專利名稱：一種麻疹病毒RT-tHDA檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種麻疹病毒RT-tHDA檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
麻疹是由麻疹病毒引起的一種以發(fā)熱、呼吸道癥狀與出疹為特征的急性傳染病。自20世紀70年代全球實施擴大免疫規(guī)劃(EPI)以來，全世界麻疹發(fā)病率、死亡率大幅度下降，但目前每年仍出現(xiàn)許多散發(fā)病例，并常常引起局部的流行。按照我國消除麻疹的工作要求，對出現(xiàn)的麻疹病例必須要進行實驗室確認。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種依賴解旋酶恒溫擴增技術快速檢測麻疹病毒核酸的試劑 盒及檢測方法。本發(fā)明采用的技術方案是—種麻疫病毒核酸的逆轉錄依賴耐熱解旋酶恒溫擴增(RT-ThermophilicHelicase-dependent Amplification, RT-tHDA)試劑盒，主要包括主要包括 RT-tHDA 反應試劑和特異性擴增引物，所述特異性擴增引物如下上游引物5，-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’ ;下游引物5’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3 ’。本發(fā)明試劑盒的關鍵在于引物的選擇，RT-tHDA反應試劑為RT-tHDA反應中所用的常規(guī)試劑，如 IsoAmp Enzyme Mix, MgC12, hermoScript Reverse Transcriptase 等,這些組分對于本領域技術人員來說屬于公知常識，可根據(jù)需要自行配制，或者直接購買時候HAD試劑盒,如Biohelix公司的HDA試劑盒等。本發(fā)明還涉及利用所述試劑盒檢測麻疹病毒的方法，所述方法包括(I)提取待測樣品RNA ;所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進行，如采用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它試劑盒,按照試劑盒說明書進行提取。(2)以待測樣品RNA為模板，加入特異性擴增引物和PCR反應試劑，配成RT-tHDA反應體系，進行擴增反應；(3 )對RT-tHDA反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)于I IObp大小的電泳條帶，則待測樣品中含有麻疹病毒；反之則否。本發(fā)明中，所述擴增反應條件為65°C，120min。所述RT-tHDA反應體系終濃度組成如下IOxAnneal ing buffer Ii 5μ MgSO4 [100 (mM)] 1.75μ1 NaCl ( 500mM ) 4μ1 IsoAmp dNTP Solution 3.5μ1 IsoAmp Enzyme Mix 3.5μ 樣品RNA 2μ1
20μΜ上下游引物各0.75μ1Invitrogen 公司耐熱逆轉錄酶 ThermoScript Reverse TranscriptaseO. 5 μ I加水補齊至50 μ I。 目前，實驗室確認麻疹的常用方法，包括血清學檢測與病原學檢測，前者用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測患者血清中的特異性麻疫免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)M，后者則是以分離麻疹病毒和檢測麻疹病毒核酸來進行確認。一般采用病毒分離、逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction, RT-PCR)或熒光定量RT-PCR方法進行核酸檢測，但由于儀器成本較高，使其在基層推廣時受到一定的限制。近年發(fā)展起來的依賴解旋酶的核酸等溫擴增技術[Helicase-dependent Isothermal Deoxyribonucleic Acid(DNA)Amplification,HAD],模擬體內DNA復制的自然過程，使其擴增反應的全過程均在單一溫度下進行，無需專門的擴增儀器，克服了 PCR反應需經歷幾十個溫度變化的循環(huán)過程，特別適合在現(xiàn)場檢測中應用。本發(fā)明自行設計特異性引物，建立了快速檢測麻疹病毒核酸的逆轉錄依賴耐熱解旋酶恒溫擴增(RT-Thermophilic Helicase-dependent Amplification, RT-tHDA)方法,現(xiàn)將結果陳述如下。本申請發(fā)明人從美國的NCBI基因庫上下載了近二十年來世界各地的麻疹病毒核酸序列，對其進行了同源性比較，在麻疹病毒核酸的血凝素基因設計若干對引物，對該區(qū)域進行特異性擴增，從中篩選出最佳的引物，并對RT-tHDA方法進行優(yōu)化，驗證其敏感性、特異性和重復性。經分別對腮腺炎病毒、風疹病毒、呼吸道合胞病毒與疑似患者臨床樣本的檢測比較，該方法具有高特異性，只能檢出麻疹病毒核酸，與其他呼吸道病毒均無交叉反應，而且比常規(guī)RT-PCR法更快速和簡便。用建立的新方法，對近期浙江省疑似麻疹患者21份臨床樣本進行實驗室快速診斷，獲得了令人滿意的結果，為該病及時采取控制措施發(fā)揮了很好的作用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明方法對麻疹病毒的檢測有高度的特異性，與其他呼吸道病毒腮腺炎病毒、風疹病毒、呼吸道合胞病毒等病毒無交叉反應；本發(fā)明方法檢測的靈敏度高，可直接從疑似麻疹患者的含漱液、咽拭子、尿液等標本中檢測麻疹病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右。


圖I. RT-tHDA方法檢測麻疹病毒特異性結果；M :OX174_Hinc II DNAMarker ；1 麻疹疫苗株滬191 ；2 :麻疹流行株浙江/05/08 ；3 :風疹病毒；4 :腮腺炎病毒5. EV71 ；6 :呼吸道合胞病毒。圖2為RT-tHDA方法檢測不同稀釋度麻疹病毒結果；圖3為RT-PCR方法檢測不同稀釋度麻疹病毒；圖2、圖 3 中M ΦΧ174-Η ηο II DNA Marker ；1 的病毒濃度 5. 012X l(T7mol/L ；2 的病毒濃度
5.012Xl(T8mol/L ；3 的病毒濃度 5. 012 X l(T9mol/L ；4 的病毒濃度 5. 012 X l(T10mol/L ；5 的病毒濃度 5. 012X l(Tnmol/L ；6 的病毒濃度 5. 012 X l(T12mol/L。圖4為直接從臨床標本中檢測麻疹病毒的結果； Μ. ΦΧ174-Η ηο II DNA Marker ；1 :陰性對照；2 :麻疹疫苗株滬191 ;3 6熒光定量RT-PCR檢測陽性樣本；7 :熒光定量RT-PCR陰性樣本。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例I :材料與方法I. I實驗病毒株麻疹疫苗株滬191(上海，Shanghai ;S191 )、流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒Jerry Lynn (JL)株,風疫病毒GOS株,呼吸道合胞病毒Long株,分別由上海生物制品 研究所與中國食品藥品檢定研究院提供。麻疹病毒流行株浙江(Zhejiang，ZJ) /05/08，腸道病毒71型(Enterovirus Type71, EV71)株，以及疑似麻疹患者含漱液、咽拭子、尿液等，由浙江省疾病預防控制中心(CDC)病毒所提供。I. 2引物設計對麻疹病毒不同基因型進行比對，選取各基因型病毒血凝素基因的共同保守區(qū)域設計引物，以保證引物的通用性。受DNA解旋酶解鏈能力影響，RT-tHDA產物大小控制在80堿基對(Base Pair, bp) 120bp，引物長度在24bp 30bp，DNA熔解溫度(Melting temperature,Tm)設置在62°C 74°C,胞卩密唳及鳥嘌呤(Guanine and Cytosine,GC)百分比在40% 60%，引物內避免二級結構，引物間與引物內無互補序列，并用基于局部比對算法的搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)對所設計的引物進行特異性確認。根據(jù)以上條件設計一對特異性引物F:5， -AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，;R: 5 ’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3，。擴增片段大小為llObp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成純化。L 3病毒核酸的提取麻疹病毒核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)的提取采用德國Roche公司的核酸提取試劑盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit),根據(jù)試劑盒說明書提取病毒RNA，置于_70°C保存?zhèn)溆?。I. 4RT-tHDA的反應條件RT-tHDA采用Biohelix公司HDA試劑盒并添加耐熱逆轉錄酶進行反應，反應體系50微升(μ 1)，其中IOXAnnealingbuffer ΙΙ5μ I、MgSO4[100毫摩爾(mM)]l. 75 μ I、NaCl (500mM) 4 μ I、IsoAmpdNTP Solution 以及 IsoAmp Enzyme Mix各3·5μ I、樣品RNA2y 1、20μΜ上下游引物各O. 75μ I、Invitrogen公司耐熱逆轉錄酶ThermoScript Reverse TranscriptaseO. 5 μ 1，加 ddw 至 50 μ I。將反應液混勻后，置于650C 120min進行反應后，取5μ I以O. 02克/毫升(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。I. 5 常規(guī) RT-PCR 反應麻疹病毒核酸序列引物 F: 5，-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，;R: 5 ’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3，

擴增片斷l(xiāng)lObp。采用 TAKARA 公司 one step RT-kit (code :DRR024A)，按試劑盒說明書操作，反應體系為25μ 1，其中10父町- 0 緩沖液2.5111，]\%(122.5111 (25mM), dNTP混合物(各 IOmM) 2. 5 μ 1，RNase 抑制劑(40U/μ I) O. 5 μ 1，AMV 酶(5U/μ I) O. 5ul，Taq 酶(5U/y l)0.5ul，上游與下游引物(20μΜ)各 0·5μ 1，模板 RNA2y 1，DEPC 水 4·5μ I。反應條件為 50°C 30min,95°C 3min 進行逆轉錄，然后 95°C 20s, 50°C 25s，72°C 30s 進行擴增，40個循環(huán)后轉入72°C lOmin，取5μ I產物電泳后判斷有無特異性條帶(110bp)。I. 6RT-tHDA特異性、敏感性和重復性試驗分別對麻疹疫苗株滬191、麻疹流行株浙江/05/08、腮腺炎病毒、風疹病毒、EV71、呼吸道合胞病毒提取核酸，用本發(fā)明建立的RT-tHDA方法進行檢測，比較其檢測的特異性。用NanoVue分光光度計測麻疹病毒核酸原液濃度，將核酸原液進行10倍梯度稀釋至10_5，采用相同引物和反應體積，平行進行RT-tHDA和RT-PCR反應，比較兩種核酸擴增方法的敏感性。2 結果2. I特異性試驗結果見圖1，可見，本發(fā)明建立的RT-tHDA方法對麻疹病毒具有較好的特異性，對其他呼吸道病毒如腮腺炎病毒、風疹病毒、呼吸道合胞病毒等無交叉反應。2. 2敏感性試驗用NanoVue分光光度計測麻疹病毒核酸原液濃度，將核酸原液進行10倍梯度稀釋至10_5，采用相同引物和反應體積，平行進行RT-tHDA和RT-PCR反應，比較兩種核酸擴增方法的敏感性，結果見圖2、圖3。結果可見，本發(fā)明建立的RT-tHDA方法對麻疹病毒的敏感性與RT-PCR反應相當，最低檢出濃度均為10-10mol/L。2. 4臨床樣本的檢測從近期浙江省各地麻疹疑似患者的含漱液，咽拭子和尿液共21份臨床樣本中直接提取病毒RNA，用本發(fā)明RT-tHDA和熒光定量RT-PCR方法(見操作I. 5)同時檢測，結果本發(fā)明RT-tHDA方法檢測出麻疹病毒核酸陽性20份，熒光定量RT-PCR法檢測出麻疹核酸陽性20份，本發(fā)明麻疹病毒RT-tHDA方法和熒光RT-PCR方法檢測麻疹病毒的陽性率相當。本發(fā)明麻疹病毒RT-tHDA方法用于臨床樣本檢測的驗證在4個平行實驗室進行，均獲得了滿意的結果，圖4顯示的是臨床樣本的檢測圖譜。
權利要求
1.一種麻疹病毒RT-tHDA檢測試劑盒，主要包括RT-tHDA反應試劑和特異性擴增引物，其特征在于所述特異性擴增引物如下 上游引物5 ’ -AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，; 下游引物5’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。
2.利用權利要求I所述試劑盒檢測麻疹病毒的方法，所述方法包括 (1)提取待測樣品RNA; (2)以待測樣品RNA為模板，加入特異性擴增引物和PCR反應試劑，配成RT-tHDA反應體系，進行擴增反應； (3)對RT-tHDA反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)于IlObp大小的電泳條帶，則待測樣品中含有麻疹病毒；反之則否。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述擴增反應條件為65°C，120min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種麻疹病毒核酸的依賴解旋酶恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒主要包括RT-tHDA反應試劑和特異性擴增引物，所述特異性擴增引物如下上游引物:5’-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’;下游引物:5’-TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。本發(fā)明方法對麻疹病毒的檢測有高度的特異性，與其他呼吸道病毒無交叉反應，且靈敏度高，可直接從疑似麻疹患者的含漱液、咽拭子和尿液等標本中檢測麻疹病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右，非常適用于麻疹病毒感染引起突發(fā)疫情的實驗室早期診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102827949SQ20121029205
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權日2012年8月16日
發(fā)明者盧亦愚, 徐昌平, 馮燕, 馬麗敏, 鐘淑玲 申請人:浙江省疾病預防控制中心