯度液及含有紅血球的離心塊?？稍谑覝叵乱栽噭┘凹?xì)胞進(jìn)行密度梯度分離。若將細(xì)胞冷卻，則分離不會提供最佳細(xì)胞回收?？蓪⑺占陌籽?qū)又糜?0ml錐形收集管中且用洗滌溶液使體積達(dá)到約30ml?？山又诩s15°C至約30°C的間下使細(xì)胞懸浮液以約2000rpm離心歷時(shí)約7分鐘。離心后，可接著自離心機(jī)移除試樣且可對收集容器外部消毒，接著將收集管轉(zhuǎn)移至BSC中以抽吸上清液?？墒闺x心塊再懸浮于約IOml DPBS中且接著對其進(jìn)行第2階段處理。亦可根據(jù)如本文所述的可選凈化步驟處理離心塊。過濾在又一實(shí)施例中，可在無菌過濾器中使月經(jīng)流樣本經(jīng)受過濾。該無菌過濾器可為約40微米、約70微米或約100微米。過濾可包含在約1°C至約30°C之間下使包含月經(jīng)干細(xì)胞的月經(jīng)流樣本以約2000rpm離心約7分鐘。離心后，可接著自離心機(jī)移除試樣且可對收集容器外部消毒，接著將收集管轉(zhuǎn)移 至BSC中以抽吸上清液?？墒闺x心塊再懸浮于約IOml DPBS中且接著對其進(jìn)行第2階段處理。亦可根據(jù)本文所述的可選凈化步驟處理離心塊。淀粉沉降在又一實(shí)施例中，可藉由淀粉沉降來處理月經(jīng)流樣本。在一實(shí)施例中，羥こ基淀粉可以I比5的比率使用，亦即，約I毫升淀粉比約5毫升月經(jīng)流樣本?？筛鶕?jù)上述比率混合各月經(jīng)流樣本?？墒够旌衔锝?jīng)受離心以有助于以約50g沉降約6分鐘。亦可在有或無上述離心步驟的情況下使混合物沉降歷時(shí)約30分鐘或至多約兩小吋。沉降后，移除包含月經(jīng)干細(xì)胞的白血球?qū)忧沂蛊浣?jīng)受離心以濃縮該等月經(jīng)干細(xì)胞。離心包含在約1°C至約30°C之間下使懸浮于DPBS中的月經(jīng)干細(xì)胞以約2000rpm離心約7分鐘。離心后，可接著自離心機(jī)移除試樣且對收集容器外部消毒，接著將收集管轉(zhuǎn)移至BSC中以抽吸上清液。可使離心塊再懸浮于約IOml DPBS中且接著對其進(jìn)行第2階段處理。亦可根據(jù)本文所述的可選凈化步驟處理離心塊。凈化可使如根據(jù)離心、密度梯度離心、過濾或淀粉沉降之上述步驟中的任一者所收集的月經(jīng)干細(xì)胞的樣本經(jīng)歷可選凈化過程。在首先計(jì)算樣本的總體積后可移除離心塊周圍的過量流體?？墒闺x心塊再懸浮于約5ml浄化培養(yǎng)基中。浄化培養(yǎng)基可用于凈化月經(jīng)流樣本。浄化培養(yǎng)基包含于合適培養(yǎng)基中的至少ー種抗生素。作為非限制性實(shí)例，抗生素可包含萬古霉素(Vancomycin)、凱福隆(Claforan)、阿米卡星(Amikacin)、慶大霉素(Gentamycin)及兩性霉素B中的至少ー者。合適的培養(yǎng)基可包含漢克斯平衡鹽溶液(Hanks Balanced Salt Solution,HBSS)或其它培養(yǎng)基。若以干式提供，則抗生物可需要復(fù)水。在一實(shí)施例中，浄化培養(yǎng)基可包含以下濃度的抗生素50yg/ml萬古霉素、250 μ g/ml凱福隆、100 μ g/ml阿米卡星、120 μ g/ml慶大霉素及2. 7 μ g/ml兩性霉素B?？股氐钠渌鼭舛人娇蔀楹线m的。舉例而言，浄化培養(yǎng)基可藉由將約IOml HBSS添加至萬古霉素的約Ig小瓶中以獲得約100mg/ml的濃度而制成。將約Iml的100mg/ml濃度的萬古霉素添加至約199mlHBSS中以獲得約500 μ g/ml的濃度。將約Iml的約500 μ g/ml濃度的萬古霉素添加至最終小瓶中用于制備凈化培養(yǎng)基。將約2ml HBSS添加至約500毫克/小瓶的凱福隆中以獲得約250mg/ml的濃度。將約Iml的約250m g/ml凱福隆溶液添加至約99mlHBSS中以獲得約2500 μ g/ml的凱福隆濃度。將約Iml的約2500 μ g/ml濃度的凱福隆添加至浄化培養(yǎng)基的最終小瓶中。將約IOml HBSS添加至阿米卡星的約Ig小瓶中以獲得約100mg/ml的濃度。將約Iml的約100毫克/小瓶濃度的阿米卡星添加至約99mlHBSS中以獲得約1000 μ g/ml。將約Iml阿米卡星添加至最終小瓶中以制備凈化培養(yǎng)基。將約IOml HBSS添加至慶大霉素的約Ig小瓶中以獲得約100mg/ml的濃度。將約Iml的約100mg/ml濃度的慶大霉素添加至約99ml HBSS中以獲得約1000 μ g/ml濃度。將約I. 2ml的約1000 μ g/ml慶大霉素溶液添加至最終小瓶中以制備凈化培養(yǎng)基。將約2ml兩性霉素B添加至約8ml無菌水中以制備約50 μ g/ml濃度的兩性霉素B。約O. 540ml (27 μ g)兩性霉素B系用以制備最終濃度的兩性霉素B。對于抗生素溶液而言，凈化培養(yǎng)基可于50ml無菌管中藉由添加約Iml的500 μ g/ml萬古霉素、約Iml的2500 μ g/ml凱福隆、約Iml的1000 μ g/ml阿米卡星、約I. 2ml的1000 μ g/ml慶大霉素及約O. 540ml (27 μ g)兩性霉素B以構(gòu)成約4. 74ml培養(yǎng)基來制備。將1000單位/毫升的約O. 200ml肝素添加至抗生素溶液中且將約5. 06ml HBSS添加至抗生素溶液中以形成最終體積IOml的浄化培養(yǎng)基?？蓪⑴囵B(yǎng)基儲存于約2°C至約8°C下直至使 用?？墒闺x心塊再懸浮于約5ml浄化培養(yǎng)基中。若凝塊或其它巨分子存在，則細(xì)胞可需要過濾。若再懸浮的細(xì)胞因凝塊或出于任何其它原因而需要過濾，則可使用100微米過濾器過濾樣本。對于過濾而言，可使用100微米過濾器或更小尺寸過濾器(視懸浮液中的凝塊尺寸而定)及無菌50ml錐形管過濾懸浮液。一旦懸浮液穿過過濾器，即可使用額外抗生素培養(yǎng)基洗滌該過濾器。為凈化起見可培育凈化培養(yǎng)基中的經(jīng)過濾或未經(jīng)過濾的細(xì)胞。在一實(shí)施例中，于清潔室中在冰箱中將凈化培養(yǎng)基中的經(jīng)過濾或未經(jīng)過濾細(xì)胞在約2°C至約8°C下培育約20小時(shí)至約30小吋。培育期間，可將細(xì)胞置于旋轉(zhuǎn)器上或以每小時(shí)約一次翻轉(zhuǎn)歷時(shí)培育的頭5個(gè)小吋。凈化過程結(jié)束時(shí)，接著對包含月經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行第2階段處理。在經(jīng)受或不經(jīng)受凈化過程的情況下，包含月經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液可根據(jù)第2階段處理來處理。第2階段處理包含使DPBS或浄化培養(yǎng)基中的細(xì)胞懸浮液經(jīng)受離心。在一實(shí)施例中，在約4°C下細(xì)胞懸浮液的離心可以約2000rpm進(jìn)行歷時(shí)約7分鐘。離心之后及轉(zhuǎn)移至BSC之前，可對容納月經(jīng)干細(xì)胞的管外部消毒。一旦于BSC中，即可移除上清液，在管底部留下細(xì)胞離心塊?？墒辜?xì)胞再懸浮于約10ml DPBS中，混合且在約4°C下以約2000rpm離心約7分鐘。離心后，可將容器浄化，接著轉(zhuǎn)移至BSC中。月經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)菌學(xué)分析可在處理中的此時(shí)進(jìn)行。在BSC中，且使用無菌技木，可使用無菌注射器移除包含月經(jīng)干細(xì)胞的離心塊上方的約5ml上清液。可將約4ml上清液置于厭氧血液培養(yǎng)瓶中且可將約Iml上清液置于好氧血液培養(yǎng)瓶中。該等瓶可經(jīng)組態(tài)以供BacT/Alert系統(tǒng)中使用?？山又鶕?jù)制造商的說明書使用BacT/Alert系統(tǒng)培育該等瓶。BacT/ALERT血液培養(yǎng)瓶及系統(tǒng)系作為用于實(shí)施本發(fā)明的合適測試系統(tǒng)的ー實(shí)例而提供。可使用其它合適的自動或手動血液培養(yǎng)試樣瓶及系統(tǒng)，只要其依照21C. F. R.部分610. 12或經(jīng)驗(yàn)證效能與此CFR部分類似即可?？勺噪x心塊上方移除剩余上清液。使包含細(xì)胞的離心塊再懸浮于DPBS中達(dá)到約5. Iml且混合?？蓪⒓sΙΟΟμ I細(xì)胞等分至管中以供處理后測試以獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)及生存力?？墒褂米詣踊蚴謩友蛴?jì)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)?？墒褂缅F蟲藍(lán)或其它方法進(jìn)行細(xì)胞生存力分析。懸浮于DPBS中的剰余細(xì)胞可準(zhǔn)備超低溫保存、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞選擇或治療或藥妝使用。超低溫保存對于超低溫保存而言，可將懸浮于DPBS中的剰余細(xì)胞置于冰上歷時(shí)至少約15分鐘以為超低溫保存作準(zhǔn)備。該準(zhǔn)備可包含將超低溫保存培養(yǎng)基添加至月經(jīng)干細(xì)胞中且接著利用控速冷凍器或其它合適的冷凍器系統(tǒng)(急降冷凍(dump-freeze)監(jiān)控或冷凍容器(Nalgene))對混合物進(jìn)行若干降溫步驟以使該等月經(jīng)干細(xì)胞的溫度降至約_90°C的最終溫度。合適的控速冷凍器包括(但不限于)Cryomed Thermo Forma控速冷凍器 7454 (Thermo Electron, Corp. )、Planar 控速冷凍器 Kryo 10/16 (TS Scientific) >Gordinier、Bio-Cool-FTS 系統(tǒng)及 Asymptote EF600、BIOSTORCBS 2100 系列。
可制備包含培養(yǎng)基及DMSO的超低溫保存培養(yǎng)基?？蓪⒓s3ml DPBS添加至諸如50ml錐形管的容器中。可將約Iml人類血清白蛋白(HSA)添加至約3ml DPBS中且接著在冰上冷卻約10分鐘。將約Iml經(jīng)冷卻的99% DMSO添加至HSA及DPBS中以制備最終超低溫保存培養(yǎng)基?？山又鴮⒊蜏乇４媾囵B(yǎng)基及細(xì)胞樣本置于冰上歷時(shí)約15分鐘，隨后將該超低溫保存培養(yǎng)基添加至該細(xì)胞樣本中。分批處理可用于將超低溫保存培養(yǎng)基等分至細(xì)胞樣本中。舉例而言，可將約ΙΟΟμ I細(xì)胞懸浮液的單一等分試樣與約3ml DPBSUml HSA及約Iml的99% DMSO組合?？蓪⒓s200 μ I細(xì)胞懸浮液的約2份等分試樣與約6ml DPBS、2mlHSA及約2ml的99% DMSO組合。可將細(xì)胞樣本的約5份等分試樣與約15ml DPBS、約5ml HSA及約5ml的99% DMSO組合?？蓪⒓?xì)胞樣本的約10份等分試樣與約30ml DPBS、約IOmlHSA 及約 IOml 的 99% DMSO 組合。在一替代實(shí)施例中，可使用其它超低溫保存培養(yǎng)基。舉例而言，具有超低溫保存劑的超低溫保存培養(yǎng)基可用于維持解凍后高細(xì)胞生存力成果，諸如CryoStor CSlO或CS5 (Biolife)、補(bǔ)充有丙ニ醇及蔗糖的胚胎超低溫保存培養(yǎng)基(Vitrolife)、或SAGE培養(yǎng)基(Cooper Surgical)。甘油可與諸如DMSO的其它超低溫保存劑一起使用，或可以于具有合適蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中約10%的濃度單獨(dú)使用。可將超低溫保存培養(yǎng)基添加至細(xì)胞樣本中。可將超低溫保存培養(yǎng)基逐滴添加至懸浮于DPBS中的月經(jīng)干細(xì)胞中直至所懸浮的月經(jīng)干細(xì)胞與超低溫保存培養(yǎng)基的總混合物的體積達(dá)到超低溫保存細(xì)胞混合物的最終所要體積為止?？蓪⒆罱K超低溫保存細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至2X5ml條形碼冷凍四級瓶(cryoquat)中，其中Q C樣本儲存于5ml小瓶的蓋中。使用移液器移除樣本的約200 μ I等分試樣且將其等分至Q C蓋中。已填充蓋后，將剩余4.8ml試樣添加至5ml小瓶中。應(yīng)將樣本送至進(jìn)行傳染病及其它分析。應(yīng)將冷凍小瓶置于CRY0MED冷凍器中且對其進(jìn)行控速降溫至處于或低于約_85°C的溫度。應(yīng)將經(jīng)超低溫保存的試樣轉(zhuǎn)移至貯倉中以儲存于-150°C或更低溫度下的液氮蒸氣中。應(yīng)對對傳染病測試呈陽性的任何樣本進(jìn)行檢疫?？蓪魅静y試呈陰性的任何樣本轉(zhuǎn)移至不同永久儲存?zhèn)}?？稍诳厮倮鋬銎髦谐绦蚧韵陆禍夭襟E，首先降低超低溫保存劑與月經(jīng)干細(xì)胞的混合物?？墒古c超低溫保存劑組合的月經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)受控速降溫以為最終儲存于冷凍器中作準(zhǔn)備。控速降溫可經(jīng)設(shè)計(jì)以維持細(xì)胞生存力。Cryo-Med冷凍器(Thermo Electron Corp.) >液氮缸及攜帯型Cry0-Med冷凍器可用于控速降溫以為最終儲存于冷凍器中作準(zhǔn)備?？稍诶鋬鲂∑炕蚶鋬龃惺辜?xì)胞經(jīng)受控速降溫以達(dá)到約-90°C的溫度。對于在冷凍袋中所收集的月經(jīng)干細(xì)胞的樣本而言，可使細(xì)胞經(jīng)受以下控速降溫概況在約4 °C下等待，I. (TC /分鐘至-6. (TC (樣本)，25. (TC /分鐘至-50. (TC (腔室)，10. (TC / 分鐘至-14. (TC (腔室)、I. (TC / 分鐘至-45. (TC (腔室)、10. (TC / 分鐘至-90. (TC (腔室)及結(jié)束(樣本處于或低于-85. (TC )。對于在冷凍小瓶中所收集的月經(jīng)干細(xì)胞的樣本而言，可使細(xì)胞經(jīng)受以下控速降溫概況在4. (TC下等待，I. (TC /分鐘至-3. (TC (腔室)，10. (TC /分鐘至-20. (TC (腔室)，I. (TC /分鐘至-40. (TC (腔室)，10. (TC /分鐘至-90. (TC (腔室)及結(jié)束。一旦超低溫保存劑與月經(jīng)干細(xì)胞的混合物處于或低于約_85°C，即將超低溫保存小瓶轉(zhuǎn)移至低溫儲存單元中且在處于或低于約_135°C的溫度下的液氮蒸氣中儲存，或另外可將小瓶儲存于液氮的液相中。舉例而言，合適的低溫儲存單元包括(但不限干)LN2冷凍 器 MVE 1830 (Chart Industries)。流式細(xì)胞儀分析月經(jīng)干細(xì)胞的任何所收集樣本可藉由錐蟲藍(lán)經(jīng)由染料排除測試總細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞生存力。亦可分析月經(jīng)干細(xì)胞的樣本的表現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞的存在。可藉由使用血球計(jì)、流式細(xì)胞儀或適合于獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)的其它方式(諸如ViCell (Beckman Coulter))的手動計(jì)數(shù)或適合于對呈現(xiàn)于顯微鏡影像上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的軟件來量化細(xì)胞的處理前樣本、處理后樣本及任何其它樣本的總細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞生存力?？山逵闪魇郊?xì)胞儀分析處理前細(xì)胞。若紅血球存在，則可藉由將約36ml蒸餾水及約4ml的10溶胞溶液添加至50ml管中來制備IXNH4Cl溶胞溶液(StemKit)。可將每個(gè)委托者約ΙΟΟμ I處理前樣本添加至兩個(gè)管中以進(jìn)行分析。一管用于⑶34+/生存力分析且第二管用于異純系對照(isoclinic control) 可將約20 μ I CD45-FITC/CD34-PE添加至各管底部。應(yīng)將約20 μ I 7-AAD生存力染料添加至管中?？墒够旌衔餃u旋且接著在免受光照下于約15°C至約30°C下培育至少20分鐘?？山又鴮⒓sIml的IXNH4Cl溶胞溶液添加至各管中且使其渦旋?？蓪⒒旌衔镌诩s15°C至約30°C下培育約20分鐘?？蓪⒓s100μ LStem-Count熒光球添加至各管中且使其渦旋。接著應(yīng)將樣本在流式細(xì)胞儀上運(yùn)作以供分析?？山逵闪魇郊?xì)胞儀分析處理后細(xì)胞?？勺許temKit藉由將約36ml蒸餾水及4ml的10溶胞溶液添加至50ml管中來制備IXNH4Cl溶胞溶液?？蓪⒚總€(gè)委托者約50 μ I處理后樣本添加至兩個(gè)管中以進(jìn)行分析。一管用于⑶34+/生存力分析且第二管用于異純系對照。可將約10 μ L 7-AAD生存力染料添加至各管中。可將約10 μ I⑶45-FITC/⑶34-ΡE添加至第一管中?？蓪⒓s10 μ I⑶45-FITC/CTRL-PE添加至第二管中。可使混合物渦旋且接著在免受光照下于約15°C至約30°C下培育至少20分鐘。可接著將約Iml的IXNH4Cl溶胞溶液添加至各管中且使其渦旋。可將混合物在約15°C至約30°C下培育約20分鐘?？蓪⒓s100 μ LStem-Count熒光球添加至各管中且使其渦旋。接著應(yīng)將樣本在流式細(xì)胞儀上運(yùn)作以供分析。月經(jīng)干細(xì)胞的新鮮樣本及先前經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞的解凍樣本亦可藉由流式細(xì)胞儀分析以分析細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞生存力及其它細(xì)胞特征。新鮮樣本亦可于細(xì)胞溶解后根據(jù)以下方案來分析。經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞須根據(jù)本文所述的解凍過程來解凍。在細(xì)胞樣本須解凍的狀況下，細(xì)胞可需要在解凍后或在細(xì)胞培養(yǎng)后即刻進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析以評估某ー細(xì)胞繼代?？蓪⒔?jīng)超低溫保存的樣本在37°C水浴中攪動而不便細(xì)胞完全解凍?？蓪⒃摰燃?xì)胞轉(zhuǎn)移至約Iml經(jīng)冷卻的洗滌培養(yǎng)基中且藉由翻轉(zhuǎn)來混合?？蓪颖疽约s2000rpm離心約7分鐘?？梢瞥锨逡呵沂辜?xì)胞懸浮于約ΙΟΟμ I洗滌培養(yǎng)基(25% HSA，DNAse，肝素及HBSSw/Ca+與Mg+)中。可接著將再懸浮的細(xì)胞在Bl ood Bank Serofuge中離心約I分鐘?？蓛A析上清液且使細(xì)胞再懸浮于約I. 2ml鞘流中且使其渦旋?？舍槍υS多細(xì)胞表面標(biāo)記來分析鞘流中的細(xì)胞。舉例而言且并非限制性地，可將細(xì)胞于鞘流中的約100 μ I樣本添加至含有下列試劑(各管中每ー試劑10 μ I或20 μ I體積)的各管中且接著使管渦旋以將如表A中所述的試劑與樣本混合。表A :流式細(xì)胞儀負(fù)荷示意表
管[FITCPE I ECD Γ PC5
~IgGIgGIiGiiG
2HLA-I CD133 ' HLA-II 7AAD
3CD9CD54 ' CD45CDlO
4CD59CD63 ' CD34CD13
5CD49e CD81 '無CD49f
6CD44CDl17 '無CD38
7CD29CD105 ' CD41CD3
8CD19CD166 '無CD90
9NANOG SSEA3 '無7AAD
10CD14SSEA4 '無7AAD
11無CD56 '無7AAD在室溫(15-30°C )下培育20分鐘。免受光照。若運(yùn)作含有RBC的新鮮樣本，則添加500 μ I溶胞溶液且在室溫下再培育10分鐘且免受光照。若運(yùn)作密度梯度液或經(jīng)解凍樣本，則不溶解。若不溶解樣本，則在培育20分鐘后用Iml洗滌培養(yǎng)基洗滌。離心I分鐘且接著傾析上清液。若溶解樣本，則將樣本離心I分鐘且傾析溶胞液。添加Iml洗滌培養(yǎng)基，渦旋，再次離心且接著再次傾析。將500 μ L鞘流添加至各管中，渦旋且在FC500流式細(xì)胞儀上運(yùn)作。
在細(xì)胞標(biāo)記分析之前，可對新鮮細(xì)胞樣本或經(jīng)解凍樣本進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)。可使用Kasumi-3對照細(xì)胞或其它對照細(xì)胞設(shè)置許多陽性對照用于流式細(xì)胞儀分析。用于細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞生存力分析的材料包括(但不限于)流式細(xì)胞儀，Isoflow鞘流，Coulter Clenz 清潔劑，及包括(但不限于)CD45-FITC/CD34-PE、CD45-FITC/ 異純系對照-PE、7-AAD生存力染料、Stem-Count熒光球、10X濃縮氯化銨(NH4Cl)溶胞溶液及22%牛白蛋白溶液的試劑。參見Stem Kit CD34+HPC列舉套組包裝插頁-03版(PNIM2390) ；Beckman Coulter Product Corrective Action, CXP 2. 0&2.I PanelInterruption-3/10/06, PCA-M-D-1013 ；14. 3StemLab，創(chuàng)建號 200706260856,3. 2. I 版。用于流式細(xì)胞儀的材料亦包括(但不限于)Isoflow鞘流；Coulter Clenz清潔劑；及使用前約 20-25 °C 的以下試劑CD 117-PE、CD29-FI TC、CD34-ECD、CD44-FI TC、CD45-ECD、CD90-PC5、CD105-PE、CD166-PE、IgG-FITC、IgG-PE、IgG-ECD、IgGl-PC5、HLA-I-FITC、CD133-PE、HLA-IIECD、CD9-FITC、CD54-PE、CD10-PC5、CD59-FITC、CD63-PE、CD13-PC5、CD49e_FITC、CD81-PE、CD49f-PC5、CD44-FITC、CD38-PC5、CD29-FITC、CD105-PE、CD41-ECD、CD3-PC5、CD19-FITC、NAN0G-FITC、SSEA3-PE、SSEA4-PE、CD14-FITC、CD56_PE、7_AAD 生存力染料、10 X 濃縮氯化
銨(NH4Cl)溶胞溶液、洗滌培養(yǎng)基(包含HBSS (具有Ca+與Mg+的漢克斯液)500ml、肝素5ml、人類血清白蛋白25% 50ml、DNASE-l安瓿)、Kasumi-3細(xì)胞株-CD117+細(xì)胞、定時(shí)器及渦旋式混合器。在一替代實(shí)施例中，細(xì)胞可藉由類似于先前所述的流式細(xì)胞儀方法的替代流式細(xì)胞儀方法來分析，該等先前所述的流式細(xì)胞儀方法包括使用對照及制備月經(jīng)干細(xì)胞的新鮮樣本、處理前樣本、處理后樣本或經(jīng)解凍樣本的方法。細(xì)胞標(biāo)記亦可藉由免疫組織化學(xué)分析來評估?？稍诹魇郊?xì)胞儀的前分析各樣本的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。若樣本含有> 3. 5X IO6個(gè)細(xì)胞，則可評估全板。若樣本含有< 3. 5X IO6個(gè)細(xì)胞，則較少管可為必需的。若流動測試需在需要解凍的冷凍樣本上進(jìn)行，則在37°C水浴中攪動小瓶而不使細(xì)胞完全解凍?？筛鶕?jù)對于先前所討論的流式細(xì)胞儀分析法的方法來處理經(jīng)解凍樣本且視細(xì)胞數(shù)而定根據(jù)下表B將其添加至若干管中。表B :流式細(xì)胞儀負(fù)荷示意表
權(quán)利要求
1.一種用于獲得月經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包含下列步驟 a)自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞；及 b)處理該自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含以離心、密度梯度離心、過濾或沉淀中的至少一個(gè)方法處理該月經(jīng)流。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中處理自該月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含針對至少一種包含下列的細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含針對至少一種包含下列的細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中處理分離自該月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中處理該月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含選擇月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中處理月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含針對細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該方法包含超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該方法包含解凍經(jīng)超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞及處理經(jīng)解凍的月經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該方法包含制備包含月經(jīng)干細(xì)胞及維持月經(jīng)干細(xì)胞存活的細(xì)胞培養(yǎng)基的治療組合物的進(jìn)一步步驟。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該方法包含制備包含月經(jīng)干細(xì)胞和藥妝制劑的藥妝組合物的進(jìn)一步步驟。
15.一種自月經(jīng)流收集月經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包含 a)在一月經(jīng)周期期間取得月經(jīng)流； b)將該月經(jīng)流輸送至一處理設(shè)施； c)將月經(jīng)干細(xì)胞自月經(jīng)流分離而成細(xì)胞制劑'及 d)處理該月經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞制劑。
16.一種自月經(jīng)流收集月經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含 a)一月經(jīng)干細(xì)胞分離器，其中月經(jīng)干細(xì)胞分離器將月經(jīng)干細(xì)胞自月經(jīng)流分離； b)一月經(jīng)干細(xì)胞收集器，其中該月經(jīng)干細(xì)胞收集器收集月經(jīng)干細(xì)胞 '及 c)一月經(jīng)干細(xì)胞處理器，其中該月經(jīng)干細(xì)胞處理器制備供治療用或供超低溫保存的月經(jīng)干細(xì)胞。
17.一種超低溫保存月經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包含下列步驟 a)自月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞； b)收集自月經(jīng)流分離的月經(jīng)干細(xì)胞；及 c)超低溫保存分離自該月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中自該月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含經(jīng)由離心、密度梯度離心、過濾或沉降中的至少一種處理該月經(jīng)流。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含至少一個(gè)針對細(xì)胞標(biāo)記選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含至少一個(gè)培養(yǎng)所選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含至少一個(gè)培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟包含至少一個(gè)自細(xì)胞培養(yǎng)物選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
23.一種月經(jīng)干細(xì)胞群，其通過包含下列步驟的方法獲得 a)從月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流中分離月經(jīng)干細(xì)胞；及 b)收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞。
24.一種用于富集收集自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞群的方法，該方法包含下列步驟 a)從月經(jīng)期間所收集的月經(jīng)流中分離月經(jīng)干細(xì)胞；及 b)收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個(gè)針對下列細(xì)胞標(biāo)記中的至少一者選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個(gè)培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個(gè)選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟及至少一個(gè)培養(yǎng)所選擇的月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個(gè)培養(yǎng)月經(jīng)干細(xì)胞的步驟及至少一個(gè)自細(xì)胞培養(yǎng)物選擇月經(jīng)干細(xì)胞的步驟。
29.一種用于富集表達(dá)⑶117的月經(jīng)干細(xì)胞群的方法，該方法包含下列步驟 a)自月經(jīng)流分離月經(jīng)干細(xì)胞； b)收集分離自月經(jīng)流的月經(jīng)干細(xì)胞；及 c)選擇表達(dá)⑶117的月經(jīng)干細(xì)胞。
30.一種月經(jīng)干細(xì)胞群，其包含至少一種下列細(xì)胞標(biāo)記⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 類。
31.一種經(jīng)富集化的細(xì)胞群，其包含 a)表達(dá)至少一種包含下列的細(xì)胞標(biāo)記⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的月經(jīng)干細(xì)胞；及 b)較低表達(dá)或不表達(dá)包含CD3及HLAII類的細(xì)胞標(biāo)記中的至少一者的月經(jīng)干細(xì)胞。
32.—種組合物，其包含至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及超低溫保存劑。
33.一種組合物，其包含至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基。
34.一種組合物，其包含至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及藥妝劑。
35.一種組合物，其包含至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及維持細(xì)胞存活的保存劑。
36.一種組合物，其包含至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基，該組合物位于一容器中以為該至少一個(gè)月經(jīng)干細(xì)胞的治療用途作準(zhǔn)備。
全文摘要
本發(fā)明提供包含月經(jīng)干細(xì)胞(MSC)的組合物及關(guān)于獲得其的方法、制程及系統(tǒng)。MSC系經(jīng)由處理月經(jīng)期間收集的月經(jīng)流而得?？蓪SC超低溫保存，經(jīng)各個(gè)培養(yǎng)及選擇步驟處理以為超低溫保存作準(zhǔn)備，或經(jīng)處理以供治療或藥妝用?？蓪⒔?jīng)超低溫保存的MSC解凍以為治療及藥妝用途作準(zhǔn)備。MSC表現(xiàn)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166及HLA I類且其CD3及HLA II類表現(xiàn)較少或不表現(xiàn)。
文檔編號C12N5/071GK102851254SQ20121032254
公開日2013年1月2日 申請日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日
發(fā)明者默西迪絲·A·沃爾頓, 朱莉·G·阿利克遜 申請人:干細(xì)胞國際公司