專利名稱：羅氏沼蝦諾蒂病毒的lamp檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶DNA片斷的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)羅氏沼奸諾蒂病毒所用的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
羅氏沼奸諾蒂病毒(Macrobrachiumrosenbergii Nudivirus,MRNuV)是引起羅氏沼蝦幼體變態(tài)障礙綜合癥的主要病原之一，對(duì)羅氏沼蝦育苗產(chǎn)業(yè)危害極大。MRNuV為雙鏈DNA病毒，屬于諾蒂病毒屬，國(guó)際上對(duì)該屬病毒并為明確其科分類地位。該病毒于2010年從患羅氏沼蝦幼體變態(tài)障礙綜合癥的羅氏沼蝦幼體中發(fā)現(xiàn)，其造成羅氏沼蝦在幼體期出現(xiàn)大量死亡，特別是在幼體后期和變態(tài)為仔蝦過(guò)程中尤為嚴(yán)重，死亡率一般為70 80%，嚴(yán)重的達(dá)到90%以上，近2年造成的經(jīng)濟(jì)損失無(wú)法估量。被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因缺少檢測(cè)方法，嚴(yán)重阻礙 了該病毒引起疾病的預(yù)防工作，因此該病毒檢測(cè)試劑盒的開發(fā)和檢測(cè)技術(shù)的研究顯得尤為重要。因此，本發(fā)明米用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒的PIF-2基因，來(lái)檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒，這是目前國(guó)內(nèi)外首次建立的MRNuV檢測(cè)方法。該方法的建立為羅氏沼蝦幼體變態(tài)障礙綜合癥的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法的技術(shù)方案。本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)，敏感性高；本發(fā)明羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)方法利用所述試劑盒檢測(cè)，該方法方便、靈敏、準(zhǔn)確、快速。所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括病毒DNA提取試劑和LAMP反應(yīng)試劑，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)試劑中含有用于檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，該引物組包含弓I物MRNuV-FIP、弓丨物MRNuV-BIP、弓丨物MRNuV_F3、弓丨物MRNuV-B3、引物 MRNuV-LF 和引物 MRNuV-LB ；
所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO 1所示；
所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO 2所示；
所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO 3所示；
所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO 4所示；
所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO 5所示；
所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO 6所示。所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的病毒DNA提取試劑包含以下組分含有5 15 mM Tris,0. 5 I. 5 mM EDTA ,pH 8. 0的TE緩沖液；RNaseA,濃度10 mg/mL ;蛋白酶K溶液,濃度20 mg/mL,pH8. 0 ； Tris飽和酹,pH8. 0 ;乙酸鈉水溶液，濃度3 mol/L ；乙醇，濃度95%。所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)試劑包括以下組分
1)LAMP預(yù)反應(yīng)液20 25mM pH為8. 2 9. O的Tris_HCl、5 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、6 12mM 硫酸按、O. I O. 2% Triton X-100U I. 6 mM dNTP、0. 5 I. O M甜菜堿、1.5 2.2“]\1引物1 很1^-卩1 、1.5 2.24]\1引物1 很1^-81 、0· 15 O. 3μ M引物MRNuV-F3、0. 15 O. 3μΜ 引物 MRNuV-B3、0. 6 I. 2 μ M 引物 MRNuV-LF 和 O. 6 I. 2μ M 弓I物 MRNuV-LB ；
2)聚合酶每微升含8個(gè)活性單位的BstDNA聚合酶； 3)LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液由礦物油或液體石蠟油組成；
4)LAMP反應(yīng)顯色液含有10 % SYBR Green I的熒光染料。所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)的方法，其特征在于包括以下工藝步驟
1)DNA抽提取羅氏沼蝦幼體去眼后的頭胸部或是成蝦鰓組織抽提出待檢測(cè)DNA的數(shù)
目；
2)羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP擴(kuò)增
①根據(jù)待檢測(cè)DNA的數(shù)目，設(shè)置所需LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品數(shù)+2，其中I管為陽(yáng)性對(duì)照，I管為陰性對(duì)照；
②吸取所述的LAMP預(yù)反應(yīng)液的體積為NX23 μ L，加入一潔凈的I. 5mL離心管中，然后加入Νμ L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清之混合液；
③向設(shè)定的N個(gè)LAMP反應(yīng)管數(shù)中分別加入24uL步驟②得到的混合液，得到N個(gè)PCR反應(yīng)管，向上述N個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對(duì)照、待檢DNA模板和陽(yáng)性對(duì)照各 IuL ；
④在上述步驟③得到的反應(yīng)管中再分別加入30uLLAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；
⑤在63°C下恒溫反應(yīng)30分鐘；
3)顯色檢測(cè)
取出經(jīng)步驟2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對(duì)照、待檢樣品和陽(yáng)性對(duì)照的順序依次分別加入I uL LAMP反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化或I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色后進(jìn)行觀察。所述的LAMP檢測(cè)試劑盒還具有陽(yáng)性對(duì)照試樣和陰性對(duì)照試樣，所述陽(yáng)性對(duì)照試樣為含有羅氏沼蝦諾蒂病毒PIF-2基因的質(zhì)顆，所述的陰性對(duì)照試樣為無(wú)核酸去離子水。本發(fā)明所述的引物是根據(jù)在線軟件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/e/)設(shè)計(jì)和手工修改而得,本發(fā)明涉及的六條引物能特異識(shí)別祀序列的八個(gè)不同位點(diǎn)，增加了擴(kuò)增的特異性，并在反應(yīng)中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中羅氏沼蝦諾蒂病毒PIF-2基因序列如SEQ ID NO 7所示，該序列為現(xiàn)有序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)了羅氏沼蝦諾蒂病毒檢測(cè)用引物組，能特異性識(shí)別靶序列上的八個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在BstDNA聚合酶的作用下啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng),在祀標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物，由于LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識(shí)別靶序列六個(gè)結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進(jìn)行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大增強(qiáng)了羅氏沼蝦諾蒂病毒檢測(cè)的特異性；
(2)采用本發(fā)明的引物組對(duì)羅氏沼蝦諾蒂病毒進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)樘禺愋愿?，所以可以根?jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否；
(3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒，檢測(cè)靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需12拷貝；
(4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒不但反應(yīng)條件溫和，且所需儀器簡(jiǎn)單，也不需要特殊試齊U，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)；
(5)本發(fā)明的快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到Ih即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高； (6)本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠；
(7)本發(fā)明的快速診斷試劑盒操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)；
(8)本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過(guò)優(yōu)化的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，不但使得羅氏沼蝦諾蒂病毒定性檢測(cè)更加簡(jiǎn)便快速、特異性高、靈敏度高，而且該試劑盒是檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒的第一個(gè)試劑盒，填補(bǔ)了羅氏沼蝦諾蒂病毒無(wú)檢測(cè)方法的缺口，具有很高的科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I引物特異性測(cè)試 M DL 1000 DNA Marker ； I :羅氏沼蝦諾蒂病毒；2 :正常羅氏沼蝦DNA ； 3 :嗜水氣單胞菌；4 :對(duì)蝦白斑綜合癥病毒；5 :對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒；6 :陰性對(duì)照。圖2靈敏性檢測(cè)M :1000 bp DNA Marker ；1 1. 2X IO4 copies ;2 :1. 2X IO3 copies ；3 I. 2X IO2copies ；4 1. 2X 10 copies ；5 I. 2 copies ;6 :陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。(I) DNA 抽提
取羅氏沼蝦幼體去眼后的頭胸部或是成蝦鰓組織0. I 0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加 400 u L TE 緩沖液(含有 5 15 mM Tris,0. 5 I. 5 mM EDTA，pH 8. 0)和 I y L 濃度為lOmg/mL的RNase A后，繼續(xù)研磨充分后加濃度為20mg/mL、pH值8. 0的蛋白酶K溶液20 ii L，旋渦震蕩I分鐘后，56°C水浴30min，加同體積pH值8. 0的Tris飽和酚，強(qiáng)烈振蕩，IlOOOg離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提；取上清液，加入0. I倍體積的濃度為3mol/L的乙酸鈉，混勻，再加等體積的冰冷乙醇，混勻后低溫靜置10分鐘，15000g離心5分鐘，棄上清，沉淀用70%乙醇洗漆2次,室溫干燥5 IOmin后以30 μ L去離子水重懸。(2)羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP擴(kuò)增
根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)目，設(shè)置所需LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品數(shù)+2，其中I管為陽(yáng)性對(duì)照(含有羅氏沼蝦諾蒂病毒PIF-2基因的質(zhì)粒)，I管為陰性對(duì)照(無(wú)核酸去離子水);吸取LAMP預(yù)反應(yīng)液的體積為NX23 yL，加入一潔凈的I. 5mL離心管中，然后加入N yL每微升含8個(gè)活性單位的Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的N個(gè)反應(yīng)管中分別加入24 u L混合液，并向N個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對(duì)照、待檢DNA模板和陽(yáng)性對(duì)照各IuL;然后在每個(gè)反應(yīng)管中再分別加入30 u L由礦物油或液體石蠟油組成的LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在63°C下恒溫反應(yīng)30分鐘。(3)顯色檢測(cè) 取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對(duì)照、待檢樣品和陽(yáng)性對(duì)照的順序依次分別加入I uL含有10 % SYBR Green I的熒光染料的LAMP反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，綠色為陽(yáng)性，橙色為陰性。也可以用I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結(jié)果在紫外分析儀下觀察，如果發(fā)現(xiàn)有階梯狀的擴(kuò)增特征條帶，說(shuō)明樣品中有羅氏沼蝦諾蒂病毒。上述LAMP預(yù)反應(yīng)液含有20 25mM pH為8. 2 9. O的Tris_HCl、5 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、6 12mM 硫酸按、O. I O. 2% Triton X-100U I. 6 mM dNTP、
O.5 I. O M甜菜堿、I. 5 2. 2yM$*MRNuV-FIP、L5 2.2y]\^|*MRNuV-BIP、0· 15
0.3yM$*MRNuV-F3、0. 15 O. 3 μ M引物MRNuV_B3、0. 6 I. 2 μ M引物MRNuV-LF和 O. 6
1.2 μ M引物MRNuV-LB，其中所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO 1所示；所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO 2所示；所述的引物MRNuV_F3序列如SEQ ID NO 3所示；所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO 4所示；所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO 5所示；所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO 6所示。MRNuV-FIP GTACCGGTAGTATTTTGTGGGATTAGAATTCCGTCATATTTACAGTTAAGGGGT ；
MRNuV-BIP CAAGCCGTTATAGCGGTTGCGAATTCCTTGTCGTACGAAATATCCAA ；
MRNuV-F3 CCGGTAATAATTCGTCTTCG ；
MRNuV-B3 AGCTACGGTTAATAGCGTTA ；
MRNuV-LB GGTTTCTCCACCAAACATAT ；
MRNuV-LF CGCTAACAATGAAGCCGTAG 采用上述快速診斷試劑盒和方法進(jìn)行LAMP檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒特異性和靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如附圖I和2所示。圖I引物種特異性測(cè)試圖，如圖所示，僅羅氏沼蝦諾蒂病毒能擴(kuò)增出階梯狀的擴(kuò)增特征條帶，其它病毒無(wú)階梯狀的擴(kuò)增特征條帶，表明對(duì)其它病毒無(wú)交叉擴(kuò)增性。圖2羅氏沼奸諾蒂病毒靈敏性檢測(cè)圖，如圖所示,經(jīng)Real-time PCR定量后的羅氏沼蝦諾蒂病毒DNA系列稀釋的擴(kuò)增特征條帶顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中加入12個(gè)病毒拷貝的DNA，就能擴(kuò)增出特征條帶。本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒的檢測(cè)方法，在已試驗(yàn)的4種不同的病毒(其中一個(gè)是諾蒂病毒)進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果僅諾蒂病毒檢測(cè)為陽(yáng)性， 其它均為陰性，說(shuō)明該檢測(cè)方法特異性高。
權(quán)利要求
1.羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括病毒DNA提取試劑和LAMP反應(yīng)試劑，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)試劑中含有用于檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，該引物組包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV_F3、引物MRNuV_B3、引物MRNuV-LF 和引物 MRNuV-LB ； 所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO 1所示； 所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO 2所示； 所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO 3所示； 所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO 4所示； 所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO 5所示；所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO 6所示。
2.如權(quán)利要求I所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的病毒DNA提取試劑包含以下組分含有5 15 mM Tris,0. 5 I. 5 mM EDTA ,pH 8. 0的TE緩沖液；RNase A,濃度 10 mg/mL ;蛋白酶K溶液,濃度20 mg/mL, pH8. 0 ； Tris飽和酹，pH8. 0 ；乙酸鈉水溶液，濃度3 mol/L ；乙醇，濃度95%。
3.如權(quán)利要求I所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)試劑包括以下組分 1)LAMP預(yù)反應(yīng)液20 25mM pH為8. 2 9. 0的Tris_HCl、5 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、6 12mM 硫酸按、0. I 0. 2% Triton X-100U I. 6 mM dNTP、0. 5 I. 0 M甜菜堿、I. 5 2. 2iiM 引物 MRNuV-FIP、l. 5 2. 2iiM 引物 MRNuV_BIP、0. 15 0. 3yM 引物MRNuV-F3、0. 15 0. 3 ii M 引物 MRNuV_B3、0. 6 ~ I. 2u M 引物 MRNuV-LF 和 0. 6 I. 2 y M 弓I物 MRNuV-LB ； 2)聚合酶每微升含8個(gè)活性單位的BstDNA聚合酶； 3)LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液由礦物油或液體石蠟油組成； 4)LAMP反應(yīng)顯色液含有10 % SYBR Green I的熒光染料。
4.利用權(quán)利要求3所述的羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)的方法，其特征在于包括以下工藝步驟 1)DNA抽提取羅氏沼蝦幼體去眼后的頭胸部或是成蝦鰓組織抽提出待檢測(cè)DNA的數(shù)目； 2)羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP擴(kuò)增 ①根據(jù)待檢測(cè)DNA的數(shù)目，設(shè)置所需LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品數(shù)+2，其中I管為陽(yáng)性對(duì)照，I管為陰性對(duì)照； ②吸取所述的LAMP預(yù)反應(yīng)液的體積為NX23 u L，加入一潔凈的I. 5mL離心管中，然后加入Ni L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清之混合液； ③向設(shè)定的N個(gè)LAMP反應(yīng)管數(shù)中分別加入24uL步驟②得到的混合液，得到N個(gè)PCR反應(yīng)管，向上述N個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對(duì)照、待檢DNA模板和陽(yáng)性對(duì)照各 IuL ； ④在上述步驟③得到的反應(yīng)管中再分別加入30uLLAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒； ⑤在63°C下恒溫反應(yīng)30分鐘；3)顯色檢測(cè) 取出經(jīng)步驟2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對(duì)照、待檢樣品和陽(yáng)性對(duì)照的順序依次分別加入 I uL LAMP反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化或I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色后進(jìn)行觀察。
全文摘要
羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于靶DNA片斷的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該LAMP檢測(cè)試劑盒包括病毒DNA提取試劑和LAMP反應(yīng)試劑，所述的LAMP反應(yīng)試劑中含有用于檢測(cè)羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，該引物組包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV-F3、引物MRNuV-B3、引物MRNuV-LF和引物MRNuV-LB。發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)，敏感性高；本發(fā)明羅氏沼蝦諾蒂病毒的LAMP檢測(cè)方法利用所述試劑盒檢測(cè)，該方法方便、靈敏、準(zhǔn)確、快速。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102796829SQ20121030457
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者潘曉藝, 沈錦玉, 藺凌云, 姚嘉赟, 徐洋, 袁雪梅, 郝貴杰, 尹文林 申請(qǐng)人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所