專利名稱：一種在蠶卵期鑒別家蠶吐絲顏色的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種在蠶卵期鑒別家蠶吐絲顏色的方法，具體的是利用家蠶BmStartl基因特定區(qū)域的DNA結(jié)構(gòu)，鑒別Cbp基因和Cbp-Iike基因的轉(zhuǎn)錄mRNA與翻譯蛋白質(zhì)類型，在蠶卵期特異性鑒別家蠶吐絲顏色。
背景技術(shù)：
家蠶(Bombyx mori)也稱桑蠶，是被產(chǎn)業(yè)化利用大量生產(chǎn)絲蛋白纖維的昆蟲。家蠶是完全變態(tài)昆蟲，一生經(jīng)過卵、幼蟲、蛹、成蟲等四個形態(tài)上和生理機(jī)能上完全不同的發(fā)育階段，其中卵是胚胎發(fā)生、發(fā)育形成幼蟲的階段，幼蟲是攝取食物營養(yǎng)的生長階段，蛹是從幼蟲向成蟲過渡的變態(tài)階段，成蟲是交配產(chǎn)卵繁殖后代的生殖階段。整個世代只幼蟲期攝食，并為蛹和成蟲期的生命活動積貯營養(yǎng)，尤其是4、5齡幼蟲大量攝食桑葉，快速合成絲 蛋白質(zhì)，其中5齡幼蟲食桑量占全齡幼蟲用桑量的85%，5齡幼蟲生長至最大體重時，比蟻蠶體重增加近I萬倍。蠶絲是熟蠶結(jié)繭時分泌絲液凝固而成的連續(xù)長纖維，也稱繭絲。它與羊毛一樣，是人類最早利用的動物纖維之一。家蠶天然彩色繭是人類早已發(fā)現(xiàn)的資源，有黃紅繭系、黃綠繭系和白繭系3類。黃紅繭系包括淡黃、金黃、肉色、紅色、蒿色、銹色等多種繭色；黃綠繭系包括竹綠(淡綠)和綠色兩種。其中白繭系是國內(nèi)外養(yǎng)蠶業(yè)普遍生產(chǎn)的蠶繭，現(xiàn)代繅絲工業(yè)也主要利用家蠶白色繭絲，并通過化學(xué)染色等工藝生產(chǎn)有色絲綢產(chǎn)品，而在絲綢染整加工過程中的染料等化學(xué)物質(zhì)，有相當(dāng)一部分含有對人體有害的物質(zhì)，印染廢水則成為工業(yè)污水的重要整治目標(biāo)。黃紅繭系、黃綠繭系不進(jìn)行染色就能夠生產(chǎn)有色絲紡織品，更加符合現(xiàn)代養(yǎng)蠶業(yè)發(fā)展和絲織工業(yè)生產(chǎn)的要求，也是國內(nèi)外紡織品市場的高端產(chǎn)品。家蠶天然彩色繭絲纖維吸濕導(dǎo)濕性能強(qiáng)、抑菌性能優(yōu)，吸收紫外線與抗氧化等護(hù)膚能力好，具有色彩天然、色澤雅致等突出性能，生產(chǎn)的纖維產(chǎn)品色澤柔和、無毒無害、色彩自然，是高檔天然綠色紡織材料。家蠶天然彩色繭絲纖維生產(chǎn)過程不需要染色，能夠有效減少絲綢印刷的污染，對環(huán)境和人體友好，具有重大經(jīng)濟(jì)利用價值和重要的社會發(fā)展意義。但近百年來，彩色繭原料生產(chǎn)一直未能解決繭色雜、易褪色、絲質(zhì)差、絲量低和繭形不正(橄欖形或三角形)等繭絲纖維特性的重大缺陷，家蠶彩色繭精細(xì)化加工技術(shù)也因?yàn)闆]有合格的原料繭，無法開展技術(shù)研究與突破，存在無法紡制細(xì)纖高檔天然彩色絲線、無法生產(chǎn)高檔面料的行業(yè)技術(shù)瓶頸。因此迫切需求創(chuàng)新天然彩色繭品種，促進(jìn)優(yōu)質(zhì)天然彩色繭原料生產(chǎn)。家蠶形成繭色的物質(zhì)來源于幼蟲取食的桑葉(飼料)，桑葉中的天然色素在體內(nèi)與色素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合后，才能夠被家蠶消化道吸收，并進(jìn)一步通過血液轉(zhuǎn)移進(jìn)入絲腺，最終形成有色繭。家蠶絲腺中色素的積累，主要發(fā)生在5齡幼蟲期，但最終需要到幼蟲發(fā)育完成、吐絲結(jié)繭后才能夠看到繭色。因此按照常規(guī)方法通過繭色進(jìn)行有色繭品種培育，需要投入巨大的幼蟲飼養(yǎng)人力和物力。創(chuàng)新繭色判別方法，減少鑒別過程的人力和物力投入，縮短鑒別過程所需時間，提高鑒別準(zhǔn)確性，是目前家蠶有色繭品種培育過程迫切需要解決的問題。Tabunoki H 等(2002)，Tsuchida 等(2004), Sakudoh 等(2005, 2007),牛艷山等(2010)報道了ー種類胡蘿卜素結(jié)合蛋白(Carotenoid binding protein,CBP)基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物與類胡蘿卜素特別是葉黃素(Lutin)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，是黃紅色繭成色的關(guān)鍵基因。CBP作為胞質(zhì)溶膠中的類胡蘿卜素載體與C基因編碼的CAME02蛋白作為細(xì)胞表面的跨膜受體協(xié)同作用，共同介導(dǎo)類胡蘿卜素的運(yùn)輸(Sakudoh et al.，2010)。牛艷山等通過檢驗(yàn)一種類胡蘿卜素結(jié)合蛋白(Carotenoid binding protein,CBP)基因Cbp和Cbp-Iike基因轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)構(gòu)，或者檢測CBP蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可以確認(rèn)檢測個體的類胡蘿卜素結(jié)合蛋白基因類型，進(jìn)而在家蠶幼蟲期即可判斷家蠶吐絲顏色。但家蠶Cbp基因和Cbp-Iike基因主要在5齡幼蟲絲腺和消化管轉(zhuǎn)錄表達(dá)，鑒定Cbp基因和Cbp-Iike基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)產(chǎn)物類型需要?dú)⑺烙紫x取出絲腺或消化管組織，無法同時實(shí)現(xiàn)鑒定家蠶吐絲顏色與留種兩全。為此，尋找ー種在保證家蠶幼蟲存活的前提下于蠶繭形成前鑒定家蠶吐絲顏色的方法，對于提高家蠶天然彩色繭品種培育、減少育種過程中的飼養(yǎng)工作量及飼養(yǎng)成本具有重要意義
發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供ー種在蠶卵期快速、準(zhǔn)確、特異性鑒別家蠶吐絲顏色的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案ー種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的方法，提取待測家蠶蠶卵的基因組DNA，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷家蠶吐絲顏色；若同時具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列，則家蠶吐黃色繭絲；若僅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，則家蠶吐綠色繭絲或者白色繭絲。家香基因轉(zhuǎn)錄的mRNA和翻譯的蛋白質(zhì)序列，雖然依賴于該基因的外顯子序列,但其內(nèi)含子序列和順式調(diào)節(jié)子等其它序列有時也影響基因轉(zhuǎn)錄的mRNA和翻譯的蛋白質(zhì)序列。家蠶的BmStartl基因位點(diǎn)是ー個復(fù)雜的多基因重疊位點(diǎn)，Cbp基因是其中I個重疊基因。豕香的Cbp基因重置范圍內(nèi)的DNA有4種不同序列，這種DNA序列的差異，既有Cbp基因外顯子的序列差異，也有影響Cbp基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子序列差異，導(dǎo)致在結(jié)不同顏色蠶繭的家蠶的色素吸收和儲存組織的Cbp基因和Cbp-Iike基因mRNA轉(zhuǎn)錄本有多于4種不同序列，翻譯的蛋白質(zhì)序列和功能也有差異。Cbp基因重疊范圍內(nèi)的DNA序列雖然變化很多，但其中存在能夠區(qū)分結(jié)黃色繭家蠶與結(jié)其它顏色繭家蠶的特異序列。本發(fā)明所述方法利用家蠶BmStartl基因特定區(qū)域的DNA結(jié)構(gòu)，鑒別Cbp基因和Cbp-Iike基因的轉(zhuǎn)錄mRNA與翻譯蛋白質(zhì)類型，進(jìn)而在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色。在ー個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明以提取的家蠶蠶卵的基因組DNA為模板，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物PCR擴(kuò)增家蠶特征DNA序列，瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從4個不同蛾區(qū)蠶卵中鑒別出具有吐黃色絲的蠶卵蛾區(qū)。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列或者僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的I號蛾區(qū)和2號蛾區(qū)的家蠶吐黃色繭絲；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅具有一條SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列的I號蛾區(qū)和2號蛾區(qū)的家蠶吐緑色繭絲或者白色繭絲。在ー個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明進(jìn)一步以提取的家蠶蠶卵的基因組DNA為模板，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物PCR擴(kuò)增家蠶特征DNA序列，瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從100個蛾區(qū)蠶卵中鑒別出幼蟲具有吐黃色絲功能的蠶卵蛾區(qū)。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時具有SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列和SEQID NO 4所示的核苷酸序列或者僅具有一條SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的I號蛾區(qū)和3號蛾區(qū)的家蠶吐黃色繭絲；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅具有一條SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列的2號、4號-100號蛾區(qū)的家蠶吐緑色繭絲或者白色繭絲。本發(fā)明所述鑒別家蠶吐絲顏色的方法準(zhǔn)確率為100%。通過本發(fā)明所述方法可以將不具有吐黃色絲結(jié)黃繭的能力的蛾區(qū)2號、4號至100號的98個蛾區(qū)銷毀，極大的減少了育種過程中的飼養(yǎng)工作量。本發(fā)明還提供了ー種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的試劑盒，包括具有SEQ ID NO I所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的試劑盒還包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq酶中的ー種或幾種。本發(fā)明還提供了ー種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的DNA分子組，由SEQID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明提供了ー種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的方法。本發(fā)明所述方法利用基因工程技術(shù)提取待測家蠶基因組DNA，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的種類和長度判斷家蠶吐絲顏色，用以區(qū)分家蠶是否吐有色繭絲。本發(fā)明所述鑒定方法操作簡便快速，在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色準(zhǔn)確性高。通過本發(fā)明所述方法可以在蠶卵階段即可將不具有吐黃色絲結(jié)黃繭的能力的家蠶進(jìn)行區(qū)分，極大的減少了彩色繭品種育種過程中的飼養(yǎng)工作量及飼養(yǎng)成本。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開了ー種在蠶卵期鑒別家蠶吐絲顏色的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)エ藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技木。為了進(jìn)一歩理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I :為了從收集的遺傳資源的4個蛾區(qū)蠶卵中鑒別出具有吐黃色絲的蠶卵蛾區(qū)，本實(shí)施例進(jìn)行了如下的步驟(I)在孵化E6d至E12d的孵化后期，從每個蠶卵蛾區(qū)中各取3_10粒蠶卵，以商用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取蠶卵胚胎的基因組DNA，保存于_80°C備用。(2)以步驟(I)提取的4種家蠶基因組DNA為模板，用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下，每個樣品重復(fù)檢測3次，
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為
IOxtaq bufier(with 1.5mmo!/L Mg2"")2_5‘u'L
dNTP(2.5m mol/L)2 μ L
上游引物(10μηιοΙ/ )\μL
下游引物(10μ θ1/1,:)ΙμΕ
模板(10-30t\g/}.iL)I μιL
Taq 酶(2U/}iL)0.5 μ .加入滅菌蒸餾水補(bǔ)足體系總量25 μ LoPCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 權(quán)利要求
1.一種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的方法，其特征在于， 提取待測家香香卵的基因組DNA,用具有SEQ ID NO :1所不核昔酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷家蠶吐絲顏色； 若同時具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列，則家蠶吐黃色繭絲； 若僅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，則家蠶吐綠色繭絲或者白色繭絲。
2.一種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的試劑盒，其特征在于，包括具有SEQID N0:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
3.—種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的DNA分子組，其特征在于，由具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的DNA分子和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的DNA分子組成。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色的方法。本發(fā)明所述方法利用基因工程技術(shù)提取待測家蠶基因組DNA，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的種類和長度判斷家蠶吐絲顏色。本發(fā)明所述鑒定方法操作簡便快速，在蠶卵期鑒定家蠶吐絲顏色準(zhǔn)確性高。通過本發(fā)明所述方法可以在蠶卵階段將不具有吐黃色絲結(jié)黃繭的能力的家蠶進(jìn)行區(qū)分，極大地減少了育種過程中的飼養(yǎng)工作量及飼養(yǎng)成本。
文檔編號C12N15/11GK102808034SQ20121031248
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者徐世清, 邢瑞, 牛艷山, 司馬楊虎, 陳息林, 殷為民, 袁紅霞 申請人:蘇州大學(xué)